Abstract

1α-25 (OH)

2 vitamina D

3 (1-25D), uma forma hormonal ativa da vitamina D

3, é um quimiopreventivo bem conhecido e agente pró-diferenciação. Demonstrou-se para inibir o crescimento de linhas celulares de cancro da próstata vários. As junções de hiato, formados de proteínas chamadas conexinas (Cx), são conjuntos de canais de célula-célula, que permitem a troca de moléculas reguladoras de crescimento pequena entre as células adjacentes. a comunicação célula-célula mediada por canais de junções de hiato é um mecanismo de controlo homeostático importante para a regulação do crescimento e diferenciação celular. Nós temos investigado o efeito de 1-25D na formação e degradação das junções de hiato em uma linha de androgénio-responsiva de células do cancro da próstata, LNCaP, que exprime-retroviral introduzido Cx32. Connexin32 é expressa por luminal e bem diferenciadas células de tumores da próstata e pela próstata normal. Nossos resultados documentar que 1-25D aumenta a expressão de Cx32 e sua posterior montagem em junções comunicantes. Nossos resultados mostram ainda que 1-25D evita a degradação regulada por androgénio de Cx32, após a tradução, independente do receptor de andrógeno (AR) a sinalização mediada. Por fim, os nossos resultados documentam que a formação de junções de hiato Cx32 sensibiliza-expressando células LNCaP aos efeitos inibidores do crescimento de 1-25D e altera a sua morfologia. Estes resultados sugerem que os efeitos inibidores do crescimento de 1-25D em células LNCaP pode estar relacionada com a sua capacidade de modular a montagem de Cx32 em junções comunicantes

Citation:. Kelsey L, Katoch P, Ray A, Mitra S, Chakraborty S, Lin MF, et ai. (2014) Vitamina D

3 regula a formação e degradação de Gap Junções em andrógeno-Responsive células cancerosas da próstata humana. PLoS ONE 9 (9): e106437. doi: 10.1371 /journal.pone.0106437

Autor: Michael Koval, da Escola de Medicina da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de novembro de 2013; Aceito: 06 de agosto de 2014; Publicação: 04 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kelsey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo National Institutes of Health CA113903, DOD PCRP PC-081198 e PC-111867, Nebraska Estado Grant LB506 e R0-1DE12308. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O papel da vitamina D

3, e sua forma hormonal ativa 1α-25 (OH)

2 vitamina D

3 (1-25D), como um anti-neoplásica, pro -differentiating, e agente pró-apoptótica foi estabelecida numa grande variedade de células epiteliais normais e malignas, incluindo o cancro da próstata (PCA) [1] – [4]. As acções de 1-25D são mediados por ligação ao receptor da vitamina D, um dos membros da superfamília de receptores nucleares, que é expresso numa grande variedade de células, incluindo próstata. O receptor da vitamina D heterodimerizes com o receptor de RXR e liga-se a vitamina D elemento de resposta do receptor para alterar a expressão do gene de [1]. Com base na observação de que as taxas de mortalidade de PCA em os EUA é inversamente proporcional à exposição à radiação incidente ultravioleta geograficamente do sol e que a luz ultravioleta é essencial para a vitamina D

3 síntese na pele, um papel para esta vitamina na diminuição o risco de desenvolvimento de PCA tem sido sugerido [5], [6]. Numerosos

In vitro

estudos mostram inibidor do crescimento consistente e efeitos de diferenciação-indução de vitamina D

3 em células de carcinoma da próstata, e estudos em animais mostram que não só reduz a incidência de PCA, agindo como um agente quimiopreventivo mas também suprime a metástase [7] – [10]

junção Gap (GJ) s são conjuntos de canais de célula-célula que sinalizam não canonicamente, ao permitir a troca directa de pequenas moléculas (≤1500Da) entre. os interiores citoplasmáticos de células contíguas [11]. As proteínas constituintes de GJS, chamados conexinas (CXS), sejam codificados por 21 genes, que foram designados de acordo com a sua massa molecular [12]. canais de célula-célula são estruturas bicelulares formados pelo esforço colaborativo de duas células. Para formar um canal GJ célula-célula, Cxs primeiro oligomerizar no retículo endoplasmático ou a rede trans-Golgi como um hexâmero, chamado connexon, que docas com o connexon exibido numa célula contígua [13], [14]. Várias linhas de evidência agora dar credibilidade à noção de que a comunicação célula-célula mediada por canais de junções de hiato é um mecanismo de controle homeostático importante para a regulação do crescimento e diferenciação celular e no combate à promoção de tumor. Por exemplo, a expressão de Cx prejudicada, ou perda de função GJ, tem sido implicado na patogénese de vários tipos de cancros e doenças [15] – [19]. Além disso, as mutações em vários genes Cx foram detectados em doenças genéticas caracterizadas por proliferação anormal e diferenciação celular [13], [20].

Os nossos estudos anteriores mostraram que a expressão de Cx32, o que é expresso por luminal células da próstata, coincidiu com a aquisição do estado diferenciado das células luminais [21], [22]. Além disso, nós documentado que a progressão da APC a partir de um estado dependente de androgénios para um estado invasiva, independente de androgénios foi caracterizado por o tráfico aberrante de Cx32 e /ou montagem prejudicada em GJS [22] – [24]. Além disso, nossos estudos mostraram que a expressão forçada de Cx32 em linha responsivos aos andrógenos humana PCA celular, LNCaP, o crescimento celular retardada

in vivo

e

in vitro

[22]. Mostrámos também que nas células LNCaP que expressam Cx32, formação e degradação de GJS foram regulados pelos androgénios, que controlam o nível de expressão de Cx32 pós-traducionalmente, prevenindo a sua degradação pelo retículo endoplasmático degradação associada (ERAD) [25]. Os androgénios são necessários para manter a função secretora (diferenciação relacionada com a) das células epiteliais luminais da próstata normal, tal como a depleção de androgénios por meios cirúrgicos ou químicos desencadeia a apoptose e /ou de desdiferenciação destas células [26] – [29]. Os nossos estudos recentes têm demonstrado que os retinóides, que também regulam a proliferação e diferenciação de células epiteliais da próstata [28], [30], também melhorar a montagem de Cx32 em GJS [31]. Estes estudos dão credibilidade a noção de que a formação e degradação de GJS pode ser ligada à proliferação e diferenciação de células epiteliais luminais da próstata.

Tal como androgénios e retinóides, vitamina D

3 é essencial para o desenvolvimento normal da próstata e também foi documentada para modular a progressão APC [7], [9]. Estudos recentes têm mostrado que a vitamina D suprimiu neoplasia epitelial da próstata em ratinhos transgénicos NKX3.1 /PTEN [32]. Epidemiológico, cultura de células, e os estudos clínicos têm implicado efeitos antitumorais de 1-25D para APC e tem sido sugerido para ser um potente agente quimiopreventivo [3], [4]. No entanto, em contraste com o cancro do cólon [1], [33], o potencial de eficácia de 1-25D na quimioprevenção de APC permaneceu controversa apesar de numerosos estudos em modelos de ratinho transgénicos de APC e a sua utilização em ensaios clínicos [1], [2]. Estudos anteriores, incluindo o nosso, têm mostrado que os efeitos inibidores do crescimento e indução de diferenciação-de agentes quimiopreventivos pode estar relacionado com a sua capacidade para melhorar a comunicação por junções de hiato [34] – [38]. As células luminais de próstata normais expressam Cx32 e formar grandes GJS e progressão da APC é acompanhada por perda de capacidade de formar GJS [22], [23]. Formação de GJS tem sido implicado na manutenção do estado polarizado e diferenciada das células epiteliais [39]. Esses estudos levaram-nos a examinar o efeito do 1-25D na montagem de Cx32 em GJS em humano linha celular PCA andrógeno responsivo LNCaP. Porque 1-25D tem sido demonstrado que o aumento da expressão de AR nas células LNCaP [40], que racionalizado que pode modular a formação de androgénio a-regulado e a degradação de GJS e afectar o crescimento de células responsivos aos andrógenos APC que expressam Cx32. Usando células LNCaP andrógeno-sensível, que expressam retrovirally-introduzida Cx32 [25], mostramos que 1-25D aumenta a montagem de Cx32 em GJS. Além disso, mostram ainda que 1-25D evita a degradação reguladas-androgénio de GJS pós-tradução, independente da sinalização mediada por AR. Finalmente, os nossos resultados mostram que a formação de GJS sensibiliza células LNCaP aos efeitos inibidores do crescimento de 1-25D e altera sua morfologia.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

andrógeno a linha celular humana -responsive APC, LNCaP, foi cultivada como descrito [41], [42]. células, um dos vários clones de células LNCaP que expressam rato retroviralmente transduzidas Cx32, e células LNCaP-N, um dos vários clones de controlo seleccionadas em G418 após a infecção com o retrovírus de controlo, 32 de LNCaP-ter sido descrita [25], [ ,,,0],31]. células LNCaP parentais, daqui em diante referidas como células LNCaP-P, foram cultivadas em meio RPMI contendo soro fetal de bovino a 5% numa atmosfera de 5% de CO

2/95% de ar, enquanto que LNCaP-N e LNCaP-32 As células foram mantidas em RPMI contendo soro fetal de bovino a 5% contendo G418 a 200 ug /ml, como descrito [25], [31]. depleção de soro esteróide (despojado com carvão) e fenol-vermelho livre de RPMI foram obtidos a partir de Hyclone Laboratories (Salt Lake City, UT).

Anticorpos e imunocoloração

As fontes de anticorpos monoclonais e ambos Os anticorpos policlonais contra Cx32 foram descritos anteriormente [24], [25], [31], [43], [44]. De ratinho anti-ocludina (OC-clone 3F10) foi de Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA). Os anticorpos de coelho contra α- e β-catenina e de ratinho anti-β-actina (clone C-15) foram de Sigma (St. Louis, MO). Os anticorpos monoclonais contra a E-caderina (E-cad), α-catenin, β-catenina, generosamente fornecido pelos Drs. Johnson e Wheelock (Eppley Institute), foram descritos [25], [43], [44]. Um anticorpo anti-receptor de AR policlonal de coelho era de Santa Cruz Biotech (SC-13062, San Diego, CA). As células (1,5 x 10

5), semeado em seis grupos de poços contendo lamelas de vidro e deixou-se crescer até aproximadamente 50% de confluência, foram imunocoradas com vários anticorpos, tal como descrito [24], [25], [31], [ ,,,0],43] – [45]. anticorpos secundários (coelho ou rato), conjugado com Alexa 488 e Alexa 594, foram usadas conforme apropriado. Imagens de células imunomarcadas foram adquiridos com Leica DMRIE microscópio (Leica Microsystems, Wetzler, Alemanha) equipado com câmera de Hamamatsu ORCA-ER2 CCD (Hamamatsu-City, Japão) e analisados ​​utilizando software de processamento de imagem (Volocity, Versão 6.3; Improvisação, Inc; Perkin Elmer) como descrito [43] – [45].

de Stock Solutions

Synthetic andrógeno Mibolerone (MB) e um andrógeno natural, hidro-testosterona (DHT), 1-25D e Casodex ( bicalutamida) foram adquiridos a partir de BIOMOL (ENZO Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY). As soluções de reserva de MB e DHT foram preparadas a 1 mM em etanol e armazenado a -20 ° C em pequenas aliquotas protegidas da luz. Da solução de 1-25D (10? M) foi preparado em etanol e armazenado em alíquotas a -80 ° C ao abrigo da luz. Da solução de Casodex (10 mM) foi preparada em DMSO e armazenado em alíquotas a -20 ° C. Eles foram apropriadamente diluídas no meio no momento do tratamento. Todos os experimentos foram realizados em luz amarela como descrito [36], [37].

andrógeno Exaustão e Outros Tratamentos

As células foram semeadas em seis grupos bem com lamelas de vidro (1,5 × 10

5 células por poço) e em 6 cm (2 x 10

5 células por prato) e placas de 10 cm (3,5 × 10

5 células por prato) em 2, 4 e 10 ml de meio completo , respectivamente. As células foram tratadas, repondo com meio fresco contendo diferentes reagentes na concentração desejada, quando eles atingiram 50% de confluência. Os controlos foram tratados com etanol de tal modo que a concentração final do solvente não exceder 0,1%. Quando as células estavam a ser cultivados sob condições de depleção de androgénios, meio de cultura de células normal foi substituído com (RPMI-fenol-vermelho livre de soro contendo despojado-carvão a 5%) meio de cultura de células com depleção de androgénio. Os controles receberam meio isento de vermelho de fenol-fresco contendo soro normal. Utilizou-se meio de vermelho de fenol livre de vermelho de fenol porque tem sido documentado ter efeitos esteroidogênicas sobre o crescimento de linhas de células sensíveis a hormônios, incluindo LNCaP [46], [47].

Análise de Western Blot e de detergente solubilidade de Connexin32

as células (5 × 10

5) foram semeadas em placas de 10 cm em replicar-se em 10 ml de meio completo e cultivadas até à confluência, na presença e na ausência de vários reagentes. A lise celular, ensaio de detergente solubilidade com 1% de Triton X-100 (TX100) e o nível de expressão de Cx32 foram analisados ​​por análise de Western blot, conforme descrito [25], [43], [44]. Resumidamente, após a lise em SSK tampão (Tris 10 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaF 10 mM, NEM a 10 mM, Na a 10 mM

2VO

4, 10 mM de iodoacetamida, 1% TX100, pH 7,4 ), extractos totais, solúveis e detergente–insoluble foram separadas por ultracentrifugação a 100.000 × g durante 60 min (35.000 rpm, em Beckman ultracentrífuga analítica; Modelo 17-65 utilizando um rotor SW50.1). As pastilhas detergentes insolúveis foram dissolvidos em tampão C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, ureia 8 M, 10 mM NEM, 10 mM de iodoacetamida, 2,5% de SDS, e 0,1 M de DTT). Após normalização baseada no número de células, as fracções solúveis totais e-TX100 e -insoluble foram misturadas com tampão de 4xSDS-carregamento para uma concentração final de 1x e incubadas à temperatura ambiente durante 1 h antes de análise por SDS-PAGE. As manchas foram desenvolvidos com C-Digit (Li-COR, Lincoln, NE), utilizando SuperSignal WestFemto sensibilidade máxima de substrato (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Ensaios de Comunicação

Gap comunicação juncional foi ensaiada por microinjecting Lucifer Yellow (MW 443 Da; sal de lítio), Alexa Fluor 488 (MW 570 Da; A-10436) e Alexa Fluor 594 (MW 760 Da; A-10438), utilizando sistemas de microinjeção Eppendorf InjectMan e FemtoJet (modelos 5271 e 5242, Brinkmann Instrument, Inc., Westbury, NY) montado sobre Leica DMIRE2 microscópio. Após a captura das imagens de células micro-injectadas com a ajuda de câmara CCD (Retiga 2000R, RÁPIDO 1394) usando QCapture (British Columbia, Canadá), a permeabilidade de vários marcadores fluorescentes foi quantificada por conseguir o número de células fluorescentes em 1 min (Amarelo Lucifer ), 3 min (Alexa 488) e 15 min (Alexa 594) após microinjecção de células de teste, tal como descrito [22], [25], [43], [48].

Formação de Colónias e de crescimento celular Os ensaios

de crescimento celular foi avaliada quer pelo ensaio de formação de colónias ou pela contagem do número de células, como descrito [22], [48]. Para o ensaio de formação de colónias, 1 × 10

3 células foram semeadas em placas de 6 cm, em triplicado, em pratos de meio de cultura de 3 ml. Depois de 24 h, um ml de meio contendo 1-25D, MB ou DHT foi adicionado aos pratos para dar a concentração final desejada. As células foram cultivadas durante 21 dias, com uma mudança de meio cada 4 dias contendo a concentração apropriada dos reagentes acima, quando eles formaram colónias visíveis. Colónias nas placas foram fixadas com formaldeído a 3,7% tamponada, coradas com uma solução de 0,025% de violeta de cristal em PBS, e fotografados. Para medir o crescimento celular, 5 × 10

4 células foram semeadas em placas de 6 cm em pratos replicados e tratou-se com 1-25D descrito acima. As células foram deixadas a crescer durante 10 dias com uma alteração do meio no dia 5. As células foram tratadas com tripsina e contadas num hemocitómetro.

Resultados

A vitamina D

3 Melhora Cx32 Nível de expressão

Nós usamos LNCaP-32 células que expressam rato retrovirally transduzidas Cx32 descrito anteriormente [25], [31]. Anteriormente mostrou que em LNCaP-32 células andrógeno regulada a formação de GJS, após a tradução, ao controlar o nível de expressão de Cx32 através da inibição da sua degradação mediada por ERAD [25]. Os nossos estudos posteriores demonstraram que a degradação reguladas-androgénio de Cx32 foi anulada pelo ácido all-trans retinóico (ATRA) e ácido 9-cis retinóico (9-PCR) [31]. Nós, portanto, racionalizado que 1-25D pode agir semelhante ao ATRA e 9-CRA. Com base nos estudos anteriores que mostram o efeito da vitamina D no crescimento celular de LNCaP [10], [49] – [52], que tratada de LNCaP-32 células com várias concentrações de 1-25D para examinar o seu efeito sobre o nível de expressão de Cx32 . Descobrimos que 1-25D aumento do nível de expressão de Cx32 em uma maneira dependente da dose (Figura 1A). melhoria significativa foi observada mesmo em concentrações tão baixas quanto 1 nM (Figura 1B, gráfico da esquerda). Concentrações mais elevadas do que 10 nM foram tóxicas para as células, como avaliado pelo ensaio de formação de colónias (dados não publicados). Para estudos posteriores que escolhemos 10 nM 1-25D. estudos de evolução no tempo mostrou que um aumento significativo no nível de expressão de Cx32 ocorreu tão cedo quanto 12 h após o tratamento com 1-25D e atingiu um patamar às 72 h (Figura 1CD, gráfico da direita). O efeito de 1-25D no nível de expressão de Cx32 foi tão potente como a de androgénio sintético, MB, e 9-CRA. Além disso, o tratamento combinado com 1-25D e MB foi mais eficaz no aumento do nível de expressão de Cx32 (Figura 2AB). A vitamina D

3 já havia sido demonstrado que afetam a expressão do nível de E-cad, uma proteína constituinte do junções aderentes, em células cancerígenas do cólon [33]. Para determinar se 1-25D também afetou o nível de proteínas associadas adherens junção expressão, medimos o nível de E-cad e suas proteínas associadas a- e ß-Cateninas 72 h expressão após o tratamento com 1-25D. Os resultados mostraram que 1-25D teve nenhum efeito sobre o nível de E-cad e a- e p-cateninas (Figura 2C) expressão. Tal como medido pela análise semi-quantitativa por RT-PCR, nem 1-25D induziu a expressão de Cx32 endógeno em células LNCaP-P ou LNCaP-N (dados não mostrados), nem alterou o nível de ARNm de Cx32 retroviralmente-transcritas expressão em LNCaP-32 como documentado anteriormente [25].

A. melhoramento dependente da dose do nível de expressão de Cx32 após 1-25D tratamento durante 48 h. B. A análise quantitativa do nível dos dados mostrados na A. Cada barra representa a média e o erro padrão da média de 4-17 experimentos expressão. Note-se que melhoria significativa é observada mesmo em 1 nM. Os asteriscos (**) indicam o valor P de ≤0.0001. A

t

teste de duas de Student bicaudal foi utilizado para calcular o valor P assumindo variância desigual. C. Cinética de melhoria do nível de expressão de Cx32 após tratamento com 1-25D (10 nM) durante os tempos indicados. Note-se que aumento é observado nas primeiras 12 h e planaltos às 72 horas. D. A análise quantitativa do nível dos dados mostrados na C. Cada barra expressão representa a média e o erro padrão da média de 3-11 experimentos. O asterisco (*) indica o valor P de ≤0.0016 e asteriscos (**) indicam o valor P de ≤0.0001. A Student bicaudal

t

teste foi utilizado para calcular o valor P assumindo variância desigual.

Cx32 expressando células LNCaP-32 foram tratados com o 1-25D, 9-CRA, DHT e MB, tal como indicado. O tratamento combinado com A. 1-25D com MB ou 9-CRA é mais eficaz no aumento do nível de expressão de Cx32 do que o tratamento com o agente único sozinho. B. A análise quantitativa do nível dos dados mostrados na A. Cada barra representa a média e o erro padrão da média de 4-13 experimentos expressão. Os asteriscos (**) indicam o valor P de ≤0.0001. A

t

teste de duas de Student bicaudal foi utilizado para calcular o valor P assumindo variância desigual. C. Efeito de 1-25D em proteínas associadas adherens junção. Expressão de proteínas aderentes junção de E-caderina (E-cad), α-catenina (α-gato), e β-catenina (β-CAT) foi analisado por análise de Western blot de lisado celular total (10 ug). Note-se que não há nenhum efeito.

A vitamina D

3 Melhora Gap Assembleia Junction e juncional comunicação

A seguir, examinou o efeito de 1-25D na montagem de Cx32 em GJS. Descobrimos que, concomitante com um aumento no nível de expressão de Cx32, 1-25D também aumentou montagem GJ tal como avaliado por análise imunocitoquímica (Figura 3A) e bioquimicamente por análise de Western blot de um total, solúvel em TX100 e extractos -insoluble às 48 h após o tratamento (Figura 3BC). Este método bioquímico é baseado no princípio de que Cxs, que estão incorporados no GJS, tornar-se insolúvel em TX100 Cxs Considerando que não estão incorporados no GJS permanecer solúvel [53]. Este ensaio foi reprodutível mostrado para medir a montagem de Cxs em GJS como documentado por estudos anteriores [24], [25], [53]. Além disso, verificou-se que o reforço da montagem GJ foi acompanhada por um aumento paralelo de 2-3 vezes na comunicação por junções conforme determinado pela transferência de junção de três marcadores fluorescentes GJ permeável, Amarelo Lúcifer (MW 443), Alexa 488 (PM 570), e Alexa 594 (PM 760). Por exemplo, o aumento de transferência de 1-25D juncional de Alexa 594 por 2-3 dobras comparado com os controlos (Tabela 1). O efeito de 1-25D em comunicação por junções foi tão potente como a de androgénio sintético, MB, e o androgénio DHT naturais (Tabela 1). Para determinar se 1-25D afetou a montagem de outros complexos juncionais, que também examinou o detergente-solubilidade de adherens e proteínas de junção associado apertados. A lógica por trás destes estudos foi a de que E-cad foi mostrado para facilitar a montagem de Cxs em GJS [43], [44], [54], e na expressão de Cx foi mostrado para facilitar a montagem de junções apertadas e as suas proteínas constituintes [39]. Descobrimos que 1-25D não teve efeito sobre a solubilidade do E-cad e suas proteínas associadas, α- e β-catenina, e proteínas de junção associado apertados, ZO-1 e ocludina, em TX-100, sugerindo que a sua montagem não estava ainda mais reforçada nas respectivas junções celulares (Figura 3B). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que 1-25D, como androgénios e retinóides, aumenta o nível de expressão de Cx32, e a sua subsequente montagem em GJS, sem alterar visivelmente o nível de outras proteínas associadas junção célula expressão.

LNCaP -32 células, cultivadas quer em seis conjuntos bem ou placas de 10 cm, foram tratados com 1-25D (10 nM), MB (5 nM) e mais 1-25D MB durante 48 h. A. Assembleia da Cx32 (verde) em GJS foi avaliada imunocitoquimicamente. E-cad é mostrado em vermelho e os núcleos estão em azul. Barra = 20 uM. Note-se que a formação de GJ foi reforçada após tratamento com 1-25D e MB. ensaio de solubilidade B. TX100- foi utilizado para medir a montagem de Cx32 em GJS, de junção associado proteína apertado, ocludina (OCCL) e ZO-1 e da proteína adherens junção, E-caderina (E-cad) e α-catenina (α-gato). T = fração total; S = fracção solúvel e I = fração insolúvel. C. A análise quantitativa do nível de expressão de Cx32 mostrado na B. Cada barra representa a média e o erro padrão da média de 4-17 experimentos. Note-se que tanto o nível total e a fracção insolúvel em detergente-de Cx32 aumentou significativamente. Cada barra representa a média e o erro padrão da média de 3-11 experimentos. O asterisco (*) indica o valor P de ≤0.0016 e asteriscos (**) indicam o valor P de ≤0.0001. A

t

teste de duas de Student bicaudal foi utilizado para calcular o valor P assumindo variância desigual. Note-se a ausência de efeito sobre proteínas associadas adherens junção, E-cad, ea junção proteína associada apertado, ocludina (OCCL).

A vitamina D

Formação 3 modula andrógeno-regulamentado e degradação de Gap Junções

estudos anteriores com LNCaP-32 células haviam demonstrado que a depleção de androgênio causou degradação da Cx32 pelo ERAD, e que os andrógenos formação GJ reforçada por re-encaminhamento da piscina segmentadas ERAD de Cx32 para a superfície celular , tornando-se receptivo para a montagem GJ [25]. Em estudos subsequentes, que mostrou que a formação de androgénios e regulada de degradação GJS foi impedido por 9-PCR e atras [31]. Nós racionalizado que 1-25D pode melhorar montagem GJ ao resgatar a piscina segmentadas ERAD da Cx32 como 9-CRA e ATRA. Por isso, nós examinamos o nível de Cx32 e a sua montagem sobre gjs expressão em depleção de androgénio na presença e ausência de 1-25D em células LNCaP-32. Para estes estudos, utilizou-se meio de cultura celular com depleção de androgénio (carvão despojado) e fenol-vermelho livre de células a crescer porque fenol-vermelho tem um efeito fraco esteroidogênica [46]. Tal como foi observado nos nossos estudos anteriores [25], verificou-se que a depleção de androgênio diminuiu o nível de expressão de Cx32 no prazo de 12 horas, o que não só foi impedida por adição de MB, mas também por 1-25D (Figura 4AB). Além disso, o tratamento combinado com MB e 1-25D pareceu ser mais eficaz no aumento do nível de Cx32 (Figura 4A, blot superior) expressão. Nós também descobrimos que a depleção de androgénio diminuiu o nível de expressão de AR, o que também foi impedida por tratamento com androgénios, não só mas também com 1-25D (Figura 4A, mancha inferior). Para substanciar os dados anteriores, avaliou-se ainda mais a formação de GJS imunocitoquimicamente (Figura 5A) e funcionalmente através da medição da transferência de juncional Amarelo Lucifer, Alexa 488, Alexa e 594 (Tabela 2). Os resultados mostraram que GJS foram mal observado em células cultivadas em meio empobrecido-androgénio tal como avaliado pela ausência de imunomarcação específica-Cx32 em áreas de contacto célula-célula, enquanto elas foram prontamente observado quando o meio esgotado de androgénios foi suplementado com 1-25D e MB (Figura 5A). Os ensaios funcionais mostraram que a transferência de juncional Amarelo Lucifer, Alexa 488 e Alexa 594 diminuiu de forma importante, a depleção de androgénio, que foi impedida mediante reposição meio depletado de androgénio com MB e 1-25D (Tabela 2), justificando assim os dados de imunocitoquímica.

LNCaP-32 células, semeadas em placas de 10 cm, foram transferidos para o meio (com depleção de androgênio) despojado carvão (ST). O nível de expressão de Cx32 e AR foi determinada por análise de Western blot (A) na presença e ausência de 1-25D (10 nM) e MB (5 nM). Note-se que Cx32 e AR são degradados após a depleção androgénica e degradação é bloqueado em cima 1-25D tratamento. BC. análises quantitativas do nível de Cx32 (B) e AR (C) dos dados mostrados na A. Cada barra representa a média e o erro padrão da média de 5-11 experimentos expressão. Os asteriscos (**) indicam o valor P de ≤0.0001. A Student bicaudal

t

teste foi utilizado para calcular o valor P assumindo variância desigual.

LNCaP-32 células, semeadas em seis grupos bem ou placas de 10 cm, foram transferidos para o carvão vegetal -stripped, médio depleção de androgênio (ST). GJ montagem e o nível de expressão de Cx32 foram determinados por imunocitoquímica (A) e Western blot (B) análise por ensaio de TX100-solubilidade na presença e ausência de 1-25D (10 nM) e MB (2,5 nM). Em (A), Cx32 é em verde e E-CAD é vermelho e os núcleos (azul) estão manchadas com DAPI. barra de escala em A = 20? M. Em (B), T = fracção total; S = fracção solúvel e I = fração insolúvel. TX100-solúveis e insolúveis fracções, bem como ensaio imuno-histoquímico foram realizadas 24 horas após a extracção tal como descrito em Materiais e Métodos. Note-se que GJS são degradados após a depleção androgénica e degradação é bloqueado em cima 1-25D tratamento (A). Note também que a fração solúvel em TX100 de E-cad (E-cad), β-catenina (β-gato) e ZO-1 não é afectada. Note-se também que o esgotamento de androgénio-aumenta a fracção solúvel de ocludina (B) sem afectar os níveis totais ocludina tal como quantificado em D. O asterisco (*) indica o valor P de ≤0.0016 e asteriscos (**) indicam o valor P de ≤0.0001. A Student bicaudal

t

teste foi utilizado para calcular o valor P assumindo variância desigual.

Os dados imunocitoquímicos e de transferência juncional foram corroboradas pelo ensaio TX100-solubilidade ( Figura 5BC). Nós também examinou o efeito do andrógeno-esgotamento no detergente solubilidade do E-cad e β-catenina e proteínas associadas à junção apertados, ZO-1 e ocludina. Consistente com os nossos estudos anteriores [25], os resultados mostraram que a depleção de androgénio aumentou a solubilidade do detergente-ocludina mas não de ZO-1 e E-cad e β-catenina (Figura 5BD). Examinámos também o efeito de MB e 1-25D quer isoladamente ou em combinação na formação de GJS em LNCaP parentais-P e células LNCaP-N-resistentes G418 e descobriu que eles não teve qualquer efeito (dados não mostrados). Colectivamente, estes dados sugerem que evita a degradação 1-25D regulada-androgénio de Cx32 e melhora a formação em LNCaP GJ-32 células. Como o tratamento combinado com andrógenos e 1-25D não aumentou a montagem GJ ainda mais, é provável que o conjunto foi reforçado por resgatar o mesmo pool de Cx32, que foi alvo de ERAD sobre depleção androgénica. Além disso, como foi observado em nossos estudos anteriores, a montagem e detergente-solubilidade de Cx32 e ocludina em junções celulares, ou vice-versa, parece ser regulada de forma coordenada [25].

Formação 1-25D Melhora Gap Junção independente do receptor andrógeno Função

Nossos dados mostraram que 1-25D impediu a degradação da AR sobre depleção androgénica (Figura 4A, blot inferior). Também o tratamento de células LNCaP com 1-25D tinha sido demonstrado para melhorar o nível de expressão de AR [40]. Assim, considerou-se a possibilidade de que o efeito de 1-25D sobre o reforço do conjunto GJ dependia da função de AR sozinho – e não sobre o efeito independente de 1-25D. Para testar esta noção, nós tratados LNCaP-32 células com o anti-andrógeno, Casodex (Bicalutamide), para bloquear a ação dos androgênios [55], [56]. Ambos depleção androgénica e tratamento com Casodex causou degradação da AR (Figura 6A, blot superior, Figura 6B) e aboliu o efeito do MB e DHT no nível de expressão Cx32 (Figura 6A, blot fundo; Figura 6B), como foi observado em nossos estudos anteriores [25], [31]. No entanto, verificou-se que Casodex não teve efeito sobre o melhoramento do nível de expressão de Cx32 resultante do tratamento com 1-25D em meio depletado de androgénio (Figura 6AB). Para substanciar estes dados, junto examinada a formação de GJS imunocitoquimicamente em células tratadas com Casodex na presença e ausência de MB ou 1-25D. Descobrimos que GJS não foram formadas quando as células foram tratadas com Casodex em soro normal ou em meio depletado de androgénio contendo MB como foi observado nos estudos anteriores (Figura 7) [25], [31]. Por outro lado, verificou-se que GJS foram abundantemente formadas quando as células foram tratadas com Casodex e 1-25D (Figura 7). No seu conjunto, estes dados sugerem que o mecanismo pelo qual 1-25D previne a degradação de Cx32 e melhora a formação de GJ sobre depleção androgénica é independente da AR.

LNCaP-32 células, semeadas em placas de 6 cm, foram cultivados a 70% de confluência. As células foram então cultivadas durante mais 24 h em meio normal (NS), o meio empobrecido-andrógeno sozinho (ST), soro normal suplementado com Casodex (CDX; NS + CDX), meio empobrecido-androgénio suplementado com MB (CP + MB), MB e Casodex (ST + MB + CDX), 1-25D (ST + 1-25D), 1-25D e Casodex (ST + 1-25D + CDX) e no soro normal com 1-25D (NS + 1-25D ).