Abstract
carcinoma de células escamosas oral Oral (CEs) pacientes diagnosticados em estágios avançados têm limitado opções de quimioterápicos ressaltando a grande necessidade para o desenvolvimento de novos agentes anti-cancro para a gestão da doença mais eficaz. Procurou-se investigar o potencial anti-cancro de Apaziquone, [EOquin, USAN, E09, 3-hidroxi-5- aziridinil-1-metil-2 (1H-indol-4,7-diona) -prop-β-en-α- ol], a que pertence a uma classe de agentes anti-câncer pró-droga chamada agentes alquilantes biorredutores, por CCEO. proliferação celular inibida tratamento Apaziquone e induziu apoptose em células de CCEO
in vitro
. Apaziquone trataram células de CCEO mostrou aumento da ativação da caspase 9 e caspase 3 e Poli (ribose ADP) polimerase (PARP) clivagem sugerindo a indução de apoptose por apaziquone em células de câncer bucal. Mais importante, o tratamento apaziquone reduziu significativamente o volume do xenoenxerto de tumor por via oral em ratinhos NOD /SCID imunocomprometidos /Crl, sem causar toxicidade aparente para os tecidos normais. Em conclusão, nosso
in vitro
e
in vivo
estudos identificados e demonstraram a eficácia pré-clínica de Apaziquone, como um potencial candidato terapêutica anti-câncer de romance para a gestão de câncer bucal.
Citation: Srivastava G, Somasundaram RT, Walfish PG, Ralhan R (2015) Anticancer Atividade de Apaziquone em células de cancro oral e Xenoenxerto Modelo: implicações para a terapia do cancro oral. PLoS ONE 10 (7): e0133735. doi: 10.1371 /journal.pone.0133735
editor: Pei-Yi Chu, Faculdade de Medicina da Universidade Católica Fu Jen, TAIWAN
Recebido: 06 de fevereiro de 2015; Aceito: 30 de junho de 2015; Publicação: 24 de julho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Srivastava et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. o apoio financeiro deste trabalho foi fornecida por Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Os financiadores aprovou o desenho do estudo, mas não teve nenhum papel na recolha de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os autores agradecem os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde para presidente em cancro avançado Diagnostics (RR), e Alex e Simona Shnaider Cadeira no cancro de tiróide (PGW)
Conflito de interesses:. PGW e RR são acionistas Proteocyte Diagnostics Inc. Além disso, o apoio financeiro deste trabalho foi fornecida por Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
carcinoma de células escamosas oral (CCEO) abrangem um grande segmento da contabilidade do câncer de cabeça e pescoço para cerca de 263.000 novos casos e cerca de 127.000 mortes por ano no mundo [1]. Início de carreira pacientes com tumores (II I e) são tratados com cirurgia e /ou radioterapia, e têm taxas de sobrevivência de cinco anos de 70% – 90% [2-4]. No entanto, dois terços de pacientes com tumores sofrem de loco-regionais de doença avançada (estádios III e IV) no momento do diagnóstico. Não existem dados insuficientes de ensaios clínicos randomizados para definir uma estratégia ideal para pacientes com estágios III e IV CEB. Pacientes com doença avançada ou recorrente têm limitado opções de tratamento e um prognóstico pobre (taxas 50%) [5]. cirurgia primária e radioterapia definitiva são opções para pacientes com tumores; tanto a cirurgia e a radioterapia podem ter um profundo efeito sobre a qualidade de vida dos sobreviventes [6, 7].
Nos últimos anos, a aplicação de quimio-radioterapia concomitante surgiu como uma alternativa atraente ao tratamento cirúrgico da tradicional avançada CCEO [8-10]. É digno de nota que a quimioterapia tem evoluído de cuidados paliativos para um componente central de tratamento curativo para CEB localmente avançado. A cisplatina, carboplatina, metotrexato e taxanos são activos como agentes únicos ou em combinação em recorrente ou metastático CEB [3, 11-14]. No entanto, as toxicidades limitativas da dose em doentes com cancro limitar a sua utilidade clínica. Actualmente, não existe qualquer regime de quimioterapia de segunda linha de padrão para o tratamento de carcinoma epidermóide estudados recorrentes ou metastáticos. Monotargeted terapias, tais como inibidores do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3), factor nuclear kappa B (NFkB), e o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) mostraram uma eficácia limitada [15-18 ]. Assim, existe uma grande necessidade de desenvolvimento de novos medicamentos para o cancro oral. No entanto, a descoberta de novos compostos com actividade anti-cancro potente é um processo longo e caro. Uma abordagem alternativa é a exploração de medicamentos já estabelecidos que tenham sido aprovados para uso clínico para outros cancros.
Apaziquone [EOquin, USAN, E09, 3-hidroxi-5- aziridinil-1-metil-2 (1H indole-4,7-diona) -prop- β-en-α-ol] é um pró-fármaco que pertence a uma classe de agentes anti-câncer chamado agentes alkylaing biorredutores que sofreu uma extensa avaliação clínica para o cancro da bexiga [19] . Apaziquone é activada por várias enzimas, o enzima mais estudado sendo NAD (P) H: quinona oxidorredutase 1 (NQO1) ou DT-diaforase, o que reduz apaziquone em um agente de alquilação de ADN [19]. Aqui em nós investigamos o potencial atividade anti-tumoral de Apaziquone em
in vitro Comprar e
in vivo
modelos de câncer bucal.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e culturas de células
linha escamosas oral de células de carcinoma de células AMOS III, foi estabelecida a partir de betel e tabaco associada CCEO humana pelo nosso laboratório [20]. AMOS III foi usado como um
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e
in vivo
modelo experimental para o câncer bucal neste estudo. Outra linha de células de CCEO estabelecida, SCC4, tem sido utilizado para avaliar a aplicabilidade mais ampla de apaziquone para o potencial terapia do cancro oral da CEB. A linha de células de cancro não metastático oral, SCC4, foi obtido da American Type Culture Collection (ATCC). células cancerosas Oral (AMOS III /SCC4) foram cultivadas em Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1 mmol /l de L-glutamina, e penicilina-estreptomicina (1X) numa incubadora humidificada (5 % de dióxido de carbono, 95% de ar) a 37 ° C como descrito anteriormente [20-22]. Ambas as linhas celulares foram testadas usando análise de curta repetição em tandem polimorfismo e estão sendo rotineiramente propagado em nosso laboratório.
In vitro a proliferação celular /ensaio de citotoxicidade (MTT)
A capacidade de apaziquone para induzir efeitos citotóxicos foi determinada pela conversão de ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) em formazano por desidrogenases mitocondriais. células cancerosas orais (AMOS III e SCC4) foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços em meio completo. As células foram cultivadas a aderir durante a noite e, em seguida, expostas a várias concentrações de apaziquone [5 nM a 100 pM], durante 24 a 96 horas para determinar a dose e a inibição dependente do tempo da proliferação celular. A proliferação celular foi medida por adição de MTT às células. Resumidamente, MTT foi dissolvida em PBS estéril e adicionado aos poços a uma concentração final de 1,5 mM. As células serão incubadas com MTT durante 4 horas, o meio foi removido e as restantes cristais de formazan foram dissolvidos em DMSO. A absorvância de formazano solubilizado foi medida a 540 nm utilizando um espectrofotómetro de varrimento multi-poços. A percentagem de inibição da proliferação celular foi calculada em cada ponto de tempo e da dose da seguinte forma: (A
controle – A
tratada /A
controlo) × 100.
Em LD vitro
50 medições para apaziquone
para determinar a potência de apaziquone para causar morte celular das células cancerosas orais, a sua LD
50 foi determinada utilizando células cancerosas orais AMOS III e células SCC4. Para determinar a concentração de apaziquone necessária para matar 50% das células (LD
50), 5000 células de cada linha celular foram plaqueadas em triplicado em cultura de tecidos de zero fluorescência tratada placas de 96 poços (BD Biosciences, Mississuaga, ON, Canada ). Após incubação durante a noite, o meio foi substituído por meio contendo apaziquone numa gama de concentração de 5 nM to100μM. Após 48 horas, o ensaio de azul de alamar foi realizada para determinar a viabilidade celular.
Ensaio de Apoptose
Para verificar os resultados de ensaios de viabilidade celular, a Anexina V e iodeto de propídio (PI) era de dupla marcação utilizado para quantificar a apoptose. células AMOS III foram tratados quer com veículo sozinho ou apaziquone a 500 nm durante 48 horas. As células foram marcadas com Anexina V-FITC e PI utilizando o kit de ensaio de Anexina V seguindo as instruções do fabricante (Sigma, St Louis, MO) e analisados utilizando o BD celular Quest Software Pro. Estes resultados foram ainda verificados usando análise de Western blot para caspases específicos e Poli (ADP-ribose) polimerase ensaio (PARP).
análise do ciclo celular por citometria de fluxo
A mídia cultivado a partir tratada, veículo células AMOS III apaziquone tratados controle e foram recolhidas e centrifugadas para recolher as células não aderentes. As células aderentes foram lavadas com PBS (pH 7,4) e tripsinizadas. Ambas as populações de células não-aderentes e aderentes foram reunidas para posterior análise. As células foram fixadas em etanol a 70% (-20 ° C, durante a noite) e foram ressuspensos em tampão contendo PBS (pH 7,4), EDTA (0,5 mol /L, pH 8,0), Triton X-100 (0,05%), a RNase A ( 50 ug /mL), e PI (100 ug /ml) antes da análise por citometria de fluxo.
ensaio TUNEL
ensaio TUNEL foi realizada seguindo as instruções do fabricante. Apaziquone-tratadas e as células de controlo com veículo AMOS III foram recolhidas como descrito acima. Rotulagem e ensaio foi realizado seguindo as instruções do fabricante, e os resultados foram analisados usando microscopia de varredura a laser confocal.
In vivo
atividade antitumoral do Apaziquone no modelo de xenoenxerto de carcinoma de células escamosas oral humana
a
In vivo
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética animal da Mount Sinai Hospital antes do início e animal atendimento foi feito de acordo com o Centro de Toronto de Phenogenomics (TCP) diretrizes para considerar o bem-estar dos animais e minimizar o sofrimento. Um estudo pré-clínico foi realizado para comparar a eficácia de várias concentrações de apaziquone e controlo do veículo num modelo animal de SCC oral humana. O pré-determinada concentração /dose mais eficaz de apaziquone foi levado adiante para
in vivo
testes em modelos de ratos de xenotransplante de cancro oral. Dois meses do sexo masculino de idade NOD imuno-comprometido /SCID /CRL # 394 ratos foram subcutaneamente (sc) implantado com 1 x 10
6 células cancerosas em meio livre de soro para a região do flanco para estabelecer tumores, em conformidade com as diretrizes Institutional Animal Care . Quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 100-200 mm
3, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos (n = 6 /grupo) de acordo com os volumes tumorais e os pesos corporais para os seguintes tratamentos: o controlo não tratado veículo (0,1% DMSO -n = 6) e grupo tratado com apaziquone do estudo (n = 6). No braço apaziquone do estudo, os ratinhos portadores de tumores receberam instilações intraperitoneais de apaziquone a 0,1 mg /kg de peso corporal ou de controlo de veículo em DMSO a 0,1%, 8 semanas após a implantação do tumor. O tratamento com drogas foi continuada durante 6 semanas. incidência de tumores, o volume do tumor, peso e sobrevida global e mediana de animais foram registrados. Os ratinhos foram monitorizados duas vezes por semana para todos os sinais e sintomas. Na conclusão do estudo, foi colhido sangue da veia safena magna de ratos para um teste de função completa análise da contagem de sangue e de órgãos antes da anestesia. Os ratos foram então sacrificados por deslocamento cervical ou mais cedo se tumores superiores a 20% de massa corporal e /ou se os ratos mostram quaisquer sinais clínicos de palidez, curvado, dispnéia e movimento anormal. Após a eutanásia, os órgãos foram recolhidos e imediatamente fixados em formalina. O volume do tumor foi medido. Os tumores foram então colhidas e uma fatia linha média cara de corte antero-posterior do tumor foi fixada em formalina. A periferia do tumor e centro foi cortado e flash congelado em nitrogênio líquido em frascos separados. imuno-histoquímica de Ki67 (IHC) foi realizada utilizando cortes de tecido FFPE (espessura 4 mm) de tumores tratados e de controlo apaziquone veículo xenoenxertos de ratinhos do Grupo seguindo o procedimento tal como descrito por nós anteriormente [23]. As lâminas foram incubadas com anticorpo anti-Ki67, a uma diluição de 1: 100 (Abcam, Cedarlane Labs, Burlington, ON, Canada) durante 1 h e o anticorpo secundário de coelho durante 20 min, seguido de reagente de Vectastain Elite ABC (Laboratórios Vector, Burlingame, CA) utilizando diaminobenzidina como o cromogénio. Nas secções de tecido de controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por IgG específicos de isotipo de rato não imune /coelho. As secções foram avaliadas por exame microscópico de luz. Hemotoxilina Eosina (H E) coloração também foi realizado em secções de tumor do rato de xenotransplante embebidos em parafina
A análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o software SPSS 20.0 (Chicago).. A significância estatística foi determinada utilizando o teste t pareado de Student bilateral. Uma probabilidade de P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Estas
in vitro
estudos determinaram LD
50 apaziquone de que foi utilizado para orientar a dose de apaziquone para ser usado nos
In vivo
estudos e estabelecer o modo de morte celular nas células de câncer bucal.
resultados
Efeito da apaziquone em células de câncer bucal
As curvas de resposta de dose apaziquone em células AMOS III e SCC4 são mostrados na figura 1. O LD
50 de apaziquone em AMOS III e SCC4 células foram 500 nM e 1? M, respectivamente (Fig 1).
Alamar ensaio azul foi realizada para determinar a sub> 50 de apaziquone em AMOS III, e SCC4 células LD
análise da expressão de proteínas apoptóticas por Western Blotting
proteínas extraídas de células AMOS III não tratados e apaziquone tratados foram analisados através de Western blot de PARP, Caspase 9 e caspase 3. Com o aumento da dose Apaziquone de expressão de todo o comprimento da caspase 9 e proteína diminuiu a caspase 9 aumentaram, enquanto que a expressão de PARP clivada e caspase 3 clivada aumentada. (Fig 2A e Fig S1) e efeito semelhante de Apaziquone foi observada em células SCC4 sobre estas proteínas (Fig 2B e Fig S1), confirmando a indução de apoptose por tratamento apaziquone em ambas as linhas celulares de cancro orais.
Igual quantidades de proteínas em extractos de células livres preparadas a partir de Amos III e células SCC4 tratados com diferentes doses de Apaziquone (250 nM, 500 nM e 1 uM) e, assim como as células de controlo tratados com veículo não tratadas foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVP, sondado com anticorpos específicos e detectadas utilizando ECL. Painéis mostrar- células (A) AMOS III e (B) células SCC4. Um aumento dependente da dose na PARP clivada, caspase 9 e caspase 3 foi observada em ambas as linhas celulares de cancro orais testadas. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.
Apaziquone induzida morte celular por apoptose medida pelo Ensaio de túnel
Túnel ensaio realizado em células AMOS III mostraram um aumento fragmentos de ADN nas células tratadas Apaziquone , em comparação com células de controlo tratado com veículo não tratados (figura 3).
III AMOS células tratadas Apaziquone mostram fragmentos de ADN aumentada em comparação com as células não tratadas de controlo do veículo que descreve um aumento da apoptose em células tratadas com droga.
morte celular por apoptose induzida Apaziquone medido por Anexina V ensaio
ensaio de Anexina V realizados em células AMOS III apaziquone tratadas utilizando FACS mostrou um aumento significativo na apoptose precoce e tardia em células tratadas Apaziquone (38%) como comparado para o não tratada (5%) e as células de controlo tratados com veículo (8%) (Fig 4A).
(a) Apaziquone células tratadas AMOS III apresentaram aumento significativo na apoptose precoce e tardia (38%), em comparação com as células não tratadas (5%) e veículo de controlo (8%) por ensaio de anexina V. (B) Apaziquone trataram células AMOS III mostram significativamente maior número de células no Sub G
o de fase e
fases 2M, em comparação com o controlo não tratado células G AMOS III.
Apaziquone induzida morte celular por apoptose medido pela análise do ciclo celular
análise do ciclo celular de apaziquone trataram células AMOS III mostraram significativamente maior número de células no sub G
o e G
fases 2M, em comparação com a não tratada células de controlo confirmando aumento da apoptose em células tratadas com droga (Fig 4b).
In vivo
actividade anti-tumoral de apaziquone
O
in vivo
antitumoral actividade de apaziquone foi avaliada em modelos de xenotransplante de cancro orais em imuno-comprometido ratinhos macho NOD /SCID /# CRL 394. Não houve alteração significativa no peso corporal dos murganhos no grupo tratado apaziquone ou ratinhos de controlo não tratados de veículo ao longo de 42 dias de tratamento (Figura 5A). O crescimento do tumor foi significativamente retardada por apaziquone (dose de 0,1 mg /kg), o tratamento durante este período de tempo. Esta dose foi seleccionada a partir do estudo piloto que foi realizada utilizando doses múltiplas varia de 0,05 mg /kg a 0,5 mg /kg de peso corporal. No grupo de tratamento, o volume médio do tumor foi de 220,05 milímetros
3 (SD-19.76) em comparação com o volume tumoral médio de 376,18 mm 3 (SD-54,08) no grupo de controlo com veículo não tratada. Este estudo mostrou que o tratamento apaziquone retardou significativamente o crescimento tumoral (valor de p 0,001, emparelhado de duas caudas t de Student entre os grupos tratados e não tratados; Fig 5B e 5C).
(A) Nenhuma mudança significativa na peso corporal foi observada em camundongos tratados apaziquone ou os ratos de controlo do veículo, durante o curso do tratamento. (B) Efeito do tratamento apaziquone no tamanho do tumor em ratinhos. tumores excisados representativos que descrevem a diferença no tamanho dos tumores entre apaziquone tratados e os ratinhos do grupo de controlo não tratado. (C) Efeito de tratamento Apaziquone no retardamento do crescimento tumoral. xenoenxertos de tumores desenvolvidos nos flancos de ratinhos NOD /SCID /CRL foram administrados com apaziquone (0,1 mg /kg de peso corporal) injecções intraperitoneais semanalmente durante 6 semanas. tratamento Apaziquone atrasou o crescimento de tumores significativamente (valor de p 0,001, emparelhado de duas caudas teste t de Student) em murganhos do grupo de tratados com o fármaco, em comparação com os ratinhos nos grupos de controlo ou de veículo de controlo não tratados. (D) Efeito do tratamento Apaziquone no rim e no fígado de ratos. Histologia dos tecidos do fígado e dos rins obtidos na conclusão do
in vivo
estudo. As secções de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina (H E). i: Seção de fígado após o tratamento com o controle do veículo. ii: Seção de fígado após o tratamento com apaziquone. III: Secção de rim após o tratamento com o controlo de veículo. iv: Seção do rim após o tratamento com apaziquone. Nenhuma oncocítico necrose ou fibrose foi observada em ambos os rins e no fígado após o tratamento com apaziquone. v: coloração IHC para Ki67 da secção de tecido de xenotransplante tumoral oral, a ausência de tratamento mostrando alta nuclear Ki67 imunocoloração e vi: apaziquone xenoenxerto tratado mostrando marcadamente reduzida coloração Ki67 na seção de tecido de tumor xenoenxerto apaziquone tratados (aumento original x 200)
Os ratos tratados apaziquone mostrou foi observada apenas poucos efeitos secundários, tais como menor perda de peso, aparência curvada, olhos encovados e catarata unilateral em alguns ratos. No entanto, macroscópica e microscópica (H E manchado) exame do fígado não mostrou sinais evidentes de necrose oncocítico ou fibrose em ratos no grupo apaziquone tratada. Da mesma forma, não há lesões renais macroscópicos ou microscópicos, foram observados em ratinhos tratados com apaziquone. Estes resultados foram confirmados pelo patologista (Fig 5D).
A função hepática e testes de função do rim não mostraram diferenças significativas entre os ratos dos grupos apaziquone tratada e de controlo do veículo não tratada. Estes achados confirmam adicionalmente que não havia toxicidade no grupo tratado apaziquone (S1 Tabela). No entanto, o hemograma mostrou algumas diferenças no número de células brancas do sangue (WBC) e contagem de neutrófilos. Os ratos no grupo tratado apaziquone tinha aumentado em ambos os números de glóbulos brancos (contagem média 56,1 vs. 33,4) e neutrófilos (52,2 vs 29,7) em comparação com os ratinhos do grupo de controlo de veículo (S2 Tabela).
Discussão
o objetivo deste estudo foi determinar a actividade anti-tumoral de apaziquone para investigar o seu potencial como uma alternativa eficaz para os agentes quimioterápicos atualmente utilizados para o gerenciamento de pacientes com tumores. Apaziquone é uma quinona indole pró-droga que é activado por redutases celulares diaforase dt- em regiões bem oxigenadas dos tumores, enquanto que sob condições hipóxicas apaziquone é activado por redutases do citocromo P450 [24]. Conversão de apaziquone aos metabolitos activos, por sua vez alquila o de ADN genómico e conduz à morte apoptose /célula. Apaziquone tem sido mostrado para ser activo contra diferentes tipos de tumor tanto in
in vitro
e
In vivo
incluindo carcinoma do cólon, melanoma, renal, e carcinoma pulmonar de células não pequenas e linhas celulares de cancro do sistema nervoso central sistema [19, 25]. Apaziquone mostraram também efeitos anti-proliferativos significativos contra vários tumores sólidos murinos e humanos, incluindo os resistentes MAC geralmente tumores do cólon do rato e gástrico, do ovário e da mama xenoenxertos [26]. Apaziquone tem sido amplamente investigada contra o câncer de bexiga urinária, não só na pré-clínicos, mas vários estudos clínicos também [27]. Para o nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro relatório sobre os efeitos anticancerígenos de apaziquone no câncer oral.
Aqui no demonstramos que apaziquone é potencialmente ativo contra células cancerosas orais. Nossos resultados mostraram redução da proliferação celular e aumento da fração de células em sub-G
o-fase do ciclo celular sugerindo apaziquone morte celular induzida em células de CCEO. Nós confirmamos a apoptose como principal causa para o aumento da morte celular em apaziquone trataram células AMOS III CEs usando ensaio de anexina V. Nossos resultados foram ainda apoiada pelo aumento dos níveis de PARP fragmentada (enzima de reparação do ADN) após clivagem da caspase 9, sugerindo ativação da apoptose em apaziquone trataram células de CCEO.
Em apoio do nosso
in vitro
dados que demonstram a eficácia do apaziquone como uma droga nova para CEB,
in vivo
estudos rato de xenotransplante revelou reduziu marcadamente o crescimento do tumor com a perda de peso menor em animais apaziquone tratados, em comparação com o grupo de animais de controle do veículo. Os tumores tratados com o fármaco mostrou acentuadamente reduzida expressão do marcador de proliferação, Ki67, em comparação com os de controle de tumores não tratados por imuno-histoquímica, demonstrando que o tratamento apaziquone reduziu a proliferação de células tumorais
in vivo
. Além disso, as amostras de soro para os perfis de química clínica, hematologia e testes de função do órgão de ratinhos apaziquone tratados não mostraram qualquer toxicidade aparente nos animais tratados. Tomados em conjunto, estes resultados pré-clínicos sugerem que apaziquone tem um efeito terapêutico sobre o câncer bucal
in vivo
.
Avaliação clínica de apaziquone foi interrompido por falta de eficácia em ensaios de fase II [25, 28] . entrega da droga pobre para tumores provocados por uma combinação de eliminação rápida farmacocinética e fraca penetração através do tecido avascular eram os principais factores responsáveis pela sua fraca eficácia. Choudry et al [29] sugeriram que um subconjunto de pacientes com cancro da bexiga existir cujos tumores possuem a maquinaria bioquímica adequada necessária para activar esta droga. Uma vez que um factor significativo na falha do apaziquone na clínica foi atribuída à sua eliminação rápida farmacocinética resultando em pobre administração de fármaco a tumores, foi proposta a administração intravesical de EO9 para contornar o problema da libertação do fármaco a tumores. Com base em um entendimento do porquê apaziquone falhou, uma nova fase I /II de ensaios clínicos contra o câncer superficial da bexiga usando a administração intravesical foi encomendada em 2001 e patrocinado pela Spectrum Pharmaceuticals (Irvine, CA) [19]. actividade anti-tumoral significativa foi reportado no estudo de fase I /II [30], e esta foi subsequentemente confirmado por estudos de fase II [31]. Puri
et al
[30] demonstraram que apaziquone intravesical administrada é bem tolerada localmente e sistemicamente, e tem atividade ablativo de lesões marcador de câncer de bexiga superficial. Hendricksen et al., [32] mostraram que uma única instilação imediata do tumor da bexiga pós-ressecção transuretral da apaziquone foi bem tolerado, com um bom perfil de segurança esperado. Apaziquone e do seu metabolito EO5a não foram detectados sistemicamente com análises farmacocinéticas [26]. A análise dos dados combinados de dois estudos clínicos fase III separadas para apaziquone no cancro da bexiga mostrou efeito significativo do tratamento em favor da apaziquone no objectivo primário da taxa de recorrência do tumor em 2 anos (p = 0,0174) e em um endpoint secundário chave , tempo de recorrência (p = 0,0076). No entanto, ele não cumpria sua endpoint primário de uma diferença estatisticamente significativa na taxa de recorrência do tumor em 2 anos entre os dois braços [33]. Estes ensaios clínicos utilizando a administração intravesical de apaziquone diretamente na bexiga apoiado a nossa razão para usar esta droga para o câncer de boca, porque cavidade bucal é de fácil acesso para entrega da droga localizada e é susceptível de melhorar a farmacocinética de apaziquone para uso clínico em pacientes com câncer bucal.
Loco-regional está a emergir como um importante adjuvante da cirurgia e quimioterapia sistêmica em pacientes selecionados com alguns tipos de câncer [34-37]. Neste contexto, apaziquone emergiu como uma droga localmente eficaz em cancro da bexiga superficial [19]. Nosso
in vitro Comprar e
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estudos sobre apaziquone no câncer oral fornecem evidência pré-clínica de sua eficácia e garante futura fase I e estudos farmacológicos em apoio do seu potencial uso clínico. No caso em que a administração sistémica de apaziquone em pacientes de cancro oral produz uma eficácia limitada, que pode ser explorado para a quimioterapia loco-regional, tal como um adjuvante da cirurgia como a maioria dos locais dentro da cavidade oral são prontamente passíveis de locorregional aplicação do fármaco.
Uma das limitações do nosso estudo é que nós não ter determinado o nível de expressão ou atividade da NAD (P) H quinona oxidoredutase 1 (NQO1) também conhecido como DT-diaforase 1, a enzima envolvida no metabolismo de apaziquone na via oral células SCC; na investigação profundidade de NQO1 em CCEO e sua relevância para a eficácia apaziquone em pacientes com tumores será realizado em um estudo futuro. No entanto, a expressão da proteína NQO1 foi recentemente relatado para prever mau prognóstico dos cancros do pulmão de células não-pequenas [38].
Conclusões
Apaziquone mostrou atividade anticâncer promissora em linhas celulares de cancro orais matar o câncer células por apoptose. Além disso, apaziquone demonstrou actividade anti-tumoral promissora nos xenoenxertos de tumor do cancro orais, sem toxicidade significativa para os tecidos normais que evidenciam a eficácia pré-clínica de apaziquone, como um candidato potencial terapêutico anti-cancro novo para tratamento do cancro oral.
Apoiando informações
S1 Fig. . Western blot análise de densitometria
Histogramas da análise de densitometria de Western blot de caspase 3, caspase 9 clivada, caspase 9, PARP e PARP Clivadas normalizado para p-actina, em comparação com controlos não tratados (NTC)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s001
(TIF)
S1 Table. Clinical Chemistry perfil, Fígado Os testes de função renais
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s002
(DOCX)
S2 Table. Hemograma completo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s003
(DOCX)