Sumário
extracelular de adenosina 5′-trifosfato (ATP) é uma molécula de sinalização que induz uma variedade de efeitos que vão desde a regulação da proliferação celular a modulação do comportamento das células cancerosas. No cancro colorectal, ATP foi relatado para estimular a proliferação de células epiteliais e, possivelmente, promover a resistência aos tratamentos anti-câncer. No entanto, a função exacta desta molécula de sinalização de perigo em células cancerosas epiteliais intestinais (IECs) em resposta a agentes quimioterapêuticos permanece desconhecida. Para abordar como ATP podem influenciar a resposta de IECs cancerosas a agentes quimioterapêuticos, utilizou-se células Caco-2, que exibem características semelhantes enterócito, para determinar o efeito de ATP na expressão de múltiplas drogas proteína associada a resistência a 2 (MRP2). Gene e expressão de proteína foram determinadas por quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) e Western blotting. A resistência ao etoposido, cisplatina e doxorubicina foi determinada por ensaios de MTT em resposta à estimulação de ATP das células Caco-2 e em células para as quais foi MRP2 expressão sub-regulada por shRNA. ATP aumentou a expressão de MRP2, tanto ao nível de ARNm e de proteína. expressão MRP2 envolveu uma estimulação dependente de ATP da via de sinalização de MEK /ERK que foi associada com um aumento na resistência relativa das células Caco-2 de etoposido. Supressão da expressão de MRP2 usando shRNA reduziu significativamente o efeito protector do MRP2 para etoposido, bem como a cisplatina e doxorrubicina. Este estudo descreve o mecanismo pelo qual o ATP pode contribuir para a quimiorresistência de IECs cancerosas em cancro colo-rectal. Dada a heterogeneidade de respostas de adenocarcinoma colorretal com drogas anti-câncer, esses achados exigem um estudo mais aprofundado para compreender o papel dos receptores P2 na terapia de droga contra o câncer e desenvolver novas terapias destinadas a regular a atividade do receptor P2
Citation.: Vinette V, Placet M, Arguin G, Gendron FP (2015) multirresistência-Associated Protein Expression 2 é regulada pela adenosina 5′-trifosfato em células de câncer colorretal e aumenta a sua sobrevivência a quimioterápicos drogas. PLoS ONE 10 (8): e0136080. doi: 10.1371 /journal.pone.0136080
editor: Hendrik W. van Veen, da Universidade de Cambridge, Reino Unido
Recebido: 25 Março, 2015; Aceito: 29 de julho de 2015; Publicação: 21 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Vinette et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por uma Canadian Institutes of Health Research subvenção de funcionamento (MOP-286567) para FPG F.P.G. é um membro da FRQS-financiados “Centre de Recherche du Centro Hospitalar Universitário de Sherbrooke”
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro colorrectal (CRC) envolve a proliferação anormal das células epiteliais intestinais (IECs) resultantes de alterações genéticas espontâneas ou como o resultado de insultos contínuos como observado em pacientes com doença crónica inflamatória do intestino crónica [1,2]. A progressão de uma lesão neoplásica simples de adenocarcinoma envolve não só factores intrínsecos, tais como a expressão de oncogenes como
c-myc ou a repressão
/mutação de genes supressores, tais como
TP53
,
mas também a participação de uma série de factores reguladores solúveis incluindo citocinas, dos quais o TGF-β é um factor pró-tumorigénico bem documentada [1,3]. Recentemente, adenosina extracelular 5′-trifosfato (ATP) tem sido identificada como uma molécula de sinalização segregada perigo durante a inflamação e no microambiente tumoral para atrair células do sistema imunológico e coordenar as células cancerosas comportamento [4,5]. Na vizinhança do tumor, foi relatado que a concentração de ATP pode atingir 100 mm, o que está muito para além da concentração necessária para activar os receptores de nucleótidos [6,7].
O ATP extracelular é o agonista endógeno do receptor P2X família de canais iónicos dependentes de ligandos e um número limitado de receptores P2Y da subfamília de receptores acoplados à proteína G, ou seja, a P2Y humano
2 e P2Y
11 receptores [8]. Em tumores sólidos, tais como CRC, ATP foi mostrado para reduzir o crescimento de células de câncer de bexiga de alto grau tanto
in vitro
e
in vivo
[9]. Em contextos clínicos, infusões ATP para pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células avançado foram encontrados para melhorar significativamente a qualidade de vida e sobrevida global nesses infusões que receberam
vs
. o placebo coorte [10-12]. No entanto, o impacto de ATP em células cancerosas epiteliais intestinais não é tão claramente definida.
In vitro
, ATP foi relatado para aumentar a proliferação de células Caco-2 através da activação da cascata de sinalização MAPK [13], levando os autores a sugerir que o ATP possa actuar como um mitogénio em IECs cancerosas e, potencialmente, ser envolvido na resistência ao tratamento. Outro estudo relatado que concentrações elevadas de ATP ( 1 mM) suprimiu a proliferação de células Caco-2 [14]. Foi ainda proposto que a imunidade anti-tumoral resultante da quimioterapia pode ser mediada pela libertação de ATP a partir de células tumorais e a activação da família de receptores NOD-like, domínio pyrin contendo 3 inflamassoma (NLRP3) [15], sugerindo, assim, a participação de o receptor purinérgico P2X7 [16,17]. No entanto, juntamente com P2X7 receptores P2Y também têm sido associadas com a promoção do tumor [18,19]. Existe assim uma clara necessidade de clarificar a acção do ATP no CRC.
Há mais de 40 anos, a terapia corrente para CRC sido avançado como a combinação de drogas que danificam o ADN, tais como et opôs ido ou 5-fluorouracil (5 -FU) em combinação com agentes de alquilação cisplatina ou oxaliplatina, bem como a doxorrubicina e seus derivados [20-24]. Embora a maioria dos casos de CRC são etoposídeo resistentes, existem estudos que sugerem que utilizam este inibidor da topoisomerase II em combinação com resveratrol ou FTY720 (fingolimod) para evitar a resistência aos medicamentos [24,25]. No entanto, uma classe particular de proteínas que pertencem à cassete de ligação a ATP (ABC) superfamília podem interferir com a eficácia de tais tratamentos devido à sua capacidade para exportar agentes quimioterapêuticos para fora das células [26]. Os transportadores ABC abranger sete subfamílias (A-G). Família C (ABCC) é composto por 13 membros, dos quais nove foram descritas como proteínas multirresistência-associados (PRM), que incluem MRP2 (ABCC2) [26]. No cancro, a expressão positiva de MRP2 tem sido associada com a agressividade do carcinoma da vesícula biliar e mau prognóstico [27], bem como chemoresistance e mau prognóstico em pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago [28]. Apesar de um aumento na expressão transcrição MRP2 foi medido em tecidos de cancro do cólon, nenhuma correlação foi feito até agora entre os níveis de expressão MRP2 e gravidade da doença ou prognóstico [26]. No entanto, a expressão de MRP2 foi significativamente relacionado com o aumento da resistência à cisplatina, mas não para o 5-FU, sugerindo um papel na resistência do cancro do cólon para fármacos quimioterapêuticos seleccionados [26,29]. Face ao exposto, o propósito do presente estudo foi investigar se a estimulação de células cancerosas epiteliais intestinais por ATP conduz a uma modulação da expressão de MRP2, que postulamos que implicaria um aumento da resistência de células tumorais a certos fármacos quimioterapêuticos e, por conseguinte, ser prejudicial para o tratamento do cancro colo-rectal, aumentando a sobrevivência de células cancerosas.
Materiais e Métodos
Reagentes
meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), penicilina-estreptomicina, HEPES e fetal de soro de bovino (FBS) foram adquiridos à Wisent (St. Bruno, QC, Canadá). GlutaMax foi de Life Technologies (Burlington, ON, Canadá). ATP, suramina e pyridoxalphosphate-6-azofenil-2 ‘, 4’-dissulfónico ácido (PPADS) eram da Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canadá). A MEK1 /2 (UO126), p38 MAPK (SB203580), a PI3K (LY294002) e NF-kB (BAY-11-7082), assim como inibidores de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5 brometo de difenil-2H-tetrazólio (MTT) foram adquiridas de Calbiochem (Mississauga, ON, Canadá). Dimetil sulfóxido (DMSO) foi de Fisher Scientific (Ottawa, ON, Canadá). Os anticorpos policlonais de coelho contra MRP2 e β-tubulina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Pickering, ON, Canadá). IgG peroxidase de rábano (HRP) -conjugated de burro anti-coelho foi de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EUA) e o reagente de ECL da Millipore (Toronto, ON, Canadá). Os medicamentos citotóxicos etoposide, cisplatina e doxorrubicina foram comprados da farmácia quimioterapia na Université de Sherbrooke Hospital Center (Sherbrooke, QC, Canadá).
Cultura de Células
A linha de células de carcinoma do cólon humano Caco -2 (ATCC, HTB37) e embrionário HEK293T linha celular de rim humano (ATCC, CRL-11268) foram cultivadas como anteriormente descrito [30]. inibidores de quinase específicos foram adicionados a meio isento de soro de 30 minutos antes da estimulação de nucleótidos como apresentado nas figuras. Para ensaios de citotoxicidade de droga, as células Caco-2 foram cultivadas em meio DMEM sem vermelho de fenol.
A geração de linhas celulares MRP2 shRNA
As construções 21mer shRNA dirigidos contra MRP2 humana (NM_000392) foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich MISSÃO shRNA (St. Louis, MO). Os lentivírus foram produzidos em células HEK293T e usado para a infecção de células Caco-2 como anteriormente descrito [31]. Para validar a eficiência shRNA, as células Caco-2 foram recolhidas e MRP2 expressão analisados por transferência de Western e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR).
Quantitative real-time PCR
Caco- 2 as células foram estimuladas com 100 uM de ATP para 3 e 6 horas. O ARN total foi isolado a partir de células Caco-2 com Reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN purificado através de transcrição reversa utilizando o sistema Superscript II (Invitrogen Life Technologies, Burlington, ON, Canadá). Cinco por cento do ADNc sintetizado foi usado como um modelo para qRT-PCR utilizando o Brilhante III ultra-rápida QPCR SYBR Green Master Mix (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canadá). Os primers específicos de sequência para
ABCC2
(o humano gene que codifica MRP2) foram 5′- AGAGCTGGC CCTTGTACTCA -3 ‘e 5′-AGGGACAGGAACCAGGAGTT – 3’. a expressão do gene foi normalizado para desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato (
GAPDH
) expressão dos genes conforme relatado anteriormente [32,33].
ensaios de citotoxicidade Drogas
Caco-2 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 7500 células /poço. As células foram cultivadas durante 24 h, após o que o etoposido, cisplatina ou doxorrubicina foi adicionado às cavidades apropriadas em concentrações variadas (10 a 500