Abstract

Cdc7-Dbf4 quinase ou DDK (Dbf4-dependentes quinase) é necessário para iniciar a replicação do ADN por fosforilação e activação da helicase de ADN Mcm2-7 replicativo. DDK é sobre-expressa em muitas células tumorais e é um alvo quimioterapêutico emergente vez que a inibição DDK causa apoptose de diversos tipos de células cancerígenas, mas não de células normais. PHA-767491 e XL413 estão entre uma série de inibidores potentes do DDK com baixa nanomolares IC

50 valores contra a quinase purificada. Embora XL413 é altamente selectivo para DDK, a sua actividade não foi extensivamente caracterizado em linhas celulares. Nós medimos efeitos anti-proliferativos e apoptóticos de XL413 em um painel de linhas celulares tumorais em comparação com PHA-767491, cuja actividade está bem caracterizada. Ambos os compostos foram inibidores eficazes DDK bioquímicos mas, surpreendentemente, a sua actividade em linhas celulares eram altamente divergentes. Ao contrário de PHA-767491, XL413 tinha actividade anti-proliferativa significativa contra apenas uma das dez linhas celulares testadas. Desde XL413 não efetivamente inibir DDK em várias linhas de células, este composto provavelmente tem biodisponibilidade limitada. Para identificar potenciais clientes em potencial para os inibidores adicionais DDK, também testamos a reactividade cruzada de -400 inibidores da quinase conhecidos contra DDK usando um teste de desvio de estabilidade térmica DDK (TSA). Foram identificados 11 compostos que significativamente estabilizados DDK. Vários inibida DDK com potência comparável à PHA-767491, incluindo Chk1 e os inibidores da quinase PKR, mas tinha andaimes químicas divergentes de inibidores DDK conhecidos. Tomados em conjunto, estes dados mostram que vários inibidores de quinase conhecidos reagem de forma cruzada com DDK e também realçar a oportunidade para conceber inibidores específicos adicionais, biologicamente activos DDK para utilização como agentes quimioterapêuticos

citação:. Sasi NK, Tiwari K, Limitado FF, Bonte D, Wang T, Melcher K, et al. (2014) A Potent Cdc7-Dbf4 (DDK) Kinase Inhibitor XL413 tem uma actividade limitada em muitos linhas celulares de cancro e de descoberta de potenciais novos DDK Inhibitor Scaffolds. PLoS ONE 9 (11): e113300. doi: 10.1371 /journal.pone.0113300

editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de Junho, 2014; Aceito: 23 de outubro de 2014; Publicação: 20 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sasi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Van Andel Institute (KM HEX MW) e os Institutos Nacionais de Saúde (R01-DK071662 HEX). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Nenhum dos autores tem qualquer relação com o Dr. Tong Wang ou a empresa Translational Drogas Development, Inc. que não seja através de ajuda imaginação do Dr. Wang e coordenar a síntese dos dois compostos os autores utilizados no estudo, para o qual ele é co-autor sobre este manuscrito. Também não há restrições sobre o compartilhamento de dados ou materiais.

Introdução

O início da replicação do ADN é temporariamente dividido em duas fases durante o ciclo celular. Em primeiro lugar, uma forma inativa da MCM replicativo (manutenção mini-cromossoma) helicase é carregado no DNA origem na fase G1 e depois activado a entrada e durante a fase S por dois conjuntos de quinases: ciclina dependente de quinase e quinase Dbf4-dependente ( DDK) [1]. DDK é uma subunidade de dois Ser /Thr quinase composta da quinase Cdc7 e subunidades reguladoras dbf4. DDK fosforilação mediada da helicase de seis subunidade Mcm2-7 (MCM) é pensado para provocar uma mudança conformacional na sua estrutura conduzindo à activação da helicase [2], [3]. activação MCM é seguido de ADN localizada desenrolamento, o recrutamento das máquinas replissoma e a iniciação da síntese de ADN bidireccional [1]. Outras funções do DDK incluir a facilitação da segregação cromossômica na mitose e meiose [4], [5], o início de recombinação meiótica [6], [7], e ativação de vias de reparo de DNA incluindo-lesão trans reparação do ADN [8], [9].

atividade Cdc7 quinase depende associação com a subunidade reguladora, Dbf4 [10], [11]. Dbf4 é uma proteína regulada ciclo celular cuja abundância picos durante a fase S e, em seguida, é degradada pela extremidade da mitose [12] – [14]. Interacção com Dbf4 é necessário para a ligação Cdc7 ATP e reconhecimento do substrato [15]. Como todas as proteína-quinases, a estrutura de cristal DDK revela um local activo de uma fenda profunda entre a N- e C-terminais lóbulos [16], [17]. O Zn-Dbf4 dedo ( “motivo C”) liga-se ao lóbulo do terminal N de DDK e é necessária para a actividade DDK humano, mas não é essencial para a actividade ou brotamento DDK cinase de fissão de levedura [18] – [20]. Dbf4 motivo M aumenta a sua associação com a subunidade Cdc7 e é necessária para a plena actividade da quinase em levedura e seres humanos [16], [18], [19], [21]. DDK fosforila várias subunidades da helicase MCM [22] – [24]. E um estudo recente em brotamento levedura indica que Cdc7 e Dbf4 interagir fisicamente com subunidades distintas do Mcm2-7 complexo [25]

DDK é sobre-expressa em vários tumores primários e linhas celulares de tumores [26] – [32]. DDK sobre a expressão também tem sido associada com mau prognóstico no câncer de mama [33], estádio clínico avançado no carcinoma do ovário [34], e com o fenótipo agressivo em carcinomas papilares [35]. Regulando os níveis de DDK em células tumorais é uma estratégia terapêutica atractiva do tumor. Utilizando anticorpos neutralizantes, Hunter e colegas foram os primeiros a mostrar que a depleção DDK leva a grave ruptura da replicação do ADN em células HeLa [10]. Usando pequenos ARN interferentes, Santocanale e colegas mostraram ainda que a depleção DDK levou a apoptose independente de p53 em células de HeLa ao passo que uma linha de células de fibroblasto dérmico humano normal foram submetidos a uma paragem do ciclo celular reversível [36]. As células HeLa foram incapazes de prender na zona de transição de fase G1-S, progredindo através de uma fase S letal resultando em morte celular via apoptose. Esta descoberta foi confirmada em um número de diferentes linhagens de células [37] – [39]. Importante, a morte de células tumorais induzida por depleção de DDK não é acompanhada pela indução de marcadores de ponto de verificação conhecidos. respostas celulares semelhantes são vistos após esgotamento de outros componentes da maquinaria de replicação de iniciação, incluindo as Cdc6, Cdc45 e MCM2 subunidades [40], [41]. A morte específica de células de tumor observado pelo esgotamento dos DDK tem despertado interesse como alvo farmacêutica para a terapia do cancro. Os esforços das várias empresas farmacêuticas têm levado a uma série de inibidores de pequenas moléculas DDK (Figura 1).

O primeiro inibidor DDK bem caracterizada era uma molécula pirrolopiridinona (PHA-767491, Figura 1) [42 ], [43]. É um inibidor potente DDK com um IC

50 de 10 nm, utilizando quinase purificada. PHA-767491 é também um inibidor do crescimento celular eficaz, com uma IC50 média = 3,14 uM entre 61 linhas celulares de tumores [43]. PHA-767491 inibe também purificada CDK9 com um IC

50 de 34 nm, mas é um inibidor muito menos potente de muitas outras quinases testado [43]. Assim o PHA-767491 é um inibidor duplo DDK /CDK9. Estudos recentes têm sugerido que a inibição de CDK9, uma quinase que tem como alvo de ARN polimerase II, pode aumentar a resposta apoptótica induzida por PHA-767491 em algumas linhas de células [43] – [45]. Modificações deste composto levou à identificação de vários outros inibidores potentes da DDK com alguma selectividade superior, exibindo sensibilidade e [46] – [48]. XL413, um inibidor DDK estruturalmente distinta, é um composto à base benzofuropyrimidinone com uma IC relatado

50 de 3,4 nM contra DDK purificado e inibe a célula-proliferação de Colo-205 células com um IC

50 de 2,69 mM [49] . Foi também altamente selectivos para DDK quando testado contra um painel de quinases 100 [49].

O aumento da actividade e selectividade dos XL413 sobre PHA-767491 foi racionalizada por a estrutura de cristal de DDK em complexo com os dois DDK inibidores [16]. Uma razão XL413 pode ser um inibidor mais específico é que ele fez contactos com três dos resíduos mais variantes no local activo de quinase quando comparada com PHA-767491, que interagiram com dois desses resíduos. Foi portanto inesperado verificar que XL413 não era um inibidor do crescimento celular particularmente potente, na maioria das linhas celulares testadas, desde Cdc7 é essencial para a progressão do ciclo celular. XL413 inibiu a proliferação e a apoptose induzida em células Colo-205, como mostrado anteriormente [49], mas tinha uma actividade limitada em 9 de outras linhas celulares tumorais testadas. Embora ambos os compostos são inibidores DDK bioquímicas comparáveis, PHA-767491 exibiu actividade superior à XL413 em linhas celulares. A análise dos níveis de fosforilação específicos DDK-MCM2 XL413 sugere que pode ter pouca biodisponibilidade nestes e outras linhas celulares de cancro. Para ajudar no desenvolvimento de inibidores adicionais DDK, foi testado se os inibidores de quinase proteína conhecida (isto é, aqueles que não estão concebidas para inibir a DDK) apresentaram reacção cruzada com DDK. Foram triados -400 compostos usando um teste de desvio de estabilidade térmica (TSA) e identificou 12 moléculas que transferiram a estabilidade térmica de vários DDK, com andaimes químicas diferentes e com potência aproximadamente equivalente como PHA-767491. Estes compostos são, portanto, pouco provável que seja altamente específico para um único alvo. Nossos dados destacam a oportunidade de projetar inibidores específicos adicionais, biologicamente ativos DDK para uso como agentes quimioterapêuticos.

Materiais e Métodos

Síntese de PHA-767491 e XL413

O DDK inibidores de PHA-767491, e XL413, foram sintetizados como descrito anteriormente [42], [49]. A análise por HPLC e espectrometria de massa foram realizados em ambos os compostos, o que confirmou a massa molecular correcto e um elevado grau de pureza ( 99%) tanto para

As linhas celulares

células HeLa (ATCC. ) foram cultivadas em MEM suplementado com sais de Earle, glutamina 2 mM, 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (HI FBS), 1,5 g de bicarbonato /L de sódio, mM de aminoácidos não essenciais 0,1, piruvato de sódio 1 mM, 50 unidades /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina. As células MDA-MB-453 (ATCC) foram cultivadas em DMEM suplementado com 4,5 g /L de D-glucose, 4 mM de L-glutamina, 110 mg /l de piruvato de sódio, 10% de HI de FBS, 50 unidades /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina. HCC1954 (ATCC), HCC1187 (ATCC), BT-549 (NCI-60), MCF-7 (NCI-60), e Colo-205 (NCI-60), as células foram todos cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de HI FBS, 50 unidades /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina. HCT-116 do p53

+ /+ e p53

– /- linhas de células foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 10% de FBS HI, 50 unidades /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina. Todas as células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2 numa incubadora humidificada.

DDK indução proteína

pKT37 é um pETDuet-1 (Novagen) que co–vector expressa His6-Smt3-HsCdc7 (códon otimizado, Genescript) e resíduos DBF4 341-674, que contém motivos M e C necessários para ligar e activar Cdc7.

E. coli BL21-

RIPL foi transformada com pKT37 e uma nova colónia foi crescida durante a noite em meio LB contendo 150 ug /ml de ampicilina, 50 ug /ml de cloranfenicol e 1% de glucose. Dois litros de LB contendo 150 ug /ml de ampicilina e 50 ug /ml de cloranfenicol foram inoculados com ~ 60 ml da cultura durante a noite para dar um OD

600 de 0,1. A cultura foi cultivada até uma densidade óptica

600 de 0,8 e depois induzidas durante 6 horas com IPTG 0,5 mM, a 25 ° C. O sedimento celular foi suspenso em 20 ml de Ni-NTA de tampão A (20 mM de HEPES-NaOH (pH 7,4), NaCl 250 mM, glicerol a 10%) com o cocktail inibidor de protease 1X (Roche) e 1 mM de β-mercaptoetanol. Um micro-fluidificador foi usada para lisar as células, seguido por uma centrifugação de 30 minutos (12.000 rpm, rotor F13) a 4 ° C.

DDK purificação

DDK foi purificado passo a passo utilizando níquel -NTA, SP fast Flow, e S-200 colunas. O ligado celular contendo imidazole 35 mM foi aplicada a uma 25 ml de coluna de Ni-NTA, lavada com 20 volumes de coluna, e em seguida eluiu-se com um gradiente de imidazole de 250 ml 35 mM-150 mM. fracções de proteínas de imidazole (DDK ~115 mm) foram reunidas e dialisadas durante a noite a 4 ° C contra 20 mM de HEPES-NaOH, pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol a 10% sem imidazol. O dialisado foi então passado sobre três colunas 5 ml de SP Fast Flow (ligado em paralelo), lavou-se e eluiu-se com um gradiente de 0,5 mM-100 mL 100 M de NaCl. fracções de proteína DDK (~ 0,2 M) foram reunidas, MgCl

2 foi adicionado à proteína reunidas para quelar EDTA, e incubadas com PP2C (6His-GST-Hab1) fosfatase utilizando uma quantidade equivalente miligrama de proteína total na piscina , e 1/100 quantidade equivalente miligrama de Ulp1 protease para clivar a etiqueta His6-Smt3 (Sumo) a 16 ° C durante a noite. DDK foi analisado em 15% de gel SDS para verificar o grau de clivagem e a desfosforilação de Sumo (que foi geralmente superior a 95%). O conjunto de proteínas foi carregado numa segunda coluna de Ni-NTA (sem imidazol) e fluir através fracções contendo DDK foram reunidas, EDTA a 1 mM foi adicionado ao quelato livre Ni

++, e dialisadas durante a noite a 4 ° C contra 20 mM de HEPES (pH 7,4), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM. A proteína foi concentrada utilizando 30,000 MWCO rotação concentrador (Amicon Ultra, Millipore), a 4 ° C até um volume final de 10 ml. proteína concentrada foi carregada em uma 300 ml de S-200 da coluna de exclusão em gel (Amersham-Pharmacia). HsCdc7-Dbf4 eluída a ~ 150 kDa, perto do valor de dímero de 110 kDa. O rendimento total foi tipicamente de 6 a 8 mg.

In vitro

ensaios de activação da quinase

20 ng de DDK humana purificada foi pré-incubadas com concentrações crescentes de cada inibidor DDK para 5 min. Em seguida, 10 ^ Ci (γ) –

32P ATP e 1,5 uM de ATP frio foram adicionados num tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 7,5), 10 mM de MgCl

2, e DTT 1 mM e incubou-se durante 30 min a 30 ° C. As proteínas foram desnaturadas em 1X tampão de Laemmli a 100 ° C, seguida por SDS-PAGE e auto-radiografia em filme HyBlot CL (Denville Scientific, Inc.). Auto-fosforilação de DDK foi utilizada como um indicador da sua actividade de cinase. bandas

32 P-rotulados foram quantificados utilizando ImageJ eo IC

50 valores foram calculados utilizando GraphPad (Prism 6).

Análise da viabilidade celular

Para os ensaios em placas de 96 poços 2500 células foram plaqueadas por cavidade. Após 24 horas, as células foram tratadas com inibidores de moléculas pequenas e incubadas durante 72 horas a 37 ° C. Subsequentemente, as células foram lisadas e o teor de ATP foi medido como um indicador de células metabolicamente activas usando o ensaio CellTiter-Glo (Promega). IC

50 valores foram calculados usando o software GraphPad. Para os ensaios em placas de seis poços, 100000 células foram plaqueadas por cavidade. Após 24 horas, as células foram tratadas com inibidores de moléculas pequenas e incubadas por diferentes pontos de tempo. As células foram tripsinizadas e foi feita uma suspensão em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato. 30 ul desta suspensão foi misturada com 30 ul de reagente CellTiter-Glo, seguido por uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida utilizando EnVision 2104 Multilabel Reader (Perkin Elmer) e BioTek Synergy Neo leitor de microplacas.

Análise de Caspase 3/7 actividade

5.000 células por poço foram plaqueadas numa placa de 96 poços. Após 24 horas, as células foram tratadas com inibidores de moléculas pequenas e incubadas durante 24 horas a 37 ° C. Caspase 3/7 actividade e número de células viáveis ​​foram então medidas utilizando o ensaio de caspase-3/7 Glo (Promega) e o ensaio CellTiter-Glo (Promega), respectivamente. A “atividade Caspase por célula” foi obtido através da normalização actividade total Caspase ao número de células.

Análise Immunoblot

Os extractos celulares totais foram preparados por re-suspensão dos peletes em tampão RIPA (NaCl 150 mM , 1% de inibidores da protease contendo (100 PMSF uM, Benzamida 1 mM, 2,5 ug de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 50 mM Tris HCl, pH 8) /mL de pepstatina A, 10 ug /ml de leupeptina, e inibidores de 10? g /ml de aprotinina) e fosfatase (1 mM de cada um de NaF, Na

3VO

4 e Na

4P

2O

7). A concentração de proteínas foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce), de acordo com o protocolo do fabricante. Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Millipore). eficiência da transferência e da igualdade de carregamento foi confirmada por Ponceau S coloração. Após tratamentos com anticorpos primários e secundários, as proteínas foram visualizadas utilizando soluções SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). Os anticorpos anti-MCM2 e anti-S53-fosfo-MCM2 foram adquiridos a partir de Bethyl Laboratories; anti-β-actina foi de Sigma; anti-rato e anticorpos HRP anti-coelho eram da GE Healthcare; e anticorpos anti-anti-Cdc7 e dbf4 foram descritos anteriormente [26].

Estabilidade térmica tecla Shift Assay (TSA)

Todas as reacções foram incubadas num volume final de 10 ul e ensaiadas em 96- bem usando placas de 20 x SYPRO Orange (Invitrogen) e 200 ug /ml DDK purificada [50]. As reacções foram incubadas com compostos inibidores em gelo durante 30 minutos. Os compostos de quatro bibliotecas inibidor de cinase (Calbiochem I, II, III, Tocriscreen Inibidor Toolbox) foram rastreados a 20 uM para o t

m aumenta com uma concentração total de DMSO de 2% ou menos. experiências de fusão térmico foram efectuados utilizando o Real-Time PCR System StepOnePlus (Applied Biosystems) derreter programa de curva com uma velocidade de rampa de 1 ° C e gama de temperatura de 15 ° C a 85 ° C. CPSTs subsequentes sobre os 12 batidas obtidas foram realizadas como acima, mas em triplicado e usando uma gama de 200 vezes de concentrações de inibidor. A análise dos dados foi realizada como descrito [50]. As temperaturas de fusão (T

M) foram calculados por ajustamento da curva sigmoidal de fusão com a equação de Boltzmann utilizando o GraphPad Prism, com R

2 valores de 0,99. A diferença de T

valores M calculado para reações com e sem compostos é AT

m.

Resultados

DDK inibidores exibem muito diferentes potências celulares

conferido um painel de linhas celulares de cancro da mama 15 para a expressão e Cdc7 Dbf4, utilizando anticorpos monoclonais contra cada subunidade [26]. A maioria destes expressar as subunidades DDK equivalente a ou maior do que MCF10A, um imortalizados mas não-tumorigénico linha celular epitelial mamaria que serviu como um controlo não-tumoral (Figura 2). Utilizou-se o PHA-767491 e XL413 para inibir DDK num painel de linhas celulares de cancro da mama que sobre-expressam seis DDK a vários níveis (marcados com asteriscos na Figura 2). Ambos os compostos foram referidos como tendo actividades anti-prolif erativas na gama micromolar baixa [43], [49]. Como controlos, foram comparados estes resultados com PHA-767491 tratamento de células HeLa e XL413 tratamento de células Colo-205, que inibem DDK e induzir a morte celular. Desde Cdc7 quinase é uma proteína essencial, inibindo a sua actividade deverá proliferação celular significativamente lenta ou parada. PHA-767491 inibiu significativamente a proliferação de todas as linhas celulares testadas (Figura 3A, os valores são representados graficamente em relação aos controlos de veículo). PHA-767491 era mais eficaz sobre as linhas de células HeLa e HCC1187 e teve o menor efeito sobre a MCF-7 [43] e as linhas celulares de MDA-MB-453: 2-vezes e de 2,5 vezes inibido, respectivamente. Em contraste, foi XL413 anti-proliferativa apenas nas células Colo-205 (Figura 3A).

Imunotransferência mostrando os níveis de expressão de Cdc7 Dbf4 e em linhas celulares de tumor. β-actina níveis indicam o carregamento igual de proteínas.

Oito linhas de células de tumor (A) foram tratadas com 5 uM de cada inibidor de DDC e a viabilidade das células foi medida 72 horas após a adição da droga. Para determinar o IC

50 valores, HCC1954 células foram tratadas com concentrações crescentes de PHA-767491 ou XL413 (B) e a viabilidade celular foi medida 72 horas após a adição da droga. células Colo-205 foram tratadas com concentrações crescentes de PHA-767491 ou XL413 (D) e a viabilidade celular foi medida 72 horas após a adição da droga. A extensão da apoptose induzida pelos compostos em cada linha de células em relação ao controlo de veículo foi medido por actividade da caspase 3/7 e está indicada em (C, E). Todos os dados representam a média de pelo menos três medições separadas +/- SD e foram altamente reprodutível em dias separados.

Em seguida, examinaram os perfis de potência de ambos os compostos em mais detalhes usando o sensível ao XL413 ( Colo-205) e (HCC1954) linhas celulares resistentes XL413. As células foram incubadas na presença de concentrações crescentes de inibidores durante 72 horas a 37 ° C, seguido por meio de medições de viabilidade celular. PHA-767491 inibiu a proliferação em ambas as linhas celulares com um IC

50 de 0,64 jiM em HCC1954 células e 1,3 uM em células Colo-205 (Figura 3, B e D), de acordo com a média 3,17 uM IC

50 valor calculado utilizando um painel de 61 linhas celulares de tumores [43]. Em contraste, XL413 tinha um IC

50 de 22,9 uM em células HCC1954 e 1,1 uM em células Colo-205 (Figura 3, B e D). Em correspondência com os dados de viabilidade, PHA-767491 induziu apoptose em ambas as células HCC1954 e Colo-205, mas XL413 induzida apoptose apenas em células Colo-205 (Figura 2, C e E). XL413 não era um inibidor específico de linhas de tumor colorectal porque tinha efeitos limitados sobre duas linhas de células de tumor colo-rectal adicionais: XL413 tinham 40 a 60 vezes superior IC

50 valores diferentes de PHA-767491 nestas linhas (Figura S1 no ficheiro S1).

PHA-767491 e Xl413 são inibidores potentes DDK

in vitro

o pobre potência de XL413 na maioria das linhas de células tumorais pode ser porque o composto sintetizado não é um inibidor de quinase eficaz. Para testar esta possibilidade, que purificado DDK recombinante e, em seguida, medido o IC

50 valores de ambos XL413 e PHA-767491 em quinase purificada. Nós co-expressa His6-SUMO-Cdc7 e Dbf4 em células bacterianas e, em seguida, purificado o complexo conforme descrito em Materiais e Métodos. Resumidamente, DDK foi ligado a uma coluna de Ni-NTA seguido de eluição e a remoção da etiqueta de His6-SUMO. Untagged DDK foi então fraccionado numa coluna Fast Flow SP seguido por separação numa coluna de filtração em gel S-200. Os ensaios de quinase foram efectuados com DDK purificado (Figura 4A) na presença de concentrações crescentes de cada inibidor (Figura 4, B e C). Ambos PHA-767491 e XL413 foram inibidores eficazes DDK

in vitro

como mostrado anteriormente [16], [42], [49] com IC

50 valores de 18,6 nM e 22,7 nM, respectivamente. Uma vez que ambos os compostos são inibidores eficazes DDK, os perfis de viabilidade celular relativas indicam que XL413 é deficiente em agindo sobre o seu alvo no interior da célula.

(A) em gel de Coommassie-coradas mostrando uma ug DDK purificada a partir de células bacterianas. (Γ) –

32P ATP DDK ensaios de quinase em presença de concentrações crescentes de PHA-767491 (B) ou XL413 (C). actividades de quinase representam a média de quatro medições independentes +/- SD em dias separados.

XL413 está com defeito na inibição da fosforilação Mcm2 DDK-dependente em HCC1954 células

captação celular eficaz da inibidor DDK deve comprometer a atividade DDK

in vivo

. Entre os muitos alvos de DDK são componentes da helicase Mcm2-7 replicativo. Serina 53 da subunidade Mcm2 é um site-alvo bem caracterizado para a fosforilação DDK mediada [24]. Nós quantificados os níveis de fosforilação neste site como uma medida da atividade DDK

in vivo

. HCC1954 células foram incubadas na presença de 1 uM de PHA-767491, 2 uM de PHA-767491 ou 5 uM XL413. As células foram então colhidas a 0, 24, 48, e 72 horas após a adição do fármaco para medir as células viáveis ​​e fosforilação Mcm2 por imunotransferência.

2 uM de PHA-767491 completamente abolida Mcm2 fosforilação por 24 horas em HCC1954 células (Figura 5A), correspondente com o seu efeito sobre o crescimento celular e viabilidade (Figura 5B). Na mesma linha celular, 1 uM de PHA-767491 resultou em muito pouca fosforilação Mcm2 residual a partir de 24 a 72 horas e foi também eficaz na inibição da viabilidade celular e induzir a morte celular. Em contraste, XL413 não inibiu a fosforilação Mcm2 às 24 horas, mesmo a uma concentração mais elevada de 5 uM (Figura 5A) e houve apenas uma modesta redução da fosforilação Mcm2 às 72 horas. Este efeito também foi observado no ensaio de viabilidade celular, em que as células tratadas XL413 cresceu apenas ligeiramente mais pobre do que os tratados com veículo células (Figura 5B).

(A) mostrando immunoblots Mcm2 fosforilação em células HCC1954 ou (C) Colo -205 células na presença de DMSO, PHA-767491, ou XL413. perfil (B) A proliferação celular de células ou células HCC1954 (D) Colo-205 na presença de DMSO, PHA-767491, ou XL413. Os dados de viabilidade celular representam a média de pelo menos duas medições +/- SD e foram altamente reprodutíveis em dias diferentes.

Uma vez que ambos os compostos foram inibidores eficazes nas células Colo-205, examinámos Mcm2 fosforilação nestas células após a adição da droga. Novamente, 5 uM de PHA-767491 aboliu completamente a fosforilação Mcm2 por 24 horas e foi muito eficaz na indução de morte celular (Figura 5, C e D). No entanto, ao contrário de HCC1954 células, XL413 era um inibidor muito eficaz da actividade DDK em células Colo-205. 5 uM de XL413 aboliu completamente a fosforilação Mcm2 às 24 horas e também foi tão eficaz como o PHA-767491 na indução de morte celular (Figura 5, C e D). Estes resultados mostram que os dois DDK inibidores exibem perfis muito diferentes em linhas de células, apesar do fato de que ambos os compostos são inibidores de quinase altamente eficazes

in vitro

. Nossos dados sugerem que XL413 não é absorvido de forma eficaz em muitas linhas celulares ou é metabolizada rapidamente ou modificado para uma forma inativa.

tela para determinar a reactividade cruzada dos inibidores da quinase conhecidos com DDK

Para identificar estruturas químicas adicionais que são capazes de inibir DDK, testou-se um painel de -400 inibidores de quinase contra DDK purificada num ensaio de estabilidade térmica deslocamento (TSA) [50]. Neste ensaio, os compostos inibidores foram incubados com DDK purificado e, em seguida, rastreados com um gradiente de aumento de temperatura para determinar o ponto em que eles desnaturar (em relação à DDK sozinho) seguindo alterações de fluorescência do corante SYPRO Orange, que se liga a superfícies hidrófobas em desdobrado proteínas. Inibidor de compostos que se ligam no interior da bolsa de ligação de ATP DDK são previstos para estabilizar a quinase, e AT

valores de m (ver Materiais e Métodos) de 2 ° C ou superior são considerados sucessos importantes. Os resultados experimentais de tela de 400 compostos estão listadas na Figura S2 em S1 Arquivo. Foram identificados 12 compostos que causaram mudanças significativas de temperatura:. 11 compostos aumentaram o T

m, e 1 composto (genisteína) reduziu a T

m (Tabela S1 S1 Arquivo)

Para estimar o afinidade de cada composto para DDK medimos AT

m valores para estes 12 compostos através de uma gama de 200 vezes de concentrações de inibidor e compararam estes valores para PHA-767491 (um inibidor de DDK específica), estaurosporina (um inibidor de largo espectro da proteína cinase ), e DMSO como um controlo do veículo. Os dados apresentados na Figura 6 representam uma média de três medidas independentes. A genisteína composto, que é um inibidor EGFR, foi incomum, pois aumentou AT

m com menor inibidor de concentrações e, em seguida, diminuiu AT

m em 5, 10 e 20 mM concentrações. A tela inicial foi realizada com 20 uM de inibidor e explica por que a genisteína foi pontuada como diminuir a T

m. Talvez este composto se liga ao DDK ATP bolsa de ligação, mas em concentrações mais elevadas interrompe a ligação Cdc7-Dbf4. Cada um dos outros 11 compostos tem positivas AT

ms. O exame das titulações de compostos que revela três inibidores tinham perfis comparáveis ​​aos PHA-767491 na medida em que induziu uma AT

M de ~ 2 ou mais início a uma concentração de 1 uM: um inibidor da Rho cinase (Rockout), uma proteína quinase R (PKR) inibidor, e um inibidor da cinase Chk1 (SB218078). Quatro compostos adicionais, o inibidor de JAK3 VI, PI3-Ka inibidor VIII, UCN-01, K-252a e deu a 3 vezes ou superior AT

m a 5, 10 e 20 uM concentrações.

concentrações de 12 compostos de vida descoberto em uma tela de 400 composto (Tabela S1 no arquivo S1), aumentando foram rastreados contra DDK purificada usando o TSA. PHA-767491 (inibidor específico DDK), estaurosporina (largo espectro de inibidor de cinase) e DMSO são mostradas como controlos. Os dados representam a média de medições em triplicado +/- SEM.

As estruturas dos compostos de topo na tela de TSA são mostrados na Figura 7, revelando uma ampla gama de classes estruturais. K-252a é de ocorrência natural alcalóide relacionado com estaurosporina que inibe uma larga variedade de proteínas quinases, incluindo quinases serina /treonina e tirosina quinases da família de Trk [51], [52]. Assim, a inclusão de K-252a nesta lista (como estaurosporina) talvez não seja surpreendente. Uma vez que é muito provável que os inibidores que recuperados na tela de TSA estabilizar DDK pela sua capacidade para se ligarem na bolsa de ligação do ATP e inibir DDK, foram realizados ensaios de cinase utilizando os seis primeiros compostos. Os ensaios de quinase revelaram que eles são, de facto inibidores DDK (Figura S3 no arquivo S1). O Chk1 (SB218078) e os inibidores da PKR foram os melhores compostos

in vitro

e inibiu DDK com IC

50 de 19,3 nM e 67,5 nM, respectivamente (Figura 8A e Figura S3 em S1 Arquivo). Curiosamente, os sub AT

m perfis dos inibidores de Chk1 e PKR olhar notavelmente como PHA-767491, levantando a possibilidade de que estes compostos inibem DDK em células. Embora SB218078 é derivado de estaurosporina, é um potente inibidor de Chk1 [53]. As estruturas das outras visitas de topo, o inibidor de PKR e Rockout, não são derivados de estaurosporina e também diferem dos inibidores conhecidos DDK (Figura 1).

As estruturas dos compostos 7 a partir de topo da titulação de inibidor são TSA mostrados juntamente com PHA-767491 e XL413 estruturas para comparação (ver texto e Tabela S1 no arquivo S1 para mais detalhes). Três compostos são derivados de estaurosporina (linha de baixo) mas os quatro compostos remanescentes caem em classes estruturais distintas.

CI

50 valores para o inibidor de PKR (mostrado na Figura 7) foram determinados contra purificada DDK (A) e células HCC1954 (B). (C) Caspase 3/7 ensaios que mostram que a apoptose foi induzida fortemente às 24 horas após a adição de inibidor de PKR e isso foi eliminada usando o inibidor da pan-caspase z-VAD. O inibidor de PKR provoca uma diminuição semelhante da viabilidade em células HCC1954 para PHA-767491 ao longo do tempo (D) e também inibe a fosforilação Mcm2 nas células, um alvo conhecido DDK (E). As medições em painéis A-D representam as médias de pelo menos duas medições +/- SD e foram altamente reprodutível.

Nós testamos se os inibidores da PKR e Chk1 alteraria o crescimento celular e inibir Mcm2 fosforilação em a linha celular de cancro da mama HCC1954, o que seria uma forte evidência de que eles inibem DDK em células. quantidades crescentes do inibidor de PKR foram incubadas com células HCC1954 mais de 72 horas, o que resultou num grande diminuição do número de células viáveis ​​em relação ao veículo de controlo (Figura 8B, IC

50 de 1,7? M).