Abstract

Embora a apoptose de células endoteliais participa na redução do tumor após a radioterapia de alta dose única, pouco se sabe sobre a resposta vascular após convencionalmente fraccionado a terapia de radiação. Portanto, avaliou-se a hipoxia, a perfusão e alterações vasculares microambiente num modelo ortotópico de cancro da próstata de terapia de radiação convencional fraccionada em doses clinicamente relevantes (fracções de 2 Gy, 5 fracções /semana). Em primeiro lugar, a terapia de radiação convencional fraccionado diminuição da proliferação de células de tumor e aumentou a morte celular com uma cinética comparáveis ​​à radioterapia do cancro da próstata humano. Em segundo lugar, a injecção de Hoechst 33342 ou fluorescentes-dextranos mostraram um aumento da perfusão do tumor no prazo de 14 dias nos tumores irradiado, que foi correlacionada com uma redução clara da hipóxia. Melhora da perfusão e diminuição da hipóxia não foram explicados pelo aumento da densidade dos vasos sanguíneos, o tamanho ou morfologia rede. No entanto, uma maturação vascular de tumor definido por desmina + /células perivasculares SMA + cobertura foi claramente observado juntamente com o aumento em células endoteliais, occludens zonula (ZO) -1, junções intercelulares positivos. Os nossos resultados mostram que, além de matar células de tumor, a maturação vascular desempenha um papel na descoberta reoxigenação tumor durante a terapia de radiação fraccionado

citação:. Potiron VA, Abderrahmani R, Clemente Colmou-K, Marionneau-Lambot S, Oullier t, Paris, F, et ai. (2013) melhorou a funcionalidade da vasculatura durante Convencionalmente fracionado radioterapia do câncer de próstata. PLoS ONE 8 (12): e84076. doi: 10.1371 /journal.pone.0084076

editor: Zhaozhong Han, Alexion Pharmaceuticals, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de junho de 2013; Aceito: 20 de novembro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Potiron et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer du (INCA PAIR próstata-2010), a Association pour la Recherche sur le Câncer, o Ligue Nationale Cancer Contre le e da região Pays de Loire. A fonte de financiamento não estava envolvido na recolha, análise e interpretação dos dados, elaboração do manuscrito e decisão de publicar

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

Apesar de a sensibilidade de tumores à radioterapia (RT) é em grande parte dependente da radiorresistência intrínseca de células estaminais do cancro [1], outros dados sugerem que a sensibilidade do endotélio desempenha também um papel importante [2] . Como resultado de uma produção excessiva de moléculas angiogénicas, vasos sanguíneos em tumores sólidos exibir características, tais como microvasos dilatadas, revestimento endotelial incompleta, compressão pelas células tumorais, a ramificação excessiva e arquitectura altamente irregular. Em um nível celular, uma maturação incompleta dos capilares é observada com células perivasculares ausentes ou isoladas, membrana basal ausente ou muito grosso e falta de junção células endoteliais. Este vasculatura anormal que provoca hipoxia mais impactos a eficácia da irradiação, porque 1) falta de oxigénio reduz a quantidade de espécies de oxigénio reactivas induzidas por irradiação e 2) hipoxia seleciona mutantes células radiorresistentes [3]. Durante a radioterapia fraccionada, a proporção de células hipóxicas aumenta rapidamente após o tratamento, uma vez fracção células normóxicas são preferencialmente e rapidamente morto por irradiação. Nos próximos horas, devido à redução do consumo de oxigénio pelas células danificadas, melhorou de perfusão, e reduzida densidade celular, as células tumorais hipóxicas pode obter um acesso mais fácil à oxigenação, e, portanto, tornam-se mais sensível à fracção subsequente de irradiação. Este processo de reoxigenação Acredita-se que confere uma vantagem terapêutica para CFRT através de uma diminuição progressiva das células tumorais de normóxia e de acesso mais fácil de células hipóxicas ao oxigénio [3].

Os vasos sanguíneos são largamente afectadas por RT, dependendo do número de frações, da taxa de dose, dose total de radiação e tamanho fração [4], [5]. irradiação de alta dose única pode induzir apoptose rápida da vasculatura [6], [7]. Além disso, tanto única de dose elevada e irradiação hipofracionado induzir apoptose celular endotelial, diminuindo assim a densidade vascular [8], com vasos sobreviventes mais dilatada [9], [10]. No entanto, a importância do dano vascular em tumores recebendo terapia de radiação convencional fraccionado (CFRT: 1,8-2 Gy por fracção) é mais controverso [11], [12]. Em vasos sanguíneos do cérebro normais, informações muito recente sugere que, inversamente, a doses maiores, uma Gy irradiação-2 induz apoptose de células endoteliais mínima seguido por um aumento posterior no diâmetro dos vasos, a densidade microvascular e leakiness recipiente [13]. No entanto, as células endoteliais quiescentes são mais resistentes do que a irradiação de proliferação de células endoteliais [14], [15]. Portanto, os efeitos da CFRT sobre o endotélio do tumor pode ser diferente do endotélio normal. Além disso, para entender os efeitos da radioterapia clínica, estudos específicos sobre os vasos sanguíneos do tumor têm de ser conduzidas em modelos ortotópicos uma vez que o grau de hipóxia e vascularização é em grande parte afetada pelo local do enxerto do tumor [16], [17].

para estudar os efeitos da CFRT na vasculatura de tumor e a hipoxia, que seleccionado um modelo de cancro da próstata, porque CFRT até doses totais de 74-80 Gy desempenha um papel importante em doentes com cancro da próstata localizado [18], e porque o resposta de tumores na próstata de irradiação é altamente sensível à hipoxia [19], [20]. Além disso, os cancros da próstata exibir características de prisão crescimento terminal como o modo dominante de morte celular induzida por radiação [21], [22], e isso cinética lenta de morte celular após RT pode, em grande parte afetar reoxigenação tumor. Analisou-se a evolução do tumor e vasculatura estruturais e funcionais e do seu impacto sobre o microambiente do tumor utilizando um esquema de fraccionamento clinicamente relevante (2 × 5 Gy fracções /semana durante 2 semanas), num modelo ortotópico de cancro da próstata. Nossos resultados sugerem que, inversamente à radioterapia hipofracionada, CFRT não afeta densidade de vasos, mas remodela a vasculatura do tumor, aumentando a cobertura perivascular, melhorando a perfusão navio e levando à diminuição da hipóxia.

Resultados

radiação Convencionalmente fracionada controles de terapia tumor da próstata crescimento

Para analisar as mudanças do tumor e seu microambiente durante um protocolo clinicamente relevante da terapia de radiação, nós induzida câncer de próstata ortotópico em camundongos. Duas semanas após as células foram injectados, os animais portadores de tumor receberam uma dose diária de 2 Gy irradiação centrado na parte inferior do abdómen, cada dia da semana, durante duas semanas (convencionalmente radioterapia fraccionada, CFRT; A Fig. 1A). Este protocolo imita as duas primeiras semanas de terapia de radiação para os pacientes de cancro da próstata. Os animais foram sacrificados e analisados ​​a 0 (não irradiado), 1 (2 Gy), 3 (6 Gy), 7 (10 Gy) e 14 dias (20 Gy) durante o tratamento. Como esperado, a irradiação levou a uma diminuição acentuada no peso do tumor em comparação com animais não tratados (irradiados: 237 ± 37 mg vs não irradiados: 777 ± 135 mg, p 0,01, Figura 1B.). Além disso, a irradiação teve um efeito preferencial nas células tumorais em proliferação, em comparação com os tecidos saudáveis ​​adjacentes (Fig. 1C). Redução da proliferação de células era visível a partir do dia 1, e mais pronunciada com o tempo (-54% vs t0 t14 em, p 0,01, figura 1D, E.). Em paralelo, a morte celular aumentou rapidamente no dia 3 (+ 109%, p 0,05) e permaneceu não significativamente mais elevado do que da linha de base depois (Fig 1D, F.). No geral, estes resultados estão em linha com as respostas lentas-cinéticos observados para pacientes com câncer de próstata.

(A) Esquema do protocolo convencional radioterapia fracionada (CFRT) utilizado para o tratamento de tumores de próstata estabelecidos. (B) Peso dos tumores dissecados após o tempo indicado de CFRT. Valores = média ± SEM de n≥6. A comparação estatística versus T14 irradiadas. (C) Exemplo de um tumor tratado durante uma semana, mostrando células tumorais TUNEL + ( “T”) e tecidos adjacentes normais ( “N”), principalmente TUNEL-. Os tecidos tumorais e normais foram identificados com DAPI núcleos com base na morfologia, o tamanho, a intensidade da coloração e organização espacial das células. (D) imagens Pseudo-confocal de tumores durante CFRT, manchado por Ki-67 /TUNEL /CD31. (E, F) Imagem quantificação da proliferação celular (Ki-67, E) e a morte celular (índice de TUNEL, F). As comparações estatísticas vs. t0.

CFRT reduz hipóxia e aumenta a perfusão do tumor

A hipoxia resulta do consumo excessivo de oxigênio pelas células tumorais, bem como anormalidade tumor dos vasos sanguíneos. Para determinar o padrão de hipoxia, um dos principais fatores radiorresistência, durante CFRT, foi utilizado o EF5 marcador extrínseca [23], que destaca grave. ( 0,2% O

2), hipóxia radiobiologically relevante (Fig S1A-C ). superfície EF5-positivo foi moderadamente aumentado no dia 1 (+ 45%), embora não significativamente, com algumas áreas hipóxicas na vizinhança dos vasos sanguíneos, o que sugere que nem todos os vasos foram perfundidos (Fig. 2A-B). No entanto, a hipoxia reduziu em todos os pontos de tempo subsequentes, para alcançar apenas 11,4% de t0 às 2 semanas (p . 0,05, Fig 2A-B).

(A) pseudo-imagens-confocal de tumores durante CFRT, coradas para hipoxia (EF5) e células endoteliais (CD31). (B) Quantificação Imagem do EF5 + superfície em tumores durante CFRT. Os valores representam a média de n≥13 por ponto ± SEM. (C) imagens Pseudo-confocal de tumores perfundidos com Hoechst 33342 e 10 kDa /2 dextranos MDA antes (T0) ou após 2 semanas de CFRT (t14). SYBR Green foi utilizado como um corante de contraste de núcleos de células totais. (D, E, F) quantificação de imagens de Hoechst + (D), e forma (E) e grande (F) de dextrano + superfícies em tumores durante CFRT (n = 6). (B, D, E, F). As comparações estatísticas vs T0.

Para avaliar a funcionalidade embarcação, moléculas fluorescentes de diferentes tamanhos foram injetados por via intravenosa. Grandes (2 Mda dextrano) moléculas que permanecem conta intravascular para perfusão, médio (10 kDa dextrano) para difusão intersticial e pequenas (Hoechst 33342, 616 Da) para a permeabilidade. Enquanto em tumores não-irradiadas, apenas a zonas discretas foram coradas positivamente, a superfície de distribuição de todas as moléculas foi grandemente aumentada após 2 semanas de CFRT e foi mais homogénea (Fig. 2C-F). Distribuição da Hoechst atingiu um valor próximo, o da próstata normal (T0: 0,10 versus T14: 0,33, p 0,01, Figura 2C-D, sendo o normal:. 0.41, S2 Fig.). A superfície total do meio (10 kDa) e grande (2 MDA) dextranos também foi aumentada (T0: 0,011 vs T14: 0,029, P 0,05, Figura 2C, E e T0: 0,0054 versus T14:. 0,010, p 0,05, a Fig. 2C, F), embora não seja comparável aos tecidos normais (0,12 e 0,02, a Fig. S2) como a densidade de microvasos (MVD) Å é 3 vezes inferior em tumor (Fig. S3A-C). Ambos os dextranos permaneceu pontuado, mostrando nenhum sinal de difusão substancial que representaria leakiness vaso (2 MDA) ou a permeabilidade anormal (10 kDa). O aumento semelhante independentemente do tamanho da molécula é consistente com um aumento na perfusão (por exemplo, aumento do fluxo sanguíneo). Curiosamente, não houve aumento significativo na perfusão foi observada nos ácinos próstata normal (Fig. S4A-D). Assim, melhora CFRT preferencialmente perfusão navio no contexto do microambiente do tumor.

CFRT não induz alterações na densidade de vasos, tamanho ou distribuição

Melhoria da perfusão no contexto do tumor quimioterapia tem sido associada com normalização vascular, e potencializa a terapia de radiação [24]. No entanto, alterações da vasculatura associada ao tumor durante CFRT não foram estudados. Por isso, investigou a densidade microvascular e estrutura em tumores irradiados em momentos diferentes. MVD era estável durante o curso de tempo da experiência, de 51 ± 8 microvasos /mm

2 em t0 a 54 ± 7 em T14 (Fig. 3A), ao contrário dos tumores não irradiado, que exibiram um aumento significativo (de 47 ± 7 a 80 ± 8, p . 0,01, Fig S5A, B). De notar que este é muito inferior ao observado na próstata normal com um MVD de 166 ± 6 (Fig S3C, p. 0,01 vs. tumor em t0), o que pode explicar a hipóxia detectada em tumores não tratados. A manutenção do MVD nos levou a determinar se a morte de células endoteliais ocorre durante CFRT. Portanto, nós medimos o índice TUNEL em células CD31 +. CFRT não induziu morte CE (Fig. 3C e D), apesar de uma tendência no dia 1 (+ 28%, p = 0,37) que foi coerente com o mínimo de MVD não significativo no dia 3 (Fig. 3A). Além disso, a quantidade de TUNEL + coloração não foi consistente com dano de células endoteliais maciça. Em seguida, a conta para a heterogeneidade da distribuição dos vasos sanguíneos, determinou-se a distância de células (identificado por DAPI) para o recipiente mais próximo. Utilizando esta análise, o ligeiro e transitório MVD redução observada no dia 3 (Fig. 3A) resultou em uma mudança suave mas unsignificant de células para um ambiente hipóxico, teoricamente, ( 100? M do recipiente mais próxima, a Fig 3B.). No entanto, no momento em que estava ausente e hipóxia perfusão foi aumentada (T14), o perfil de distância de células dos vasos sanguíneos foi idêntico aos tumores não irradiados (T0: 21,3 versus T14: 24,9% das células em mais do que 100 uM). Além disso, os valores eram em grande parte mais distante do que aquelas encontradas na próstata normal (S3A, F). Assim, o aumento da entrega de Hoechst /dextranos observada após irradiação pode ser devido à qualidade do vaso, em vez de quantidade. Portanto, analisamos a morfologia rede de vasos digitalizando tecidos sobre uma espessura de 100 um. No entanto, em comparação com tumores não irradiados, os tumores colhidos no dia 14 durante CFRT não mostraram qualquer diferença no navio ramificação (T0: 8,9 filial /mm vs. t14: 7,6, p = 0,32; Fig 3E, F.), Diâmetro (T0: 9,5 uM versus T14: 8,6 mm, p = 0,21). No geral, estes resultados indicam que a hipóxia /perfusão aumentada reduzido durante CFRT não se correlaciona com melhor densidade vascular, topografia ou morfologia.

(A) densidade de microvasos em tumores durante CFRT. Os valores representam a média de n≥13 por ponto ± SEM. (B) perfil Distância entre as células e os vasos sanguíneos mais próximo, a partir de tumores durante CFRT. Os perfis são baseados em n≥13. As comparações estatísticas vs T0. imagens (C) Pseudo-confocal de vasos sanguíneos associados a tumores (CD31 +) corada para TUNEL durante CFRT. Setas: TUNEL + /CD31 + células. (D) quantificação Imagem de CD31 + /TUNEL + superfície. Os valores representam a média de n≥13 por ponto ± SEM. (E) imagens Z-stack representativa de 100 secções de tumor mm de espessura antes (T0) ou após 2 semanas de CFRT (t14) e corados para os vasos sanguíneos (CD31 + /Fli-1 +). (F) A análise de imagem da rede de vasos sanguíneos a partir de 100 secções de tumor mm de espessura. Os valores representam a média de n = 9 por ponto ± SEM.

CFRT induz maturação do

parede vascular

vasos tumorais anormais muitas vezes apresentam parede endotelial não-contínua, resultando em permeabilidade exacerbada e leakiness. Para apreciar a coesão da parede endotelial, que coradas para zonula-occludens (ZO) -1, uma proteína envolvida na junções apertadas. Endotelial (CD31 +) – específico índice de ZO-1 foi significativamente regulada positivamente após 2 semanas de CFRT (+ 38% de t0, p. 0,05; Figura 4A, B). Mais importante ainda, esta foi associado com o aumento da cobertura das células endoteliais por células positivas alfa actina de músculo liso (SMA) (+ 111% de t0, p 0,05; Fig. 4A, C). Por microscopia confocal e análise de histograma, ZO-1 foi confirmado ser endotelial (no interior das células que expressam CD31) e expresso de forma contínua, especificamente após irradiação (Fig. S6A-B). Em frente, a SMA foi não-endotelial e justaposta à parede endotelial. Para precisa a natureza das células perivasculares, os tecidos foram co-coradas para desmina, um marcador de pericitos [25]. Além do índice de SMA, desmina + células perivasculares também foram aumentados (T0: 0,034 vs T14: 0,065, P 0,01; Figura 4D.). Além disso, a SMA e desmina foram co-expressos pelas mesmas células (Fig. 4E, F). Além disso, a frequência de desmina + /SMA + coberto navios dobrou entre o dia 0 e no dia 14 de CFRT (T0: 20,0 vs. t14: 39,4, p 0,05). De nota, SMA e desmina foram também co-expresso nos raros cobertos navios não irradiados (Fig. S7). Na próstata normal, desmina foi expresso por ambos os micro (intra-ácinos) e macro (inter-ácinos) -vessels, embora SMA foi estritamente restritos a macro-vasos (Fig.S3A, D-E, a Fig. S8A-B). Além disso, não sobre-regulação da SMA foi detectada em microvasos normais irradiadas (Fig. S9A, C), nem em microvasos de tumor não-irradiadas (Fig. S5C, D). Assim, o aumento da desmina células perivasculares + /SMA + é específico de microvasos tumorais irradiadas.

(A) pseudo-imagens-confocal de vasos sanguíneos do tumor durante CFRT e coradas para ZO-1 /CD31 (parte superior) ou SMA /CD31 (parte inferior). (B, C). quantificação imagem de superfícies ZO-1 + /CD31 + (B) e peri-CD31 + SMA (C). Os valores representam a média de n≥13 por ponto ± SEM. (D) quantificação Imagem do peri-CD31 + superfície desmina e frequência de desmina vasos + /SMA +. (B, E, D) As comparações estatísticas vs. t0. (E) imagens confocais representativos de um vaso sanguíneo de um tumor tratado durante 14 dias coradas para CD31 /desmina /SMA. (F) a análise do histograma de CD31 /desmina /SMA perfil pseudo da imagem confocal secção transversal.

Discussão

Apesar de vários estudos sugerem que a irradiação leva à destruição do navio, o efeito da convencionalmente irradiação fracionada tem sido largamente inexplorado. Nós usamos um modelo ortotópico de câncer de próstata com um esquema de fracionamento clinicamente relevante, induzir a morte celular modesta, aumentando prisão proliferação, com efeitos a dose eo diferencial entre células /tumorais normais. Descobrimos que CFRT quase anulada hipoxia tumoral após 2 semanas de tratamento, em conjunto com um aumento da perfusão. Inesperadamente, estes efeitos não foram associados com mudanças significativas na morfologia ou densidade de vasos, mas sim com a maturação fenotípica da parede vascular, incluindo células endoteliais (CD31 + /ZO-1 +) e pericitos (desmina + /SMA +). No geral, estas observações indicam que a adaptação vascular desempenha um papel descoberto na reoxigenação tumor durante a radioterapia fracionada.

Nós não observamos um aumento drástico nas células endoteliais apoptóticas 24h após a diária 2 irradiações Gy, e MVD manteve-se estável, consistente com informações recentes nos vasos sanguíneos cerebrais normais [13]. Estes resultados estão em contraste com estudos anteriores utilizando a irradiação de dose mais elevada, em que foi relatada a morte da célula endotelial e declínio na densidade de vasos, embora a pontos de tempo anteriores [2], [4]. Particularmente, as fracções de 4 e 12 Gy durante 2-3 semanas levaram a um aumento da morte celular endotelial e diminuiu MVD tumores subcutâneos em [8], [9], [10]. Isto é surpreendente uma vez que a apoptose endotelial Pensa-se que ocorrem apenas em doses únicas ≥ 10-15 Gy [2], [4]. No entanto, a morte CE pode depender da configuração do tumor, uma vez que alterações vasculares apenas pequenas foram observados 24 horas após uma única dose de 15 Gy em outro modelo de cancro da próstata [26]. Os estados diferentes de células endoteliais entre estudos pode explicar as diferenças em radiossensibilidade, uma vez que as células endoteliais quiescentes são mais resistentes a danos no ADN induzidos por irradiação, mas não à morte a curto prazo, induzida por membrana celular [14] [15]. Isto pode explicar que os aumentos observados na cobertura pericíticas e perfusão só foram significativas no compartimento tumor irradiado, onde o ambiente microvascular pode ser mais responsivo /permissiva. Estes resultados ilustram a complexidade da vasculatura do tumor e a sua resposta aos tratamentos heterogénea. Talvez a importância de uma configuração ortotópico é muitas vezes subestimados, uma vez vasos sanguíneos exibir forte heterogeneidade entre os órgãos (por exemplo, a expressão do receptor de androgénio para o endotélio da próstata, a barreira sangue-cérebro, etc ..). De facto, os tumores derivados de PC3 crescidos subcutaneamente tem substancialmente maior tamanho do vaso e densidade (x3 ≈, dados não mostrados). Mais importante ainda, estudos recentes utilizando doses mais elevadas de fracções estão de acordo com o nosso trabalho para uma diminuição da hipóxia tumoral e aumento da perfusão, juntamente com a cobertura pericyte [9], [10], com exceção de um relatório usando muito elevado (30 Gy) em dose única irradiação [ ,,,0],27]. Colectivamente, estes estudos sugerem que o aumento da cobertura perivascular pode desempenhar um papel essencial na perfusão navio e reoxigenação após a irradiação fracionada.

A preservação da vasculatura agora é visto positivamente para tratamento de câncer, devido ao conceito de normalização vascular. O conceito para além desta observação foi que destruir a vasculatura iria produzir hipóxia que torna a irradiação menos eficaz. A observação inicial de que a inibição da angiogénese overproductive com um anticorpo anti-VEGFR2 recruta pericitos e regula negativamente temporariamente hipoxia tumoral [24]. Desde descontrolada surgimento CE tem sido associada com angiogénese não-funcional, poda induzida por irradiação de brotos vasculares podem resultar numa diminuição da complexidade da rede e melhorando a perfusão [15]. No entanto, não encontramos características-chave que caracterizam vasos sanguíneos normalizados desde ramificação, MVD, tortuosidade e diâmetro do vaso foram inalterada. Embora perfusão foi semelhante em alguns aspectos à do próstata normal, fenótipo vaso foi distinta, com maior ZO-1 em vasos irradiados do que o que é normalmente encontrado. Além disso, na próstata normal, o perímetro dos micro-vasos foi consistentemente desmina + /SMA-, enquanto que a expressão SMA foi estritamente restritos a grandes navios, inter-acini. Esta hierarquia vascular também é encontrado em amostras humanas [28]. Em contraste, a irradiação do tumor micro-vasos (≈ 10 um de diâmetro) adquirida expressão SMA perivascular. Estes dados indicam que a parede do vaso pode diferenciar a seguir unicamente a irradiação, consistente com outros relatórios sobre a resposta celular inflamatória perivascular ao stress (TGFb, PDGFb).

expressão aberrante de proteínas juncionais endoteliais, incluindo ZO-1, pode ocorrer na ausência de polarização celular endotelial [29] ou pouco tempo (por exemplo, min.) após irradiação [30]. No entanto, o aumento da endotelial ZO-1 aqui observada depois de 2 semanas está provavelmente relacionada com a estabilização vaso uma vez que 1) os nossos dados de perfusão sugerem que a maioria dos navios são eficientemente lumenized e 2) o padrão de ZO-1 é membranosa, linear e contínuo. Quanto à maturação perivascular, a estreita associação com células endoteliais contrastadas-CD31 ea presença de dois marcadores (desmina /SMA) identificar as células circundantes como pericitos [25]. células perivasculares são reguladores importantes da formação vascular, estabilização, remodelação e funcionar para gerar um vasculatura madura, quiescente [31]. A maturação dos vasos ocorre através de sinalização parácrina recíproco onde factores CE-derivados atrair pericitos e depois a favor do estabelecimento das junções de células endoteliais [32]. De importância, pistas secretado-pericyte proteger ECs da morte induzida por radiação

in vitro

[33]. Isto sugere que os navios sem cobertura pericyte seria mais vulnerável a irradiação, como a hipótese recentemente por Chen et al [9]. Por conseguinte, os regimes de irradiação fraccionado, que permitem a maturação vascular, pode melhorar a função vascular do tumor.

Os nossos dados indicam uma redução da fracção hipóxica após duas semanas de tratamento e estão de acordo com dados recentes em tumores subcutâneos [9 ], [10], [34]. reoxigenação tumor foi definida como o conceito de que as células tumorais hipóxicas cronicamente obter um melhor acesso ao oxigénio durante a radioterapia fraccionada porque as células tumorais aeróbias são eliminados por fracções anteriores [35]. No nosso modelo, reoxigenação tumor ocorreu não só no âmbito da diminuição da proliferação de células tumorais e aumento da morte celular, mas também com uma funcionalidade melhorada da vasculatura evidenciado por perfusão e difusão de moléculas pequenas. Isto significa que a reoxigenação de tumor não é apenas devido ao aumento de morte de células tumorais e um menor consumo de oxigénio, mas também para uma melhor distribuição de oxigénio por vasos sanguíneos. Em diferentes modelos de tumores experimentais, bem como em estudos clínicos, foi mostrado heterogeneidade intertumoral na cinética de oxigenação durante fraccionado [36], [37], [38], [39]. Por exemplo, em carcinomas de células escamosas, hipóxia diminuiu durante CFRT na maioria das linhas de tumores, enquanto que em algumas linhas celulares tumorais foi observado um aumento de temporais ou nenhuma alteração e fração de vasos perfundidos e área vascular mostrou apenas mudanças modestas [34]. Além disso, nossos resultados sugerem que durante CFRT, estabilização dos vasos é necessário para que os 2

nd frações semana tornar-se mais eficiente. Enquanto há um crescente interesse em altas doses protocolos hipofracionados, especialmente em pacientes com câncer de próstata [40], estes dados levantam a questão de saber se tais protocolos preservar a vantagem de aumentar os níveis de oxigênio e, assim, o índice terapêutico [41]. Em outros modelos de tumor no entanto, hipofracionado (3 Gy /fracção radioterapia) melhorou a oxigenação apenas durante a fase inicial do tratamento, mas levou a uma diminuição considerável da oxigenação do tumor na fase posterior de irradiação ( 45 Gy) [42]. Assim, mais conhecimento é necessário sobre a influência da maturação vascular na radiossensibilidade das células tumorais.

Em resumo, descobrimos que a irradiação convencionalmente fracionados induz a maturação vascular, juntamente com o aumento da perfusão /diminuiu hipóxia. Estes resultados implicam que o microambiente vascular desempenha um papel na reoxigenação tumor, para além dos efeitos conhecidos sobre as células tumorais. Não está claro se os protocolos hipofracionados pode permitir a maturação vascular ou em vez levar a esterilização vascular e hipóxia. O impacto de tais protocolos sobre os vasos sanguíneos do tumor e no resultado clínico deve ser a perspectiva de novos estudos

Materiais e Métodos

tumorigênese e próstata Ortotópico coleta de tecido

Seven. camundongos -week macho velho NMRI-nuas (Janvier, São Berthevin, França) foram anestesiados com cetamina /xilazina (50/15 mg /kg) e 2 × 10

6 células PC3-luc (Caliper Life Sciences, Villepinte, França ) foram injectados no lobo esquerdo do dorso-lateral da próstata por cirurgia. Após duas semanas, a absorção do tumor foi verificada por luminescência utilizando um PhotonImager (BiospaceLab, Paris, França) e grupos com a bioluminescência sinal de tumor semelhante foram formados. As experiências começaram 3 dias mais tarde. Quando adequado, os animais foram sacrificados, os tecidos foram excisados ​​e pesados, se necessário, e congelou-se (-80 ° C) incorporado em meio de outubro (Sakura Finetek, Villeneuve d’Ascq, França). As amostras foram coletadas no momento da fração CFRT seguinte, para analisar estado do tumor no momento em que ele deve ser tratado

.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Directiva Europeia 2010/63 /UE e aprovado pelo Comitê animal Care e Use o local (Comité d’Ethique en Experimentação animal des Pays-de-la-Loire, C2EA-06).

In vivo

hipóxia e perfusão

A hipoxia e perfusão foram determinados utilizando marcadores específicos que foram administrados iv em tampão de soro fisiológico. Para a hipóxia, a 300 ul de 3 mg /ml EF5 (hypoxia-imaging.org) foram injectados 2 h antes de sacrificar [23], [43] enquanto que 300 uL de marcadores de perfusão mistos (1,6 mg /ml de Hoechst 33342, 0,6 mg /mL de Alexa

647-10 kDa dextrano e 3 mg /ml de rodamina-dextrano 2 MDa; Life Technologies, Saint Aubin, França) foram injectados 3 min à frente da recolha de tecidos [44] Os tecidos foram congelados instantaneamente, cryosected, contrastadas com SYBR Green (Fisher Scientific, Illkirch, França) para núcleos de células totais e montadas em Prolong ouro sem DAPI (Life Technologies).

a radioterapia

irradiações foram realizadas utilizando um irradiador de raios-X CP-160 (Faxitron, Lincolnshire, IL) com um filtro de Cu 0,3 milímetros, uma voltagem de aceleração de 160 kV e uma taxa de dose de 1,3 Gy /min. Os animais receberam uma dose (fração) de 2 Gy por dia de segunda a sexta, durante duas semanas, centrado em um campo abdômen inferior de 2 cm × 2 cm, utilizando escudos de chumbo destinadas a minimizar a irradiação para os tecidos e ossos (quadris) normais. Este esquema (definida aqui como convencionalmente radioterapia fracionada, CFRT) é a prática clínica padrão para o câncer de próstata

Imunohistoquímica

Os tecidos foram cryosected a 5 espessura mm. (Exceto para análise de rede: 100 mm) , fixadas com 4% de paraf ormaldeido e permeabilizadas com 0,05% de Triton-X100. IHC foi feito utilizando a coloração padrão e procedimentos de lavagem [45]. Para a coloração múltipla, os anticorpos foram incubados sequencialmente: a primeira, durante a noite, seguida da sua fixação secundária e, em seguida, CD31 como o segundo e o terceiro SMA como. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: rato anti-CD31 (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, França), de coelho anti-ZO-1 (Life Technologies), de coelho anti-desmina (Ozyme, St-Quentin-en Yvelines, França), de coelho anti-Ki67 (Dako, Les Ulis, França), de coelho anti-FLI1 (Fisher Scientific) do mouse Alexa488 conjugado anti-EF5, Cy3 conjugado rato anti-alfa actina de músculo liso (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, França). Os anticorpos secundários foram: Alexa

cabra 647 conjugado anti-coelho, Alexa

cabra 488 conjugado anti-rato (Life Technologies). TUNEL foi realizada como recomendado pelo fabricante (Roche, Boulogne-Billancourt, França) como o último passo de coloração. As lâminas foram montadas em Prolong ouro com DAPI (Life Technologies) para contracoloração núcleos (exceto para o ensaio de perfusão).

As lâminas foram observadas em Axiovert 200M ApoTome ( “pseudo-confocal”) microscópio, com Axiovision 4,8 software ( Carl Zeiss, Le Pecq, França). Mosaicos de campos até 4 mm

2 foram registados no objectivo 63x óleo, e quatro passos de Z-1? M foram empilhados para uma imagem. Fatias de espessura de 100 um foram normalmente registado na ≈ 60 Z-passos de 1 uM, devido ao achatamento do tecido após a desidratação. A microscopia confocal foi feito com um A1R (Nikon Instruments, Champigny-sur-Marne, França) com o software NIS-Elements, uma abertura numérica de 1 e fatia média de digitalização de 4.

A análise de imagem

As análises foram feitas em imagens de 16 bits originais não comprimidos de mosaicos de alta resolução (pseudo-confocal), exceto para a distribuição de cor ao longo navio secções transversais (confocal; “análise de histograma”, ver mais adiante). Dois tipos de valores foram registados: valores para as análises baseadas na superfície correspondem às superfícies de coloração (iM

2) considerado positivo para a coloração de interesse (por exemplo, a área de CD31) dividida pela superfície da região de interesse (ROI; ex , tecido total); Os valores das análises baseadas no objecto corresponde ao número absoluto de elementos considerados positivos (ex, número de navios), dividida pela superfície da ROI (ex, tecido total).

análises baseadas na superfície foram realizadas utilizando o ImageJ software 1.46r (Institutos nacionais de Saúde, EUA).