Abstract

A obesidade tem sido apontada como um fator de risco significativo para o desenvolvimento de câncer pancreático. Na definição de obesidade, uma resposta inflamatória crónica sistémica é caracterizada por alterações na produção e secreção de uma ampla variedade de factores de crescimento. A leptina é uma hormona cuja nível aumenta drasticamente no soro de pacientes obesos. Dieta de elevado teor de gordura obesidade induzida em ratinhos conduz a um aumento do peso total do corpo, peso do pâncreas, leptina no soro, e os níveis de leptina tecido pancreático. Aqui nós relatamos a contribuição da obesidade e leptina para o crescimento do câncer de pâncreas utilizando um

in vivo

ortotópico modelo de cancro pancreático murino, que resultou no aumento da proliferação do tumor com o aumento da carga tumoral concomitante na dieta ratos obesos induzidos em comparação a inclinar-se ratos . linhas celulares de cancro pancreático humano e de murino foram encontrados para expressar o curto, bem como a forma longa do receptor da leptina e funcionalmente respondeu à leptina activação induzida por meio de um aumento da fosforilação de AKT473. In vitro, a estimulação da leptina aumento da migração celular, que foi bloqueada pela adição de um inibidor de PI3K. In vivo, o esgotamento do receptor da leptina através de shRNA knockdown parcialmente revogada aumento do crescimento tumoral ortotópico em ratos obesos. Estas descobertas sugerem que a leptina contribui para o crescimento do tumor pancreático através da activação da via PI3K /AKT, o que promove a migração de células do tumor do pâncreas

citação:. Mendonsa AM, Chalfant MC, Gorden LD, VanSaun MN (2015) Modulation of crescimento do tumor leptina receptor medeia e migração de células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 10 (4): e0126686. doi: 10.1371 /journal.pone.0126686

Editor do Academic: Jose G. Trevino, University of Florida, United States |

Recebido: 17 de outubro de 2014; Aceito: 07 de abril de 2015; Publicação: 28 de abril de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seu arquivo de Informações de Suporte

Financiamento: A pesquisa foi apoiada pelo pâncreas 2010 Prêmio Cancer Action Network-AACR Desenvolvimento de Carreira, Grant Número 10-20-25-VANS e NIH # 5U01CA143072 forneceu apoio salário para AMM, MCC, MNV e LG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a obesidade e diabetes foram mostrados para ser fatores de risco independentes para o desenvolvimento de um número de cancros epiteliais, incluindo adenocarcinoma do pâncreas. No mundo inteiro, as taxas de obesidade têm aumentado a um ritmo sem precedentes na última década [1]. Obesidade complicada pela síndrome metabólica e diabetes mellitus tipo 2 são comumente comorbidades [2]. Sugeriu-se que a diabetes pode ser associada ao desenvolvimento e progressão do cancro pancreático e 80% dos pacientes com cancro pancreático, experimentam alguma forma de diabetes ou alterada a sensibilidade à insulina [3]. índice de massa corporal (IMC) e um aumento de 10 cm na circunferência da cintura proporcionou um aumento do risco relativo de 1,11 para a incidência de câncer de pâncreas [4]. Além disso, os modelos de murino demonstraram a importância da dieta sobre o desenvolvimento de cancros pancreáticos [5, 6].

obesidade crónica conduz a uma alteração na produção e secreção das adipocitoquinas, as citocinas secretadas pelo tecido adiposo [ ,,,0],7-12]. A leptina é um tal adipocina que é dramaticamente aumentada em pacientes obesos [8, 9]. A leptina, normalmente conhecida pela sua capacidade de regular o gasto de energia e saciedade [13], se liga a várias isoformas de leptina (ob; obesos) do receptor. A forma curta do receptor é conhecido para sinalizar através da via PI3K /AKT, enquanto a forma longa do receptor de leptina é conhecido para sinalizar através da via JAK-STAT e induzir a fosforilação da STAT3 [14-16]. O aumento da leptina tem sido relatada em subconjuntos de pacientes de cancro e demonstrada para estimular a proliferação de células cancerígenas do cólon, a migração de células do cancro da mama, glioma de migração e invasão, bem como o crescimento de células colangiocarcinoma

in vitro

. [17-21]

O papel da leptina e receptores de leptina sinalização no desenvolvimento do câncer de pâncreas e progressão permanece mal definida. Estudos anteriores demonstraram que

In vitro

tratamento de células de cancro do pâncreas com baixos níveis de leptina induzido uma redução da actividade metabólica [22].

In vitro

estudos demonstraram o crescimento e a metástase de uma linha celular de cancro pancreático murino foi mostrado para ser aumentada em ratinhos geneticamente obesos causado pela perda de leptina ou perda da isoforma longa do receptor de leptina [23]. adipócitos tumorais também foram mostrados para ser positivamente correlacionada com a proliferação de xenoenxertos de cancro do pâncreas implantados em ratos obesos [24]. Além disso, a doença não alcoólica gordos pancreático (NAFPD) e steatopancreatitis foram encontrados representam um fator de risco potencialmente significativo para o câncer pancreático humano [25].

Para entender se a expressão tumoral de receptores de leptina regulava o crescimento dos cânceres de pâncreas em a definição de obesidade, nós ortotopicamente injetaram células de câncer de pâncreas em ratos magros e obesos utilizando a tecnologia de RNA de interferência para esgotar o receptor de leptina a partir de células de câncer de pâncreas. Os resultados demonstram que a expressão do receptor de leptina potencializa independente crescimento do tumor pancreático de proliferação de células tumorais.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Este estudo foi realizado de acordo com o Guia para a Cuidados e Uso de Animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e da aprovação da Vanderbilt Institutional animal Care e Use Committee /Escritório de Bem-Estar animal Assurance (M /12/277). alojamento dos animais e cuidados estava de acordo com uma facilidade de animais de laboratório credenciado. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com métodos aprovados para reduzir o número de animais e qualquer desconforto ao animal potencial.

Mice and Diet Manipulação

camundongos machos de oito semanas de idade C57BL /6J foram obtidos a partir Research Jackson Laboratories, separados em gaiolas apropriadas e alimentados com uma dieta magra de 13,5% de gordura (5001, LabDiet: 13,5% de calorias provenientes de gordura, 58% de carboidratos, e 28,5% de proteína) ou alimentados com uma obesidade induzindo dieta de 42% de gordura “DIO , obesidade induzida por dieta “(TD.88137, Harlan Teklad: 42% de calorias provenientes de gordura, 42,7% dos hidratos de carbono e 15,2% de proteína) ad libitum. O peso corporal e peso de pâncreas total foram medidos após três meses em dieta. O plasma foi recolhido de ratos e os níveis de leptina foram avaliados através de um ensaio de rato Quantikine específica de acordo com o protocolo do fabricante (R D Systems).

tumor Ortotópico crescimento

células cancerosas do pâncreas foram colhidas através de tripsina /EDTA quando 80% confluentes. As células foram ressuspensas em solução salina de grau farmacêutico e injectado ortotopicamente na cauda do pâncreas de ratos obesos de dieta induzida e magra para estabelecer os tumores. Em resumo, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e por via de inalação de uma incisão paramediana foi feita no abdómen. A cauda do pâncreas foi exteriorizado e 2,5×10

5 células de cancro pancreático foram ressuspensas em 25 ul de solução salina veterinária e injectado na cauda do pâncreas, usando uma agulha de 27 gauge. Uma bolha de imediato assegurada uma injeção precisa e um cotonete aplicada durante a retirada da agulha assegurou que as células não foram derramados no abdômen. O pâncreas foi então cuidadosamente colocada de volta para a posição anatómica e os ratinhos foram suturados e deixados a recuperar sob IACUC aprovado monitorização. Os tumores foram deixados crescer até um ponto final de 28 dias e os ratinhos foram sacrificados através de sobredosagem de dióxido de carbono. Os tumores foram excisados, juntamente com os restantes pâncreas, pesados, fixados em paraformaldeído a 4% durante a noite, e depois processados ​​para análise histológica. Hematoxilina /eosina ou tricrômicos cortes corados foram então digitalizados com ampliação de 20x com um SL-50 scanner de Ariol (Leica). área do tumor, número de adipócitos e adipócitos tamanho foi calculado no ponto médio do tumor utilizando imagens Ariol em associação com software Digital análise Hub Imagem (Leica). Para a análise de imagem bioluminescente, imagiologia in vivo foi realizada no dia após a injecção e cada semana subsequente, através de um sistema IVIS 200 (Xenogen). A bioluminescência foi medida para cada rato em cada dia usando as mesmas configurações de exposição. A quantificação do fluxo total foi calculado com Viver software de análise de imagem através da criação de uma região pré-definida de interesse que foi mantida constante para todos os ratos. A análise imuno-histoquímica de Ki67 (1: 250, Abcam Ab15580) e apropriado secundário /terciário foi usada para determinar o número de células cancerosas em proliferação. coloração de Ki67 foi quantificada por avaliação do número total ou área a percentagem de núcleos corados positivamente dentro do tumor. análise pós-aquisição e análise estatística foi realizada utilizando o software de análise GraphPad Prism.

Linhas Celulares

Padrão celular publicado anteriormente métodos de cultura foram utilizados para manter linhas celulares de cancro do pâncreas, incluindo murino Panc02 (repositório NIH , DTP /DCTC /NCI [26]), PanIN 4313 [27], K8484 e DT8082 [28], bem como MiaPaCa-2 humana, Panc1, e BxPC-3 (ATCC; CRL-1420, CRL-1469, CRL- 1687). Luciferase com etiquetas linhas celulares foram geradas através da infecção das linhas de células com um título de lentivírus comercial para Firefly luciferase (Genecopoeia, LPP-FLUC-LV105-025 contendo 1×10

8 TU /mL). As células não-infectadas foram eliminadas após a adição de puromicina (10 ug /ml, Sigma). a expressão de luciferase foi confirmada para cada linha através de uma análise-Glo (Pierce).

em tempo real de PCR Análise

O ARN foi extraído de cada linha celular, utilizando uma extracção Qiazol combinadas e Qiagen RNeasy mini-kit de purificação. Um micrograma de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando o ADNc de alta capacidade kit de transcrição reversa (Applied Biosystems). PCR em tempo real foi realizada usando iniciadores específicos para o receptor de leptina de murino; QT00154133, QT01045380, e QT01045373 (Qiagen) em combinação com o kit iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acordo com as instruções do fabricante num sistema de detecção em tempo real de PCR CFX96 (Bio-Rad). Cada transcrição em cada amostra foi ensaiada três vezes e os rácios de dobra de mudança entre as amostras experimentais e de controlo para cada gene usados ​​na análise foram calculados usando 18S níveis como uma referência. receptores de leptina humana primers quantitativos foram os seguintes para uma região comum do receptor da leptina (forward: 5’TTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTT, inverta: 5’CACACCAAAGAATGAAAAAGCTAT), a forma curta do receptor de leptina (forward: 5’TTCCTGGGCACAAGGACTTA, inverta: 5’GCTCCAAAAGAAGAGGACCA) e a forma longa do receptor de leptina (forward: 5’TTCCTGGGCACAAGGACTTA, inverta: 5’TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA). iniciadores do receptor de leptina humanos para RT-PCR utilizado um primer para a frente comum 5’CGTGCAGTCACTCAGTGCTTA e reverse primers para detectar a curto 5’TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA forma ou a forma longa 5’GCTCCAAAAGAAGAGGACCA. iniciadores de controlo para beta actina humana foram para a frente 5’GAGCACAGAGCCTCGCCTTT e 5’ATCCTTCTGACCCATGCCCA reversa.

Edu ensaio de proliferação

A proliferação foi avaliada através do uso de uma análise baseada em citometria de fluxo EdU. Resumidamente, 1×10

5 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços e deixadas fixar durante a noite. As células foram então privadas de soro durante 8 horas, seguida de tratamentos apropriados para mais 24 h. EdU foi adicionado ao meio de cultura a 25 uM durante as últimas 3 horas de tratamento para incorporação. No final do tratamento, as células foram libertadas com tripsina /EDTA e, em seguida, lavou-se com PEB (PBS /EDTA 2 mM /BSA a 1%). As células foram fixadas com 2% de formalina tamponada durante 30 minutos à temperatura ambiente, centrifugou-se a 300xg, aspirada e, em seguida, lavadas em PBS contendo 1% de BSA. As células foram permeabilizadas com adição de 0,25% de Triton durante 15 minutos, sedimentou-se a 450xg, e, em seguida, lavadas com PBS /BSA e novamente sedimentadas. As células foram marcadas em uma mistura de reacção contendo 150 mM Tris pH 8,5, 1,5 mM de CuSO4, 10 mM de 647-azida, e ácido ascórbico a 100 mM (adicionado no fim) durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. A reacção foi parada pela adição de 5 vezes maior de tampão de PEB. As células foram marcadas com iodeto de propídio 1 ug /mL e sedimentou-se a 450xg. As células foram ressuspensas em 250 � de PEB e depois quantificado por citometria de fluxo num citómetro Accuri C6. As células foram fechado por SSC vs FSC e medidos para a percentagem de células positivas PI dentro do portão valor positivo EDU-647.

ensaio de migração

A migração celular foi avaliada por um ensaio de zero. células de cancro pancreático (2,5 × 10

5 células /poço) foram semeadas em meio completo e deixadas a aderir durante a noite e alcançar confluência. Após a células de confluência foram privadas de soro durante 8 horas. As células foram então riscado com uma ponta de pipeta para produzir uma ferida livre de células e meio foi mudado para as condições de tratamento adequadas. A leptina foi administrado a 250 ng /ml, com e sem a adição de LY294002 (20 �, Sigma) e cultivadas durante um adicional de 24 h a 37 ° C em 5% de CO

2. A largura zero foi registada imediatamente após a zero e novamente às 24 horas após a zero. A largura zero foi calculada em três posições em cada poço e expressa como uma média e, em seguida, medido em quatro experimentos.

Análise Ocidental

Os lisados ​​de linhas celulares de cancro do pâncreas foram coletadas em gelo tampão RIPA frio (50 mM de Tris pH 7,4, 50 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 0,2% de SDS, 10 mM de NaF, 1 mM de Na

3VO

4, 0,5% desoxicolato de sódio, e 1% de Triton X-100) com amplo espectro completa Mini cocktail inibidor da protease (Roche), bem como cocktail de inibidores de fosfatase (Cell Signaling, 5870S). Os lisados ​​foram brevemente sonicada, centrifugada a 10000xg durante 15 min e a concentração total de proteína no sobrenadante foi medida através de análise de proteína BCA (Pierce). Controlo lisado COLO 320DM foi obtido a partir de Santa Cruz (sc-2226). 25μgs de lisados ​​foram separados por meio de SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose, bloqueados com BSA a 3% e, em seguida, colocados a hibridar com anticorpo primário: Lepr (SantaCruz (K-20), SC-1835 1: 250 e (H-300) SC-8325 1: 250), pAKT473 (Cell Signaling, 4060S 1: 1000), tAKT (Cell Signaling, 4821S 1: 1000), pSTAT3 (Cell Signaling, 9145L 1: 1000), tSTAT3 (Abcam, ab5073 1: 1000), pAMPK ( Abcam, Ab133448 1: 1000), tAMPK (Cell Signaling, 2603S 1: 1000), e actina (Abgent, AM1829b 1: 3000). Os anticorpos secundários conjugados com adequadas IR680 e IR800 (Rockland 1: 10000) foram utilizados em conjunto com a aquisição de imagem e Odyssey análise densitométrica (LI-COR Biosciences). Densitometria de pAKT foi comparado com os níveis TAKT pSTAT3 e foi comparado com os níveis tSTAT3, que foram, em seguida, respectivamente, comparado com o ponto de tempo zero ou o controlo parental. Densitometria para as linhas de controlo do receptor de knockdown e leptina foram comparados aos da actina e em seguida normalizada para os níveis parentais.

shRNAmir knockdown

títulos lentivirais foram produzidas a partir de construções de vector GIPZ de várias regiões do receptor de leptina de murídeo ( V2LMM 70436 e V2LMM 190.793, ThermoScientific) ou para um vector de controlo (RHS4480), utilizando o sistema de embalagem Trans-Lentivirus de acordo com o protocolo do fabricante (Open Biosystems). sobrenadantes de título de lentivírus foram concentradas utilizando solução de concentração Lenti-Pac e 2,5×10

5 células de câncer pancreático foram transduzidas de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Genecopoeia). Depois de transdução, as células positivas foram isolados sob 10 ug selecção puromicina /ml e confirmou visualmente para a expressão GFP. Além disso, knockdown foi confirmada para mRNA através de qPCR e para a proteína através de análise de western blot.

Resultados

obesidade induzida por dieta contribui para a adiposidade pancreático

Ele já havia sido relatado que o consumo de uma dieta rica em gorduras leva a obesidade, resistência à insulina e níveis mais elevados de leptina por dezoito semanas de idade em ratinhos [29]. Além disso, tem sido mostrado que o próprio pâncreas humano está sujeito a infiltração de gordura, identificado como doença pancreática adiposo [25]. Para determinar se a obesidade induzida por dieta pode resultar em infiltração de gordura no pâncreas de murino, os ratos foram mantidos numa dieta rica em gordura durante três meses. Os animais apresentaram um aumento significativo no peso corporal total, bem como o peso de pâncreas na dieta obesos (DIO) ratos induzida (Figura 1A e 1B). peso do pâncreas fixa e seco média para ratos magros foi 0,221 g em comparação com 0,325 g de ratos obesos. O exame histológico do pâncreas de ratos obesos induzidos magra e dieta mostrou a presença de ambos adiposo interpancreatic e intrapancreática nos ratinhos DIO (Fig 1C e 1D). O número de adipócitos por mm

2 de tecido acinar, bem como o tamanho dos adipócitos peripancreáticos foi significativamente aumentada no pâncreas DIO (Fig 1E e 1F). Além disso, determinou-se os ratos tiveram um aumento de 20 vezes (média magra foi 3.155ng /mL e DIO foi 60.156ng /mL) em níveis de leptina no plasma após doze semanas de dieta (Fig 1G). os níveis de leptina normais são normalmente encontradas em 1-10ng /ml em soro humano e 10-50ng /ml em pacientes obesos [30]. Na configuração de aumento adiposo pâncreas, os níveis relativos de tecido de leptina no pâncreas foram encontrados para ser aumentada em comparação com o DIO pancreata inclinar-se os pâncreas (Fig 1H).

Os ratinhos foram mantidos numa dieta de elevado teor de gordura de 42% por 3 meses para induzir obesidade. ratinhos DIO ganho de peso significativamente mais total do corpo (A), bem como peso do pâncreas (B). A análise histológica da pancreata total desde o Lean (C) em comparação com DIO ratos (D) mostrou acúmulo de interpancreatic (seta branca) e intrapancreática (setas pretas) adiposo na DIO pâncreas. O número total de adipócitos intrapancreática (E), assim como o tamanho dos adipócitos peripancreáticos (F) foi maior no pâncreas DIO. Os níveis de leptina estavam aumentados em ambas as amostras de plasma e tecido pancreático de murganhos obesos (L). Barras de escala são 100 um.

induzidas Dieta obesidade aumenta ortotópico tumor pancreático crescimento

A obesidade é um fator de risco significativo para muitos cancros e foi mostrado para potenciar o seu crescimento em ratinhos [5, 31, 32]. Para examinar se a dieta obesidade induzida foi suficiente para aumentar o crescimento do câncer de pâncreas

in vivo

, utilizamos um modelo ortotópico singênico murino do câncer de pâncreas. Temos demonstrado anteriormente que a dieta obesidade induzida aumentou o número de metástases hepáticas em um modelo de injeção de baço de metástase de câncer de cólon no cenário da doença hepática gordurosa [33]. Usando um modelo SR-Kras foi demonstrado que a obesidade propensas C57BL /6J alimentados omega-6 gordura têm um início mais precoce e um aumento da frequência de PanIN, neoplasia intra-epitelial pancreáticas, lesões [5]. Portanto, postulamos que a obesidade induzida por dieta e o desenvolvimento de NAFPD em ratinhos pode também aumentar o crescimento de cancros pancreáticos. C57BL /6J foram colocados numa dieta rica em gordura durante três meses para induzir obesidade. células de adenocarcinoma pancreático Panc02 foram então injectados ortotopicamente na cauda do pâncreas e monitorizados para o crescimento. No crescimento do tumor primário foi monitorizado in vivo usando a bioluminescência de análise de imagens (IVIS) em combinação com luciferase células marcadas Panc02 (Fig 2A). tumores Panc02 ortotopicamente implantados nos ratos obesos de dieta induzida mostrou um aumento significativo no fluxo total de fotões após nove dias de crescimento e um crescimento contínuo ao longo do tempo enquanto que os tumores nos ratos magros mostrou crescimento lento ao longo do mesmo período de tempo (Fig 2B). Análise ex vivo aos 28 dias pós-injecção confirmaram o crescimento do tumor maior na dieta ratos obesos induzidos em comparação com os ratos magros calculado como o peso total do tumor (Fig 2C). digitalização Ariol com análise computacional também mostrou uma área aumentada do tumor em ratinhos obesos (Figura 2D). tumores endpoint foram coradas para o marcador de proliferação Ki67 e mostrou aumentou significativamente a proliferação das células do tumor em ratos DIO comparado a inclinar-se ratos (Fig 2E).

A bioluminescência revelou aumento do crescimento ao longo do tempo em ratos DIO comparado a inclinar-se ratos (A) . O fluxo total de imagiologia de luciferase foi estatisticamente diferente por Day09 após injecção das células tumorais ortotópica (B). peso tumoral terminal (C) bem como a área do tumor (D) estavam significativamente aumentados em ratinhos DIO. Proliferação avaliada por coloração de Ki67 foi aumentada em tumores em comparação DIO a inclinar-se (E) tumores. Radiance escala do mapa de calor é x10

5 p /seg /cm

2 /sr. A análise estatística de Mann-Whitney de p . 0,0079 (*)

linhas celulares de cancro do pâncreas expressam receptores de leptina funcionais

Estudos têm demonstrado que células beta pancreáticas expressam receptores de leptina funcional [ ,,,0],34], mas os níveis de expressão do receptor e função em câncer de pâncreas não foi abordada. Para determinar se as células cancerosas do pâncreas expresso leptina receptores, foram isoladas RNA e proteínas a partir de múltiplas linhas celulares de cancro pancreático humano e murino. A análise por Western blot foi realizada para determinar o nível de proteína de leptina relativa receptores no nosso painel de linhas celulares de cancro pancreático. Tanto a curto como isoforma (LR-short) e da forma longa (LR-Long) estavam presentes em linhas celulares de cancro do pâncreas, mas a forma longa em linhas humanos foi apenas fracamente detectado utilizando o anticorpo K-20 (Fig 3A) Presença do isoforma longa do receptor de leptina foi adicionalmente verificada utilizando o anticorpo H-300 (Fig S1B). As duas formas foram adicionalmente detectada através de análise por PCR em murino, bem como linhas de células humanas (Fig 3B e 3C e Fig S1A). As linhas celulares foram tratados com a leptina exógena em 5 ng /ml, 50 ng /mL, e 250 ng /ml para determinar a extensão de pAKT e pSTAT3 activação. análise de Western acoplado com densitometria, mostrou que a leptina induz a activação de pAKT-S473 em linhas Panc02 e Panc1, mas não na linha celular MiaPaCa (Fig 3D). A leptina activação induzida de pAKT foi ainda suprimido pelo inibidor de PI3K LY294002 aos 30 e 60 minutos (Figura 3E). A leptina estimulou pSTAT3 na linha celular humana Panc1 com o aumento da concentração, embora concentrações mais baixas eram mais eficazes em induzir pSTAT3 na linha Panc02 murino e nas linhas de células MiaPaCa2 (Fig 3D). Estes resultados demonstram que as células de cancro do pâncreas expressam o receptor de leptina funcional, ainda estimulação do ligando de qualquer pAKT ou pSTAT3 é dependente do tipo de linha celular de cancro pancreático.

análise ocidental de qPCR em tempo real e verificada a expressão do receptor da leptina para o formas longas e curtas do receptor de leptina de murino e em linhas de células pancreáticas humanas (a, B, C). anlayis ocidentais demonstraram estimulação de linhas de células de cancro do pâncreas com a leptina de chumbo para a fosforilação de AKT nas linhas celulares e Panc02 Panc1, e para a fosforilação da STAT3 (D). A adição do inibidor de PI3K /AKT LY294002 foi capaz de bloquear a leptina fosforilação induzida de pAKT mas não afectou a leptina induz a activação pSTAT3 na linha celular Panc1. A análise densitométrica foi utilizado para quantificar a quantidade de pSTAT3 e pAKT em relação aos níveis totais de cada proteína e, em seguida normalizada para zero ponto no tempo.

A leptina estimula a proliferação de células cancerígenas pancreáticas murinas

leptina foi mostrado que estimula a proliferação de uma variedade de linhas celulares de cancro [21, 35-38]. O aumento do nível de leptina no plasma, bem como o tecido do pâncreas sugeriram que a leptina pode estar envolvido no crescimento do tumor pancreático. A activação de pAKT ou pStat3 tem sido associada com a proliferação induzida por leptina, sobrevivência, tolerância imune e invasão de células cancerosas [35, 36, 39-42]. Contrariamente a vários estudos que mostram a activação da proliferação nas células cancerosas após estimulação da leptina, o tratamento de células ou MiaPaCa Panc1 com leptina foi relatado para causar uma diminuição na sua actividade metabólica através de um ensaio de MTT [22]. Devido ao aumento da pAKT e pSTAT3 observado nos nossos estudos com tratamentos de leptina, estávamos interessados ​​para determinar a estimulação da leptina alterou a proliferação de linhas de células do cancro do pâncreas. edu ensaios de incorporação foram realizados a fim de determinar se a leptina efectuada a proliferação de células de cancro do pâncreas (Fig 4A). estimulação da leptina mostraram um aumento significativo na proliferação através da incorporação edu para a linha celular Panc02 murino e a linha celular humana Panc1 em todas as concentrações testadas, no entanto, não alterou a proliferação na linha celular de MiaPaCa em qualquer concentração testada.

estimulação da leptina em 5, 50, e 250 ng /mL causaram um aumento na proliferação avaliado através de incorporação EdU em linhas celulares murinas e Panc02 Panc1 humano, mas não alterou a proliferação de células em MiaPaCa (a) humana. estimulação da leptina causou um aumento na migração registada como a distância migrada para células Panc02 Panc1 e avaliadas por meio do ensaio do zero que foi bloqueado pelo inibidor de PI3K LY294002 (B). A análise estatística por * ANOVA de p 0,0001, e ** T-teste de p . 0,05

A leptina aumenta a migração de células de câncer de pâncreas

Além de proliferação, a leptina tem também foi demonstrado que o aumento da capacidade de migração de células cancerosas [18, 19, 43, 44]. A análise histológica dos tumores em ratinhos obesos mostraram um elevado grau de infiltração de células tumorais no tecido adiposo peri-pancreático nos ratinhos DIO em comparação com os ratos magros (dados não mostrados). Isto sugere que as células de câncer de pâncreas pode estar respondendo com mobilidade aprimorada e migração para citocinas ou adipocinas liberadas pelo tecido adiposo. Para determinar se a leptina pode ainda actuar como um factor migratório para as células de câncer de pâncreas foram realizados ensaios de zero. Os ensaios demonstraram que a leptina raspadinhas aumentou significativamente tanto a migração de Panc02, bem como células Panc1 in vitro (Figura 4B), enquanto que as células não mostram MiaPaCa activação migratório em resposta à leptina. A adição do inibidor de PI3K /AKT LY294002 bloqueada leptina migração induzida de células de câncer de pâncreas.

Knockdown do receptor de leptina

A fim de determinar a contribuição do receptor de leptina para o crescimento do câncer de pâncreas em ratos obesos , que derrubado a expressão do receptor de leptina utilizando técnicas baseadas em lentivírus shRNAmir na linha celular murina Panc02. Fomos capazes de obter uma redução significativa na expressão de ARN de ambos os longa, bem como as formas curtas do receptor de leptina usando dois construtos diferentes shRNAmir, LRKD1 e LRKD2 (Figura 5A). análise de proteínas através de transferência de Western e análise densitométrica confirmou o efeito do knockdown com ambas as construções (Figura 5B). Além disso, o knockdown de receptor de leptina também conferido um decréscimo nos níveis de activação de pAKT e pSTAT3 (Fig 5B). Utilizando um ensaio de proliferação com base edu fomos capazes de mostrar que as linhas de knockdown teve um índice de proliferação celular basal inferior em meio isento de soro (Figura 5C). A estimulação de ambas as células shRNA Panc02 parentais e de controlo com leptina induzido um aumento na proliferação que não ocorreu nas células LRKD1 ou LRKD2 Panc02 (Fig 5D).

Long e os níveis de ARN do receptor de leptina curtas medidos por meio de análise de PCR em tempo real foram significantemente menores usando dois diferentes títulos lentivirais shRNAmir na linha celular Panc02 (a). e análise de Western confirmou densitométrica knockdown receptor de leptina, bem como a activação de pAKT reduzida (B). proliferação basal foi significativamente diminuído em ambos as linhas de células de knockdown e LRKD1 LRKD2 quando cultivada em condições isentas de soro (C). A estimulação com leptina em 50 ng /mL a proliferação induzida em células parentais e de controlo, mas não conseguiu induzir a proliferação (percentagem de alteração em comparação com não tratadas) em qualquer uma das linhas celulares de knockdown em comparação com o controlo paternal ou shRNA (D). A análise estatística por ANOVA * representa p 0,014 curto, p 0,0023 longa, p 0,0003 comum (A); ANOVA P 0,0008 (C) .; ANOVA P 0,0001 (D). * P . 0,05 em C, D

knockdown do receptor de leptina revoga o crescimento tumoral associado DIO

receptor de leptina células Panc02 knockdown foram utilizados para determinar se o tumor pancreático ortotópico in vivo aumento do crescimento observado em ratinhos obesos foi devido ao aumento da sinalização da leptina em ratinhos DIO. receptor de leptina knockdown linhas celulares Panc02 foram injetados ortotopicamente em pancreata magra e DIO. Depois de vinte e oito dias de crescimento, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram recolhidos e pesados. Ambas as linhas de receptor de leptina knockdown mostrou reduzida pesos dos tumores nos ratinhos DIO, mas apenas LRKD2 mostrou uma diminuição estatisticamente peso do tumor quando comparado com o controlo paternal ou as linhas de células cultivadas em shRNA Panc02 os ratinhos DIO (Fig 6A). tumores em ratos magros knockdown não foram significativamente diferentes um do outro. A proliferação de tumores de LRKD2 foram comparados com tumores parentais para determinar o número de células positivas Ki67, que revelaram níveis semelhantes de proliferação dos tumores DIO tipo selvagem em comparação com o receptor de leptina tumores DIO knockdown (Fig 6B). Portanto, a diferença no crescimento do tumor não se correlacionou com a proliferação de células tumorais.

Panc02 células com receptor de leptina knockdown variantes LRKD1 e LRKD2 ortotopicamente foram injectados em ratos magros e DIO. (A) As diferenças entre parental (P), shRNA controle (C), e variantes knockdown não foram estatisticamente diferentes quando foram feitas comparações entre o controle e tumores knockdown em ratos magros. receptor de leptina variante knockdown LRKD2 mostrou uma diminuição significativa do peso do tumor em ratinhos DIO, quando em comparação com os tumores de controlo parental e em ratinhos DIO. (ANOVA P 0,0001, * p 0,05). (B) Avaliação da proliferação de células tumorais através de coloração Ki67 não foi diferente entre os tumores DIO de controle em comparação com tumores LRKD2 DIO, mas foi significativa entre os tumores magros e DIO (ANOVA p 0,0004, * P 0,05).

Discussão

a obesidade e alterações na composição da dieta têm sido relatados para afetar o crescimento e aparecimento de cancros pancreáticos em vários modelos murinos [5, 6]. Este estudo demonstra que a obesidade induzida por dieta correlaciona-se com o desenvolvimento de um pâncreas gordos e obesidade que potencia o crescimento do cancro do pâncreas. Dieta obesidade induzida correlacionada com em um aumento da proliferação de células tumorais pancreáticas ortotopicamente implantados

in vivo

. Além disso, a doença pâncreas gordo foi mostrado estar associado com o aumento da incidência de metástases dos nódulos linfáticos [45]. É importante ressaltar que alguns dos fatores de risco observados associados com câncer de pâncreas são obesidade, pancreatite crônica e diabetes [46]. Os nossos resultados são consistentes com o consenso geral de que a obesidade é um fator que contribui para o aumento do crescimento do câncer de pâncreas e oferecer um mecanismo que contribui para o crescimento do tumor mediada por mudanças de leptina induzida em STAT3 e /ou sinalização de PI3K-AKT.

A obesidade