Abstract

Pim-1 quinase, uma proteína quinase serina /treonina codificada pelo

pim

proto-oncogene, está envolvida em várias vias de sinalização como a regulamentação da progressão do ciclo celular e apoptose. Muitos tipos de cancro mostram elevados níveis de expressão de quinases Pim e particularmente PIM-1 tem sido associada com a iniciação e progressão do fenótipo maligno. Em vários tecidos de cancro foram identificados somáticas PIM-1 mutantes. Estas variantes naturais são polimorfismos de um único nucleótido, nonsynonymous variações de um único nucleótido que ocorrem na região de codificação e conduzindo a substituições de aminoácidos. Neste estudo, investigou o efeito da substituição de um aminoácido na estabilidade estrutural e sobre a actividade de PIM-1 quinase. Nós expressas e purificadas de alguns dos mutantes de PIM-1-cinase que são expressos em tecidos de cancro e relatadas na base de dados de polimorfismos de um único nucleótido. As mutações pontuais nas variantes afectar significativamente a conformação do estado nativo da PIM-1. Todos os mutantes, expressas como proteínas recombinantes solúveis, mostram uma estabilidade térmica e termodinâmica diminuída e uma menores valores de energia de ativação para a atividade quinase. A estabilidade diminuída acompanhada por um aumento da flexibilidade sugere que a PIM-1 variantes podem ser envolvidos numa rede mais alargada de interacções proteína. Todos os mutantes ligados ATP e ATP inibidores miméticos com valores de IC50 comparáveis ​​sugerindo que os Pim-1 mutantes quinase estudadas podem ser eficientemente alvejado com inibidores desenvolvidos para a proteína de tipo selvagem

Citation:. Lori C, Lantella A, Pasquo A , Alexander LT, Knapp S, Chiaraluce R, et al. (2013) Efeito do único Substituição de Aminoácidos Observado em Câncer em Pim-1 Kinase termodinâmica Estabilidade e Estrutura. PLoS ONE 8 (6): e64824. doi: 10.1371 /journal.pone.0064824

editor: Annalisa Pastore, Instituto Nacional de Pesquisa Médica, Medical Research Council, Londres, Reino Unido

Recebido: 23 Janeiro, 2013; Aceito: 18 de abril de 2013; Publicação: 05 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lori et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Pim-1 quinase pertence a uma família de serina /treonina cinases de proteína (EC 2.7.11.1) que são codificadas pelo

PIM

proto-oncogenes [1] – [3]. PIM-1 lócus foi originalmente identificado como um local de inserção proviral comum em linfomas de células T Moloney da leucemia de murino induzida por vírus em ratinhos [4]. A cinase de proteína codificada está envolvido em várias vias de sinalização, tais como a regulação da progressão do ciclo celular e apoptose. Os três membros da família Pim PIM-1, PIM-2 e pim-3 identificados em seres humanos foram relatados como sinalização de proteina-quinases desempenham um papel importante na biologia do tumor [5], [6]. Além disso, muitos tipos de cancro mostram elevados níveis de expressão de cinases de PIM. Por exemplo PIM-1 e pim-2 foram relatados para ser altamente expresso na leucemia, linfoma, cancro da próstata e mieloma múltiplo e são considerados para ser envolvido na iniciação e progressão do fenótipo maligno [7]. Além disso, a PIM-1 tem sido identificado como um co-factor chave que regula a expressão do factor de transcrição oncogénico c-Myc por fosforilação de serina 10 da histona H3 na região potenciador do locus myc e os seus genes-alvo [8].

p> Expressão do PIM-1 quinase pode ser induzida por uma variedade de factores de crescimento. PIM-1 homeostase é importante para a função celular normal. Pim-1 actividade é, portanto, fortemente regulada em vários níveis, incluindo transcrição, pós-transcricional, translacional e pós-translacional. Diversas vias de transdução de sinal têm sido associadas com a regulação da expressão de PIM-1. Por exemplo Pim-1 expressão é estimulada por activação da via de JAK /STAT que também regula a sua degradação através de loop de feedback negativo. PIM-1 é sobre-expressa em muitas doenças malignas hematológicas e estudos recentes em cinases da família Pim indicam que desempenham papéis importantes também fora do sistema hematopoiético, como nas células de vários tumores sólidos [6]. Notavelmente, em vários tecidos de cancro somáticas PIM-1 mutantes foram identificadas [9] – [12]. Muitas destas variantes são polimorfismos de nucleótidos simples (nonsynonymous nsSNPs), variações de um único nucleótido que ocorrem na região de codificação e que conduzem a uma sequência polipeptídica com substituições de aminoácidos [13]. Importante, após os níveis de proteína PIM-1 de estimulação de factor de crescimento são transiente e a proteína tem uma meia-vida curta em células a ser rapidamente degradados pelo sistema da ubiquitina.

Um número de investigações têm abordado o efeito da proteína em nsSNPs de estabilidade, as interacções proteína-proteína e proteína funciona [14]. Ao mesmo tempo, as variantes naturais têm sido catalogadas com o objectivo de distinguir entre o que ocorre naturalmente diferenças genéticas, presumivelmente sem consequências funcionais (mutações de passageiros), como os recolhidos na base de dados de SNP, e os que estão associados com o desenvolvimento de doenças (mutações condutoras) [15], como o banco de dados OMIM [16], a Human Gene Mutation banco de dados [17], nomeadamente aqueles encontrados para ser associado com câncer (COSMIC) [11].

a análise computacional de mutantes identificados previu que cerca de 30% das variantes de proteína resultante da nsSNPs são menos estáveis ​​do que a variante de tipo selvagem [18] no entanto, uma avaliação experimental da estabilidade das variantes comuns é ainda necessário para determinar o efeito de mutações na estrutura e função das proteínas [19].

neste estudo foram selecionados nsSNPs resultando em Pim-1 variantes que são expressos em tecidos de câncer e relatados na base de dados SNP [9], [11], [20]. Estas variantes de PIM-1 tem sido exaustivamente caracterizada para investigar o efeito da substituição de um único aminoácido em PIM-1 e estabilidade térmica termodinâmico e estrutura em solução. Nosso estudo mostrou que todos os mutantes estudados levar a desestabilização significativa de Pim-1 quinase.

Resultados

Caracterização espectroscópica de Pim-1 Tipo Selvagem e Mutantes Encontrado em cancro

neste estudo foram selecionados quatro mutações (Y53H, E124Q, E135K e E142D) que todos foram detectados no cancro para uma estabilidade detalhada de proteínas e análise estrutural utilizando técnicas espectroscópicas (Fig. 1). Os mutantes estão localizados no domínio catalítico da quinase Pim-1 (Fig. 1A). Y53 é localizado no lóbulo da quinase N-terminal no suporte central β folhas e as suas formas de azoto de amida de uma ligação de hidrogénio com o grupo carbonilo em I66 de cadeia beta 3 (Fig. 1B). O resíduo E124 está localizado na região de charneira da quinase e forma uma ponte salina com R122 (Fig. 1C). A região de charneira é um elemento chave que regula o movimento do lóbulo terminal-C, que pode ser afectada pela mutação E124Q. E135 está localizado na hélice aD formar uma ligação de hidrogénio com que Q127 é provável que seja importante na estabilização desta hélice (Fig. 1C). Finalmente, E142 é um resíduo exposta superfície e a substituição conservadora, com e aspartato não é susceptível de ter um efeito significativo sobre a estabilidade da proteína, a dinâmica ea estrutura

(A) Estrutura de Pim-1 (código PDB:. 1XWS ) mostrado como um diagrama de fita. resíduos mutados são realçados e os principais elementos da estrutura secundária são mostrados. O co-cristalizada inibidor mimética ATP nesta estrutura é mostrada na bola e furar representação. (B) Vista detalhada do ambiente estrutural local ao redor do Y53 resíduo mutado. (C) Vista detalhada do ambiente estrutural local ao redor do E135 resíduo mutado. (D) no UV-próximo espectros de CD foram registrados em uma cuvete de quartzo de 1,0 cm a 1,4 mg /ml de concentração de proteína em 20 mM de Tris /HCl, pH 7,5, contendo NaCl 0,2 M e DTT 2 mM. (E) Os espectros de emissão de fluorescência intrínseca foram registados a 0,04 mg /ml de concentração de proteína (295 nm de comprimento de onda de excitação), a 10 ° C em 20 mM Tris /HCl, pH 7,5, contendo NaCl 0,2 M e 200? M de DTT. (F) Far-UV Os espectros de CD foram registrados em uma cuvete de quartzo de 0,1 cm a 0,2 mg /ml em 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 contendo 0,2 M NaCl e 0,4 mM de DTT.

A espectro de CD no UV-próximo de tipo selvagem Pim-1 mostra a contribuição espectral de todos os resíduos aromáticos e é caracterizada por duas fortes picos negativos centrados em 290 nm e em 269 nm, acompanhadas de características de estrutura fina a 275-280 nm (Fig. 1D) . O mutante E124Q exibe um espectro de CD no UV-próximo estreitamente semelhante ao do tipo selvagem, excepto para uma ligeira diminuição da estrutura fina de 275-280 nm. E142D exibe um espectro de CD no UV-próximo surpreendentemente que difere do espectro de tipo selvagem na região de 275-280 nm. O espectro de CD no UV-próximo de Y53H é dramaticamente diferente do espectro de tipo selvagem e os outros mutantes: a estrutura fina de 275-280 nm é perdida, a contribuição a 290 nm é significativamente reduzida e a elipticidade negativo em torno de 269 nm é marcadamente alterados. E135K espectro de CD no UV-próximo de Y53H que se assemelha com uma redução acentuada da actividade dicróico na região de 290-275 nm, e com uma contribuição positiva na região abaixo de 275 nm. Os espectros de emissão de fluorescência de tipo selvagem e mutantes estão todas centradas no mesmo comprimento de onda máximo de emissão em torno de 345 nm diferenças e mostra em intensidades de fluorescência de emissão (Fig. 1e). Far-UV Os espectros de CD de todos os mutantes são virtualmente sobreponíveis com a de PIM-1 de tipo selvagem e típica de uma proteína alfa e beta, que mostra um mínimo local em torno de 208 nm, um a 200 nm intercepção no zero e um rácio entre o 208 1,52 /222 bandas (Fig. 1F).

dependência da temperatura kinase atividade

a dependência da temperatura da actividade da quinase de Pim-1 de tipo selvagem e seus mutantes foi examinado na faixa de temperatura de 10- 42 ° C (Fig. 2A). As temperaturas óptimas para a catálise, na concentração de ATP constante, foram estimadas como sendo a 37 ° C para o tipo selvagem e E142D, em torno de 35 ° C durante E124Q e Y53H, e em cerca de 30 ° C durante E135K (Tabela 1 e Fig. 2A). Notavelmente, a actividade de quinase a 37 ° C de todos os mutantes de PIM-1 é significativamente reduzida e corresponde a 57, 37, 16 e 3% de que a proteína de tipo selvagem para E142D, E124Q, Y53H e E135K, respectivamente. A energia de activação,

E

a

‡, determinada pela equação de Arrhenius (1) na gama de temperaturas entre 10 ° C e a temperatura óptima de cada proteína é menor do que a do selvagem tipo (Tabela 1 e Fig. 2B). Este resultado sugere um aumento da flexibilidade de todas as variantes em comparação com a de tipo selvagem, particularmente evidente para E135K. A comparação da dependência da temperatura da actividade de quinase com o desdobramento térmico estrutural monitorizada a 209 nm (Fig. 3A) indica claramente que todas as variantes são significativamente menos térmico resistente e mais flexível do que o tipo selvagem.

(A) dependência da temperatura da actividade de quinase de PIM-1 de tipo selvagem e mutantes. (B) o ajuste não linear da dependência da temperatura da actividade de quinase para a equação de Arrhenius (Eq. 1); A inserção mostra o gráfico de Arrhenius linear para os mesmos dados. Os ensaios foram realizados sob as condições descritas em Materiais e Métodos, utilizando a enzima de 2,7 uM.

(A), Pim-1 de tipo selvagem e mutantes foram aquecidos desde 10 ° C a 72 ° C em um 0,1- cm cuvete de quartzo de 0,2 mg /ml em 20 mM Tris /HCl, pH 7,5, contendo NaCl 0,2 M e DTT 0,4 mM. A actividade dicróico em 209 nm foi monitorizada continuamente a cada 0,5 ° C. (B) Primeiro derivado dos mesmos dados como em (A). (C) Os dados PMTV registrados nos mesmos experimentos mostrados em (A).

térmica Unfolding

A estabilidade térmica de Y53H, E124Q, E135K e E142D foi investigada por monitorar continuamente as mudanças elipticidade a 209 nm na gama de temperaturas entre 10 e 72 ° C. Dados de mutantes foram comparadas com a da proteína de tipo selvagem (Fig. 3A). O parâmetro escolhido para comparar as curvas de transição de PIM-1 do tipo selvagem e os mutantes é a temperatura de fusão (T

m) definida como o ponto médio do processo de desnaturação, como calculado pela representação gráfica da primeira derivada dos valores de elipticidade molar como um função da temperatura (Fig. 3B). As mudanças ellipticidade induzida pela temperatura a 209 nm, onde foi observada a amplitude principal, ocorrem em uma transição cooperativa aparente para E124Q e E142D, com T

valores m de 40,0 para E124Q e 44,0 ° C para E142D. Para E135K a transição parece menos cooperativa com uma T

valor m de 45,0 ° C e não houve acumulação detectável de desdobramento intermediário (s), o que sugere que a substituição de E135 com um resíduo de lisina pode induzir desdobramento um local parcial e /ou que esta variante pode existir como uma população heterogénea de estados cruzados. Para o tipo selvagem e Y53H, as aparentes transições térmicas de três estados sugerem a acumulação de desdobramento intermediários com dois T

valores m. A primeira transição ocorre com T

m valores de (T

m1) em 40,5 e 40,0 ° C, o segundo (T

m2) a 54,0, 52,0 ° C para o tipo selvagem e Y53H, respectivamente (Tabela 2 ). As alterações elipticidade induzida pela temperatura para o tipo selvagem e os mutantes são coincidentes com o aumento induzido pelo calor da tensão de tubo fotomultiplicador (PMTV) acima de 370 V (Fig. 3C), sugerindo que o desdobramento induzida pela temperatura é acompanhada por proteínas de agregação [ ,,,0],21]. Agregação ocorreu também quando varreduras térmicas foram realizadas a uma taxa de aquecimento inferior com uma mudança da aparente T

m para reduzir temperaturas; as diferenças entre a aparente t

m de tipo selvagem e variantes foram os mesmos que os medidos em maior taxa de aquecimento (dados não apresentados). As transições observadas são irreversíveis, como indicado pelos espectros medidos no fim da fase de arrefecimento, que diferem dos das proteínas nativas medidos no início das transições térmicas. Além disso, o controlo da cuvete no fim da fase de arrefecimento, revelou a presença de uma grande quantidade de precipitado em todas as amostras.

Efeitos de PIM-1 mutações na quantidade de ATP e a ligação do inibidor

As mutações identificadas no cancro são uma causa frequente de resistência aos medicamentos. Estávamos, portanto, interessado em saber se inibidor de ligação seriam afetados pelas mutações estudadas. Para atender a essa nós analisamos vários inibidores conhecidos Pim-1 do betacarbolina e imidazopyridazole classe [22], [23] por ensaios de mudança de temperatura [24]. O rastreio contra uma série de derivados de inibidores não revelou diferenças significativas nos valores da mudança de temperatura, sugerindo que todos os mutantes ligam-se com estes inibidores da constante de ligação semelhante (Tabela S1 e S2 Tabela). Para confirmar isto medimos dados cinéticos da enzima em um subconjunto de inibidores. Os valores de IC50 de inibidores da PIM-1 K00487, e K018444a K00207a foram 0,048, 0,010 e 0,007 mM, respectivamente, para PIM-1 de tipo selvagem. Estes valores foram muito semelhantes para as variantes de PIM-1, com a excepção de os valores de IC50 para K00487 e K00207a que eram de 1,8 e 1,4 vezes maior de Y53H. Concluímos, portanto, que inibidor específico de ligação não é significativamente afectada pelas mutações estudadas.

Equilibrium induzida por ureia Unfolding Transitions

Pim-1 do tipo selvagem e variantes reversível desdobrar-se em ureia a 10 ° C em TrisHCl a 20 mM, pH 7,5, contendo 200 ^ M de ditiotreitol (DTT) e 0,2 M de NaCl. O efeito de concentrações crescentes de ureia (0-8 M) sobre a estrutura de PIM-1 mutantes foi analisada por CD no UV distante e espectroscopia de fluorescência e comparado com o efeito exercido sobre o tipo selvagem. A intensidade de emissão de fluorescência intrínseca a 345 nm de PIM-1 do tipo selvagem e variantes de alterações após 30 minutos de incubação a 10 ° C, um tempo suficiente para atingir o equilíbrio (Fig. 4). A trama das mudanças de intensidade de fluorescência relativa em comparação com o aumento da concentração desnaturante mostra perfis complexos para o tipo selvagem e todos os mutantes (Fig. 4), sugerindo um processo de desdobramento não de dois Estados e da população de intermediário desnaturação (s). A complexidade dos perfis de desdobramento pode ser atribuída à arquitectura de multi-domínio de PIM-1, que contém resíduos de triptofano em ambos os lóbulos N-terminais e C-terminais da proteína. No final da transição, acima de 7 M de ureia, a intensidade de emissão de fluorescência intrínseca a 345 nm é reduzida de cerca de 1,3 vezes (Fig. 4) e as mudanças de comprimento de onda de emissão de fluorescência máxima para cerca de 357 nm, quer para o tipo selvagem e todas as variantes (dados não mostrados). As mesmas amostras utilizadas para monitorar as alterações de emissão de fluorescência (Fig. 4), durante o desdobramento de transição foram utilizados para monitorizar tanto por UV dicroísmo circular elipticidade (Fig. 5) para permitir uma comparação directa com os dados de fluorescência. As mudanças induzidas pela ureia em 222 nm elipticidade de todos os mutantes são semelhantes ao do tipo selvagem, mostram uma dependência da concentração sigmoidal ureia e seguir uma transição de dois estados, sem qualquer aparente detectável intermédia (Fig. 5). O processo de desdobramento é totalmente reversível após a diluição do desnaturante, quer para o tipo selvagem ou para todos os mutantes (Fig. 5), com valores médios de transição entre 4,23 e 5,34 M de ureia (Tabela 2). A Tabela 2 mostra os valores dos parâmetros termodinâmicos obtidos para o tipo selvagem e formas mutantes de PIM-1 a partir dos dados de CD de transição far-UV. PIM-1 de tipo selvagem é significativamente mais estável do que todas as variantes, como indicado pela comparação do Δ

G

valores que no caso de E135K é cerca de 3,5 vezes mais baixa do que a do tipo selvagem (Tabela 2) . A diminuição do Δ

G

podem ser referidos principalmente às menores

valores m

observadas para todas as variantes com relação ao tipo selvagem. Estes resultados indicam que a variação do solvente área de superfície exposta mediante desdobramento é menor para todas as variantes de PIM-1 do que para a proteína de tipo selvagem. Nomeadamente, os valores

m

determinados para PIM-1 de tipo selvagem e suas variantes (Tabela 2) são de cinco vezes menor do que o previsto para uma proteína monomérica de 272 resíduos de aminoácidos desdobrado em ureia [25]. Os baixos valores de

m

pode estar relacionada ao equilíbrio multi-estado de desdobramento, em linha com os resultados obtidos monitorando o processo de desdobramento de intensidade de emissão de fluorescência intrínseca (Fig. 4).

relativa Normalizada intensidades de fluorescência a 345 nm; as linhas contínuas representam o ajuste de regressão não-linear da intensidade de fluorescência relativa a 345 nm em eqn. 5 calculado como descrito em Materiais e Métodos. Os pontos de reversibilidade são mostrados como círculos vazios e não foram incluídos na análise de regressão não-linear. Todos os espectros foram registados a 10 ° C como descrito em Materiais e Métodos. (A-C) A fração do nativo (

f

N), primeiro intermediário (

f

I1), segundo intermediário (

f

I2) e desdobrado (

f

U) estados, calculados como descrito em Materiais e Métodos usando os parâmetros termodinâmicos obtidos a partir dos acessos de equilíbrio desdobramento transições para Eqn. 5, são mostradas para o tipo selvagem (A), E124Q (verde) (B) e E135K (rosa) (C).

elipticidade molar a 222 nm ([Θ]

222 ) relataram após a remoção do ruído de alta frequência e o erro aleatório de baixa frequência por SVD. As linhas contínuas são a regressão não linear para a Eq. 3 dos dados em concentrações variando desnaturantes, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os pontos de reversibilidade (símbolos vazios) são mostrados, por motivos de clareza, apenas para o tipo selvagem e não foram incluídos na análise de regressão não-linear. Todos os espectros foram registados a 10 ° C como descrito em Materiais e Métodos.

O desdobramento transições monitorados por mudanças na intensidade de fluorescência relativa (fig. 4) foram analisados ​​utilizando um modelo de transição de quatro estado induzida por ureia para equação 5, conforme relatado em Materiais e Métodos. Os parâmetros termodinâmicos relativos ao processo de desdobramento estão apresentados na Tabela 3. Os dados indicam que a primeira transição do estado nativo (N) para o primeiro intermediário (I

1) ocorre para PIM-1 de tipo selvagem e todos os mutantes abaixo de 1 M de ureia com um Δ maior

G

valor para E124Q e uma Δ inferior

G

valor para E135K. A segunda transição da sub I

1 para o segundo intermediário (I

2) ocorre num intervalo de concentração de ureia muito semelhantes para todos os PIM-1 mutantes analisados ​​e a Δ

L

valores para e E142D Y53H sugerem uma estabilização do intermediário para estas duas variantes (Tabela 3). O Δ

L

valor relativo à última transição para o estado desnaturado (L) é significativamente maior para o tipo selvagem em comparação com as variantes. Em linha com os resultados obtidos a partir de medida-CD no UV transições sigmoidal (Tabela 2), a soma de o Δ

G

valores para os três transições é maior para o tipo selvagem, em comparação com os outros mutantes, com a excepção de E142D cujo

L

tot Δ é semelhante ao do tipo selvagem. Nomeadamente a Δ

G

tot de E135K é significativamente menor do que a de todas as outras variantes. A discrepância entre os parâmetros termodinâmicos obtidos pela extrema-UV CD e intensidade de fluorescência apoia fortemente a presença de intermediários que se desdobram. A falta de um intermediário detectável por CD de UV distante pode indicar que os estados intermédios detectados por fluorescência representam mudanças conformacionais que ocorrem na proximidade de qualquer um dos resíduos de triptofano, com arranjos alternativos terciárias. Está bem estabelecido que a intensidade de fluorescência é extremamente sensível ao meio ambiente de um fluoróforo e é considerado como um dos sinais mais directos que podem ser usados ​​para monitorizar termodinâmica das transições desdobramento [26]. Para avaliar a acumulação fraccionada dos diferentes espécies cima induzida por ureia desdobramento, a distribuição de equilíbrio de quatro espécies, N, I

1, I

2 e U como uma função da concentração do desnaturante pode ser reconstituído usando o equipada valores de Δ

G

1, Δ

G

2, Δ

G

3,

m

1,

m

2 e

m

3 apresentados na Tabela 3. A distribuição de equilíbrio de N, I

1, I

2 e U é semelhante à do tipo selvagem (Fig. 4A) e todas as variantes, no entanto, algumas diferenças pode ser observado (Fig. 4B-C). A fracção de N (

f

N) é aumentada para E124Q (Fig. 4B) e significativamente menor para E135K (Fig. 4C), e semelhante à do tipo selvagem (Fig. 4A ) para todas as outras variantes de PIM-1 (dados não mostrados). A fração de I

1 (

f

I1), que se acumula em ureia 1,0 M para todas as espécies, é um pouco maior para E135K e menor para E124Q. A distribuição fracionada do segundo desnaturação intermediário I

2 (

f

I2), que se acumula em cerca de 4,0 M de ureia, parece modestamente aumentado para Y53H, E124Q e E135K, em comparação com o tipo selvagem (dados não mostrados). Nomeadamente, para o tipo selvagem e todas as variantes dos intermediários que se desenrolam I

1 mostram o mesmo comprimento de onda de emissão máxima de N centrada a cerca de 345 nm, enquanto a de I

2 é deslocado para cerca de 348 nm. A análise detalhada do PIM-1 transições desdobramento sugere que diferenças significativas na plasticidade domínio e desdobramentos ocorrem em PIM-1 mutantes quando comparado com a proteína do tipo selvagem.

Discussão

Este estudo representa, a nosso conhecimento, o primeiro espectroscópica e caracterização termodinâmica de quinase humana Pim-1 e alguns de seus doença mutantes relevantes encontrados em câncer. Investigou-se o efeito da substituição de um aminoácido na estabilidade térmica e termodinâmica do tipo selvagem PIM-1 e comparação destes resultados com quatro variantes de PIM-1, Y53H, E124Q, E135K e E142D, relatadas na base de dados de SNP [9] – [12] , [15], [20]. O exame da estrutura cristalina Pim-1 mostrou que a maioria das mutações estão localizadas perto de elementos estruturais importantes para a função da cinase e que forma interacções polares com resíduos vizinhos.

As mutações pontuais nas variantes afectar significativamente a conformação da nativo estado de Pim-1. As diferenças de CD no UV-próximo entre mutantes e do tipo selvagem sugerem que os contatos terciários são significativamente alterados para todos os mutantes e que a única substituição de aminoácido afeta Pim-1 estrutura terciária e levar a mudanças profundas na dobra geral terciária da proteína. Em particular, a substituição de histidina com Y53 leva a alterações dramáticas estrutura terciária, como revelado a partir da perda da estrutura fina a 260-280 nm (Fig. 1D). O lobo N-terminal Y53H mutante exibe as mudanças mais significativas nos contactos terciários, como julgado com base no espectro de CD no UV-próximo. Notavelmente, o espectro de CD no UV-próximo do mutante E124Q aparece mais semelhante ao do tipo selvagem, provavelmente porque a mudança de um resíduo Glu polar carregada no resíduo Gln polar não carregado tem apenas um efeito menor sobre a estrutura terciária e a sua estabilidade .

o resíduo Tyr53 é colocado no meio da cadeia beta-2 e a sua azoto amida é a carbonil I66 em beta-strand 3. em Y53H, a substituição de uma histidina Y53 com polar pode ligado por hidrogénio levar a uma nova ligação de hidrogênio com H68 (Fig. 1). Além disso, a proximidade de Y53 para ligação fosfato-P-circuito, de uma região, que desempenha um papel importante na especificidade e afinidade de inibidores de [27], sugere que a mutação deste resíduo pode influenciar a ligação do inibidor.

a outra mutação encontrados no cancro, E124Q, diz respeito a um resíduo localizado na região de charneira (121-126). O OE2 de E124 forma uma ponte salina com o H11 do vizinho R122 (Fig. 1). A substituição de glutamina por E124 (E124Q) destrói a ponte salina na região de charneira que pode determinar a mobilidade do (128-305) lóbulos N-terminal (33-121) e C-terminal. Nomeadamente, uma vez que os lóbulos frequentemente perto ou girar em torno da charneira em cima inibidores de ligação a mutação de E124 altera significativamente as propriedades dinâmicas da PIM-1 e podem ser alterados inibidores de afinidade. Curiosamente, esta ponte sal glutamato-arginina não está presente na isoforma Pim-2 possivelmente contribuir para a inferior estabilidade desta proteína [28].

A reversibilidade da ureia equilíbrio induzido desdobramento, a baixa temperatura permite uma quantitativa determinação do efeito das mutações sobre a termodinâmica da PIM-1 desdobramento. Todos os mutantes, expressos como proteínas recombinantes solúveis, mostram uma estabilidade térmica e termodinâmico diminuiu (Tabela 2 e 3). O efeito desestabilizador de todas as substituições de aminoácidos é particularmente evidente a partir da diminuição da temperatura de fusão monitorizada por alterações da estrutura secundária, que sugere uma maior flexibilidade das variantes no que diz respeito ao tipo selvagem. A diminuição da temperatura de fusão de todos os PIM-1 variantes estudadas é acompanhada por uma diminuição significativa na Δ

L

H

2

ó em relação ao induzida por ureia em comparação com desdobramento o tipo selvagem. Estes resultados são surpreendentes uma vez que todos os mutantes são menos estáveis ​​do que o tipo selvagem e pim-1 é um proto-oncogene, assim, pode-se concluir que a PIM-1 variantes são menos eficientes como oncogenes que o tipo selvagem. No entanto, a estabilidade diminuição é acompanhada por um aumento da flexibilidade, tal como é indicado pelos valores de energia de activação mais baixos para a actividade da cinase observada em todas as variantes em comparação com a do tipo selvagem, sugerindo que a PIM-1 variantes podem ser envolvidos numa rede mais alargada de interacções proteína

Nomeadamente, os pontos médios de transição para as mudanças espectrais de todos os mutantes não se alteraram significativamente em relação ao tipo selvagem.; portanto, a redução de Δ

G

H

2

O valor é principalmente devido a uma diminuição na

valores m

. Assim, o efeito da substituição de um aminoácido na estabilidade PIM-1 podem ser referidos, principalmente, a uma diminuição da variação do solvente área de superfície exposta mediante desdobramento para todas as variantes de PIM-1.

Em conclusão os nossos resultados indicam que o efeito da mutação observada em tecidos de cancro são dirigidos a alterações locais da estrutura terciária que, contudo, não afectou a ligação de inibidores de quinase do tipo I estudados.

Materiais e Métodos

a mutagénese dirigida ao local

Pim-1 do tipo selvagem plasmídeo enzima foi obtido por SGC (Oxford). Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) foi usado para introduzir as mutações individuais no tipo plasmídeo Pim1 selvagem usado como modelo. Os oligonucleótidos mutagénicos utilizados são listados na Tabela 4.

Protein Expression and Purification

recombinante proteína PIM-1 foi expressa e purificada tal como descrito em [29], com modificações menores. Pim-1

tipo selvagem e mutantes foram expressos em

E. coli

estirpe BL21 (DE3). 10 ml da cultura durante a noite foi crescida a 37 ° C em 1 L de meio LB contendo ampicilina como antibiótico a uma concentração final de 50 ug /ml até a densidade óptica OD

600 atingiu 0,6. A cultura foi arrefecida em gelo durante 20 min, em seguida, a expressão da proteína foi induzida durante a noite pela adição de 0,5 mM de isopropil-β-D-tiogalactósido (Sigma-Aldrich) e crescidas durante a noite a 15 ° C com agitação enérgica. A cultura foi colhida por centrifugação e ressuspensas em 50 ml de tampão de ligação (Hepes 50 mM, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM, 5% de glicerol, pH 7,5) contendo 0,5 mM de

tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), e armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. As células foram descongeladas em gelo suplementado com inibidores de protease (Completo, Roche) e rebentadas por sonicação. O ligado foi clarificado por centrifugação e o sobrenadante foi carregado numa coluna de DE52 (GE Healthcare), equilibrada previamente com tampão de ligação e TCEP 0,5 mM, para remover os ácidos nucleicos. O efluente foi carregado numa Ni-NTA (Ni

2 + – nitriltriacetate) coluna de afinidade (GE Healthcare) pré-equilibrada com tampão de ligação. A coluna foi lavada com tampão de ligação para eluir os contaminantes fracamente ligados. A proteína recombinante foi eluída por passagem através da coluna de ligação soluções tampão contendo concentrações crescentes de imidazole (50 mM, 100 mM, 150 mM e 250 mM, respectivamente). Os eluatos foram recolhidos suplementado com uma concentração final de DTT 10 mM e testado quanto à pureza em gel de SDS usando o sistema de gel de precasted (Invitrogen). As fracções puras foram incubadas durante a noite com o tabaco etch vírus da protease (Pro-TEV), para remover a marca de hexa-histidina. Após a digestão, a proteína foi concentrada para 2 ml, utilizando concentradores Millipore e carregou-se numa coluna Superdex 200 300/10 no sistema de filtração em gel FPLC AKTA previamente equilibrada com Tris /HCl 50 mM, NaCl 0,25 M, DTT a 10 mM, pH 7,5 a um taxa de 1,0 mL /min de fluxo. Fracções de 2 mL foram recolhidas e a proteína puro foi identificado por SDS-PAGE. A concentração de proteína foi determinada espectrofotometricamente utilizando uma absortividade molar de 48930 M

-.

1 cm

-1at 280 nm com base em uma massa molecular de 35,685 kDa

espectroscópica