Abstract

Fundo

TNFAIP2

é um gene essencial envolvido em apoptose. polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em seus locais de ligação de miRNA poderiam modular funções dos genes miRNA-alvo e, assim, o risco de câncer. Neste estudo, nós investigamos associações entre SNPs potencialmente funcionais no miRNA locais da 3’UTR do

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eo risco de câncer gástrico em uma população dos EUA.

Métodos de ligação

Foi realizado um estudo de 301 pacientes com câncer gástrico e 313 controles sem câncer por idade, sexo e etnia pareados por freqüência de caso-controle. Foram genotipados quatro selecionados

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SNPs (rs8126 T C, rs710100 G A, rs1052912 G A e rs1052823 G T). E usou a análise de regressão logística para avaliar as associações desses SNPs com o risco de câncer

resultados

O genótipo rs8126 CC foi associado com um risco significativamente elevado de câncer gástrico (OR ajustado = 2,00, 95% CI = 1,09-3,64 e

P

= 0,024) , em comparação com os genótipos + TC rs8126 TT combinados, particularmente em bebedores atuais. No entanto, nenhum outro

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SNPs foi associado com risco de câncer gástrico.

Conclusões

Nossos dados sugerem que o

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miRNA ligação rs8126 local T C SNP pode ser um marcador para a susceptibilidade ao câncer gástrico, e este achado requer uma validação adicional por estudos maiores

Citation: Xu Y, Ma H, Yu H, Liu Z, Wang LE, Tan D,. et ai. (2013) O rs8126 Encadernação-Site miR-184 T C Polimorfismo em

TNFAIP2

está associada a risco de câncer gástrico. PLoS ONE 8 (5): e64973. doi: 10.1371 /journal.pone.0064973

editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de julho de 2012; Aceito: 23 de abril de 2013; Publicado em: 28 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concede R01 CA131274 e R01 ES011740 (Q. Wei) e CA016672 P30 (The University of Texas MD Anderson Cancer Center). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Prof Qingyi Wei da M.D. Anderson Houston, Texas, é um editor para PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer gástrico é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, embora tanto a sua incidência e mortalidade têm vindo a diminuir na última década [1]. Em 2010, havia cerca de 21.000 pacientes recém-diagnosticados e 10,570 mortes da doença nos Estados Unidos [2]. Estudos epidemiológicos sugerem que fatores ambientais, incluindo dieta rica em alimentos salgados e nitrados, tabagismo, consumo alcoólicas e, especialmente,

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) infecção, são fatores importantes para a etiologia de cancro gástrico [3]. No entanto, apenas uma fração das pessoas que adotam estilos de vida semelhantes ou expostos aos mesmos fatores de risco ambientais, eventualmente desenvolveram câncer gástrico, sugerindo que hospedam ou fatores genéticos também podem desempenhar um papel na etiologia da doença [4].

Entre todas as alterações fisiopatológicas causadas por vários factores etiológicos relacionados com cancros gástricos, a indução de lesões oxidativas do ADN em células epiteliais do estômago foi demonstrado ser uma forte ligação a carcinogénese [5], [6]. Para evitar um crescimento celular descontrolado resultante deste tipo de danos no ADN, alguns mecanismos de controlo do ciclo celular deve ser iniciado para impedir a ocorrência de mutações ou para iniciar a apoptose das células com esmagadora danos no ADN.

(MicroRNAs miARNs), uma classe de ARN regulador endógeno e pequena não-codificante, regulam negativamente a expressão do gene ao nível pós-transcricional através de hibridação com sequências complementares na região 3 ‘não traduzida (3’UTR) dos ARN alvo mensageiro (ARNm) [ ,,,0],7], [8], [9], [10]. Estudos recentes demonstraram efeitos significativos de miARNs em vários processos biológicos, incluindo a diferenciação celular, proliferação, progressão do ciclo celular, bem como a apoptose. expressões alterados de miARN, bem como as suas funções potenciais de oncogenes supressores de tumores e foram demonstradas em vários tipos de cancro, incluindo o cancro gástrico [11], [12]. Enquanto isso, várias variantes genéticas relativamente comuns, como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), foram identificados como biomarcadores para a susceptibilidade genética ao câncer em estudos epidemiológicos moleculares. Devido aos seus efeitos potenciais sobre a expressão de miARN e subsequente impacto na transcrição de ARNm, miARN SNP ou SNPs relacionados com miARN, tais como aqueles localizados nos locais de ligação de miARN na região 3 ‘não traduzida (UTR) dos seus genes-alvo, têm sido implicados como fatores genéticos cruciais na susceptibilidade a vários tipos de câncer. Desde seus papéis na etiologia do câncer ainda não está claro, é importante compreender significado funcional e evolutiva desses SNPs miRNA-relacionados através de seus efeitos sobre o risco de câncer e sua interação com fatores de risco ambientais na etiologia do câncer gástrico [13].

a pertença à família SEC6, a proteína induzida por α de necrose tumoral 2 (TNFAIP2, também conhecida como B94 ou EXOC3L3), que é uma espécie de proteína pro-apoptótica, foi originalmente identificado como um gene cuja expressão pode ser induzida por o factor de necrose tumoral alfa (TNFa) em células endoteliais da veia umbilical [14].

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está localizado no cromossoma 14q32 e codifica uma proteína de 654 resíduos de aminoácidos com um peso molecular aparente de 73 kDa. Composta por 11 exons e 10 introns,

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se estende por cerca de 13,45 kb de DNA genómico [15]. Na base de dados dbSNP (https://egp.gs.washington.edu/), este gene é relatado para ter 180 SNPs, dos quais 15 SNPs na 3’UTR de

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estão localizados na previu miRNAs sítios de ligação, mas apenas quatro desses SNPs miRNA-relacionados são comuns [ou seja, menor freqüência do alelo (MAF) 0,05]. Estes quatro SNPs são rs8126 T C (localizada dentro do local de ligação para o miR-184), rs710100 G A (dentro de miR-155), rs1052912 G A (dentro de miR-105) e rs1052823 G T (dentro miR- 550) (https://compbio.uthsc.edu/miRSNP) [fig. 1A].

(A) Os quatro SNPs validados e suas localizações exatas dentro da

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3′-UTR. (B) O desequilíbrio de ligação (LD) mapa de SNPs seleccionados de

gene TNFAIP2

. Ele mostrou que rs1052912 e rs1052823 estão em LD com um D ‘= 0,87.

Estudos recentes têm mostrado que estes SNPs nos locais de ligação de miARN pode potencialmente ser associada com o risco de cancro humano [15], [ ,,,0],16]. Portanto, a hipótese de que

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SNPs estão associados com a susceptibilidade ao câncer gástrico. Para testar essa hipótese, realizamos um estudo de caso-controle para avaliar a associação entre estes quatro

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SNPs em miRNA sites e risco de câncer gástrico obrigatório em uma população branca não-hispânica dos EUA.

Materiais e Métodos

Os sujeitos do estudo

Os sujeitos do estudo eram pacientes com diagnóstico recente e histologicamente confirmada câncer gástrico na Universidade do Texas MD Anderson cancer Center (Houston TX) entre março de 2002 e fevereiro de 2011, que foram recrutados para um estudo de caso-controle contínuo de câncer gástrico. Ao mesmo tempo, indivíduos controle sem câncer foram recrutados por meio de correspondência frequência da idade (± 5 anos), sexo e etnia (brancos não-hispânicos versus outros) a partir de um estudo de epidemiologia molecular em curso de câncer de cabeça e pescoço, entre 2002 e 2011 [17]. Estes indivíduos controle sem câncer não eram pacientes do hospital que estavam buscando cuidados de saúde, nem geneticamente relacionado com os casos. Informações adicionais sobre os fatores de risco, como o tabagismo e uso de álcool, foi coletado de cada indivíduo elegível que tinha fornecido o consentimento informado. O protocolo do estudo foi aprovado pela The University of Texas MD Anderson Cancer Center conselho de revisão institucional.

A genotipagem

DNA genômico foi extraído a partir da fracção creme leucocitário de cada amostra de sangue usando um Kit de sangue Mini (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. pureza do DNA e as concentrações foram determinadas por espectrofotometria de absorção a 260 e 280 nm por espectrofotometria UV.

Os dois selecionados

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SNPs, rs710100 e rs1052912, foram genotipados usando a metodologia TaqMan em placas de 384 poços e lidas com o Software sequência de detecção de um instrumento ABI 7900-prisma, de acordo com as instruções do fabricante, da Applied Biosystems (Foster City, CA), que também fornecidos iniciadores e sondas. Cada placa incluía quatro controles negativos, os duplos controlos positivos e oito amostras repetidas. As condições de amplificação foram como se segue:. 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg, e 60 ° C durante 1 min

Porque o TaqMan ensaio não foi adequado para os outros dois SNPs, ou seja, rs8126 e rs1052823, que foram genotipados pelo método Fragment length polymorphism PCR restrição, no qual os iniciadores foram concebidos para criar novos sítios de restrição e utilizados para amplificar os fragmentos que contêm os polimorfismos para os dois SNPs ambos. [18] as sequências dos iniciadores utilizados para os ensaios de genotipagem foram 5′-GGGGCCGGCTCTCTTGGGCC-3 ‘e 5′-CACACGTACAAAGACCTTGGGCATCC-3′ para rs8126, e 5’-CCTTCGGACTCAGGCATGACTC-3 ‘e 5’-GTAAGGCAGTACCTGGGAAAAGGGTA -3 ‘para rs1052823. O perfil de PCR consistiu de um passo de fusão inicial de 95 ° C durante 5 min, 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 45 s e 72 ° C durante 1 min e um passo de extensão final de 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR para o alelo rs8126 C de 105 pares de bases (pb) foram digeridos por o

Apa I

de enzima (New England Biolabs, Beverly, MA) a dois fragmentos de 85 pb e 20 pb, enquanto que os de rs1052823 G alelo de 108 bp foram digeridos pela

Rsa

I (New England Biolabs) para três fragmentos de 83 pb, 15 pb e 10 pb. A taxa de sucesso de ensaio para todos os genótipos foi 99%, e os ensaios repetidos para 10% das amostras foram 100 concordantes

Análise Estatística

Os χ

2 testes. foram realizadas para comparar a distribuição de variáveis ​​demográficas e fatores de risco selecionados, como o tabagismo e bebidas alcoólicas consumos, entre casos e controles. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado por um bem-of-fit χ

2 teste para comparar as freqüências genotípicas observadas com os esperados nos controles sem câncer. As associações de genótipos de

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SNPs com risco de câncer gástrico foram estimados pelo cálculo do odds ratio (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (CIs) de ambos os modelos de regressão logística multivariada univiariate e em análises de caso-controle , seguido por análise de estratificação por idade (≤59 vs. 59 anos), sexo, etnia (branca versus não-branco), tabagismo e estado bebendo. Todas estas análises foram realizadas com ou sem ajuste para as variáveis ​​demográficas e fatores de risco selecionados. Haplótipo Proc no software SAS /Genética usando o algoritmo expectativa-max-imization (EM) foi conduzido para gerar estimativas de probabilidade máxima de frequências de haplótipos. Haplótipos com frequências 5% foram combinados em um único grupo. Todos os testes foram em frente e verso, e uma

P Art 0,05 foi considerado o ponto de corte para significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software Statistical Analysis System (Versão 9.2; SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

características demográficas e fatores de risco para o câncer gástrico

Este estudo incluiu 301 pacientes com câncer gástrico e 313 controles sem câncer. A tabela 1 resume a distribuição das características demográficas e fatores de risco selecionados para o câncer gástrico. Por causa da correspondência frequência utilizada em nosso desenho do estudo, não houve diferença significativa nas distribuições de idade (idade média de 59 anos), sexo e etnia. Aparentemente, não houve diferença em fumar e status entre casos e controles potável. No entanto, estas variáveis ​​foram ajustado para em mais modelos de regressão logística multivariada para controlar por qualquer confusão residual sobre o efeito principal do SNPs seleccionados.

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genótipos e risco de câncer gástrico

as distribuições genotípicas dos quatro

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SNPs seleccionados entre os casos e controles estão listadas na Tabela 2. a observadas freqüências genotípicas desses SNPs eram todos de acordo com os esperados pela Hardy- Weinberg nos indivíduos (

P

= 0,234 para rs1052823 G T,

P

= 0,698 para rs710100 G a e

P

= 0,125 para rs1052912 G a ), exceto para rs8126 T C (

P

= 0,013) nos casos. As distribuições dos genótipos para

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rs8126 T C foram 56,48% para TT, 32,56% para CT e 10,96% para o CC nos casos, significativamente diferentes daqueles nos controles, que era 52,72% para TT , 41,53 para CT e 5,75 para CC. Esta diferença foi estatisticamente significativa (

P

= 0,019) sob o modelo recessivo (rs8126 T C CC /TT + CT). (Tabela 2)

Além disso, o

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SNP rs8126 T C, o único dos quatro selecionados

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SNPs em sítios de ligação de miRNA, mostrou uma associação estatisticamente significativa na análise posterior regressão logística. Especificamente, o CC genótipo homozigoto rs8126 só foi limítrofe associada a um risco aumentado de câncer gástrico (OR ajustado = 1,76, 95% CI = 0,96-3,27 e

P

= 0,072), em comparação com o genótipo TT, mas este risco aumentado (OR ajustado = 2,00, 95% CI = 1,09-3,64 e

P

= 0,024), quando comparado com os genótipos variantes rs8126 T combinados (Tabela 2). No entanto, na seguinte análise estratificada por idade, sexo, etnia, tabagismo e estado de beber, apenas no subgrupo de fumantes atuais, mas não bebedores, que o risco elevado permanecem estatisticamente significativa com uma maior variação nas estimativas (OR ajustado = 4,04 , IC de 95% = 1,08-15,08 e

P

= 0,038) (Tabela 3), apesar de o subgrupo tinha observações limitadas. Nenhuma outra associação significativa foi encontrada na análise de efeitos conjuntos de todos os quatro

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SNPs nos locais de ligação de miRNA.

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haplótipos eo risco de gástrico cancer

Os haplótipos também foram exploradas para determinar se algum haplótipo particular pode ser associado com o risco de câncer gástrico. Como mostrado na Fig. 1B,

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rs1052823 e rs1052912 estão em desequilíbrio de ligação elevada (LD) (r

2 = 0,87); consequentemente, rs1052912 não foi incluído na análise de haplótipos. Quatro haplótipos foram mostrados para ter frequências 5% entre todos os casos, enquanto outros haplótipos menos comuns (frequências 5%) foram combinados em um grupo na análise. Os quatro haplótipos comuns (rs8126 /rs1052823 /rs710100: T-G-G, C-G-A, T-G-A e C-T-A) responderam por 90,53% e 94,72% dos cromossomos dos casos e controles, respectivamente. No entanto, a distribuição de haplótipos frequência não foi estatisticamente diferente entre casos e controles, e suas associações com risco de câncer gástrico não foram significativas também. Em uma análise mais aprofundada sobre os outros haplótipos incomuns, os rs8126 haplótipos /rs1052823 /rs710100: CGG mostrou associação estatisticamente significativa com o risco de câncer (OR ajustado = 2,60, 95% CI = 1,39-4,85 e

P

= 0,003) , em comparação com o haplótipo comum TGG. (Tabela 4)

Discussão

Neste estudo caso-controle de base hospitalar, descobrimos que o

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miR-184 sítio de ligação variante rs8126 CC genótipo foi significativamente associada com um risco elevado de desenvolver câncer gástrico em um modelo genético recessivo. Na análise estratificada, tal efeito foi mais evidente no subgrupo de bebedores atuais, o que poderia ser uma descoberta casual. No entanto, não havia nenhuma evidência estatística de uma associação com o risco da doença em genótipos variantes de outros SNPs seleccionados, incluindo rs1052823 G T, rs710100 G A e rs1052912 G A, tanto em análises gerais ou em análises estratificadas por idade, sexo, etnia, tabagismo ou o status de beber. Além disso, a análise de haplótipos não identificou subgrupos adicionais com frequência comum de alto risco.

Recentemente, dois estudos de associação do genoma (GWASs) relataram associações significativas de diversas variantes genéticas com risco de câncer gástrico em populações chinesas bem como populações japonesas e coreanas [19], [20]. SNPs do

gene TNFAIP2

não estavam entre os top-hits relatados, porque as associações só alélicas em vez de modelos genéticos, tais como o modelo recessivo, foram testados nestes estudos GWAS. No presente estudo com uma dimensão limitada da amostra, o selecionado SNP rs8126 T C SNP no

local de ligação miRNA TNFAIP2

, um SNP que não foi incluído, nem em LD com aquelas constantes, no chip GWAS, foi associada com câncer gástrico. Esta constatação, no entanto, precisa de maior validação por estudos maiores.

Poucos estudos têm investigado o papel do SNPs nos locais de ligação de miRNA na etiologia do câncer gástrico. Um estudo de associação de caso-controle em uma população japonesa de 552 casos e 697 controles demonstraram que o genótipo CC rs2910164 no pré-miRNAs (miR-146a) foi estatisticamente associada com um risco aumentado de câncer gástrico [21]. Outro estudo câncer gástrico semelhante em uma população chinesa demonstrou um aumento significativo do risco em indivíduos com os homozigotos variante CC de miR-196a-2 em comparação com o TT homozigoto de tipo selvagem e transportadoras CT heterozigotos. Este SNP também mostrou ter uma forte associação com metástase ganglionar [22]. Efeitos similares foram encontrados para os combinados rs895819 genótipos AG + GG de horas-mir-27a em um estudo chinês realizadas por Qingmin S

et al

[23]. Outras análises funcionais indicam que o alelo variante C podem ser responsáveis ​​pela expressão elevada de miR-27a, reduzindo a expressão de ARNm do seu gene alvo,

ZBTB10

(dedo de zinco e um domínio contendo BTB 10), um possível mecanismo através qual o

HSA-mir-27a

SNP desempenha um papel na susceptibilidade câncer gástrico [23]. No entanto, não há estudos publicados têm investigado o papel dos SNPs residente no miRNA sequência obrigatório em câncer gástrico.

TNFAIP2

(

B94

) é uma resposta primária orientada por citocina gene que foi originalmente clonado a partir de transcrição-TNF-α indutível em células endoteliais humanas estimuladas [15]. Outros estudos descobriu que poderia ser activada por outros factores, incluindo o TNF do que a interleucina-1β ou lipopolissacárido [24]. A expressão de

TNFAIP2

foi revelado para ser existia no fígado embrionário e rim, bem como em células germinativas macho maduro e hematopoiético e tecidos linfóides [25]. Embora a função da

gene TNFAIP2

ainda é em grande parte desconhecida, tem sido sugerido que

TNFAIP2

pode desempenhar várias funções no desenvolvimento de órgãos, incluindo a vasculogénese, a diferenciação das células do sangue, mielopoiese e espermatogénese . Além disso, foi relatado que o gene foi reprimida em células da medula de leucemia promielocítica aguda (APL) e os pacientes que os seus mRNAs alvo poderia ser sobre-regulada por todos os-tans-Ra (ácido retinóico) [26].

miR-184 é um gene de cópia única e evolutivamente conservada ao nível dos nucleótidos a partir de moscas para os seres humanos. Apesar de sua função ainda não está claro, alguns estudos têm sugerido miR-184 como um potencial candidato oncogênico. Um estudo sobre o carcinoma de células escamosas (SCC) da lingueta mostrou que o miR-184 pode desempenhar um papel em parte na anti-apoptose e a proliferação das células SCC língua [27]. Um outro estudo demonstrou que, em primeiro lugar o miR-184 reduziu significativamente o desenvolvimento do tumor e aumentou a sobrevivência geral, em um modelo murino ortotópico de neuroblastoma [28]. Um estudo descobriu mais tarde que o miR-184 foi envolvido em uma via genética comum através visando a quinase AKT2 serina /treonina, agindo com o fator de transcrição MYCN para inibir a sobrevivência de células do neuroblastoma [29]. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem um possível papel do miR-184 na modulação do risco de câncer. No entanto, não está claro se SNPs em seus locais de ligação podem alterar ainda mais essa modulação.

Em nosso estudo anterior, em 1.077 pacientes com carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) e 1.073 controles sem câncer em uma população branca não-hispânica, que avaliou as associações de SNPs de

TNFAIP 2

gene com SCCHN risco [24], nós também descobriram que, em comparação com o genótipo TT rs8126, a variante CT e CC genótipos foram associada com um risco aumentado de uma maneira SCCHN resposta de dose alelo [18]. Na análise de correlação genótipo-fenótipo de 37 linhas de células SCCHN e células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de 43 pacientes SCCHN, o genótipo rs8126CC foi associado com redução da expressão de

TNFAIP2

mRNA. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o sítio de ligação de miR-184 SNP (rs8126T C) na 3’UTR de

TNFAIP2

é funcional, possivelmente por modulação da expressão

TNFAIP2

e contribui para SCCHN susceptibilidade [18]. Nossas descobertas em câncer gástrico são consistentes com os do câncer de cabeça e pescoço.

Embora nosso estudo não revelou qualquer efeito principal de outros SNPs no miRNA locais de

TNFAIP2

sobre o risco global vinculativo de câncer gástrico, conseguimos encontrar que o rs8126 CC variante genótipo homozigoto, em comparação com os genótipos combinados (TC + ​​TT), foi associado com aumento significativo do risco de câncer. A evidência estatística que só poderia ser sustentada em um subgrupo de bebedores na estratificação analisa sugere o tamanho da amostra muito limitado do presente estudo. Embora o uso do tabaco e do consumo de álcool têm sido considerados como os principais riscos para o câncer gástrico, o nosso projeto de harmonização foi destinado a controlar a sua confusão sobre os principais efeitos dos SNPs seleccionados, em que overmatching pode acontecer devido a possíveis associações entre as variáveis ​​correspondentes (idade e sex) e os fatores de risco conhecidos (tabagismo e etilismo) nesta população estudada. Na análise de haplótipos adicional, enquanto quatro haplótipos de frequência comum não mostraram qualquer associação estatística risco de câncer, o menor rs8126 haplótipo frequência /rs1052823 /rs710100: C-G-G provou ter maior risco, em comparação com o haplótipo comum T-G-G. A análise de haplótipos de baixa frequência sugere uma conclusão diferente, ou seja, de que pode haver um SNP de baixa frequência sem tipo que está associado com o cancro gástrico. Estudos adicionais são necessários para validar este resultado.

No entanto, uma vez que o presente estudo é, a nosso conhecimento, o primeiro estudo sobre o

TNFAIP2

SNPs e risco de câncer gástrico, os nossos resultados são mais consideradas estudos preliminares e maiores são necessários para avaliar melhor o papel desses SNPs na etiologia do câncer gástrico. Outra limitação do estudo foi a falta de informações sobre o

H. pylori

estado de infecção dos sujeitos. Desde

H. pylori

infecção em pacientes gástricas era relativamente raro em os EUA [30], em comparação com os da América do Sul [31] e países asiáticos [32], os pacientes recrutados em nosso estudo não foram testados para a infecção após a sua visita à hospital. Portanto, a inclusão de

H. pylori

informações devem ser considerados em futuros estudos maiores.

Reconhecimentos

Agradecemos Margaret Pulmão e Jessica Fiske por sua assistência no recrutamento dos indivíduos e coletando as informações questionário e Jianzhong He, Kejing Xu, e Min Zhao e por sua assistência no processamento de sangue e extração de DNA.