Abstract

CD44 é um gene receptor de membrana ácido hialurônico que codifica mais de 100 diferentes isoformas de proteínas específicas do tecido. A, padrão CD44 mais ubíquos, tem sido utilizada como um marcador de células estaminais no cancro do ovário e outros cancros. Expressão da variante de CD44 epitelial contendo exões v8-10 (CD44v8-10) tem sido associada com tumores metastáticos mais quimiorresistentes e em cancros gastrointestinais e da mama, mas o seu papel no cancro do ovário é desconhecida; Por conseguinte, investigada a sua utilização como um marcador de prognóstico no presente doença. Os perfis de 254 amostras de tumor do cancro do Genoma Atlas RNAseqV2 de expressão de genes foram analisadas quanto à presença de isoformas de CD44. A tendência de maior sobrevida foi observada em pacientes com alta expressão de isoformas de CD44, que incluem exons v8-10. A análise imuno-histoquímica (IHC) para tumores de presença de CD44v8-10 foi realizada num coorte independente de 210 doentes com cancro do ovário seroso de alta qualidade, utilizando uma micromatriz de tecido tumoral. estratificação dos pacientes com base na análise de coloração software revelou um aumento estatisticamente significativo na sobrevida em pacientes com os mais altos níveis de expressão da proteína transmembranar (top 10 ou 20%) em comparação com aqueles com o menor expressão (parte inferior 10 e 20%) (p = 0,0181 , p = 0,0262, respectivamente). Expressão de CD44v8-10 em linhas celulares de cancro do ovário primárias foi correlacionada com um fenótipo epitelial predominantemente caracterizada por uma elevada expressão de marcadores epiteliais e baixa expressão de marcadores mesenquimais por qPCR, Western blot e IHC. Por outro lado, a detecção de proteoliticamente clivados e solúvel domínio extracelular de CD44v8-10 em amostras de ascites de doentes foi correlacionada com significativamente pior prognóstico (p 0,05). Portanto, a presença de CD44v8-10 transmembranar na superfície de células de tumor primário pode ser um marcador de um tumor altamente epitelial com um prognóstico melhor enquanto clivagem enzimática de CD44v8-10, como detectado pela presença do domínio extracelular solúvel em fluido ascítico, podem ser indicativo de uma doença mais metastático e pior prognóstico

Citation:. Sosulski a, Corno H, Zhang L, Coletti C, Vathipadiekal V, Castro CM, et al. (2016) CD44 Splice Variant v8-10 como um marcador da serosa do cancro do ovário prognóstico. PLoS ONE 11 (6): e0156595. doi: 10.1371 /journal.pone.0156595

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO

Recebido: 28 de setembro de 2015; Aceito: 17 de maio de 2016; Publicação: 02 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Sosulski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de informação de suporte ou no site da TCGA em https://cancergenome.nih.gov/

financiamento:. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

CONFLITO dE iNTERESSES:. he autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a causa mais comum de morte entre as mulheres com câncer ginecológico em todo o mundo, com a elevada taxa de mortalidade atribuível ao estágio avançado em que é diagnosticada, geralmente muito tempo após a ocorrência de metástase intraperitoneal [1]. A fim de metástase de ocorrer, as células de cancro do ovário, muitas vezes alterar a expressão de proteínas envolvidas na interacção de matriz extracelular, tais como CD44, para modular a invasão [2, 3]. Tal como uma molécula de adesão celular e uma grande glicoproteína extracelular, o CD44 receptor de ácido hialurónico tem sido implicada na invasão de tumores e metástases em cancros da mama, do pulmão, cancros gastrointestinais e [2].

CD44 é codificado por um máximo de 20 exons, 10 dos quais são referidos como exons variante. A isoforma padrão (CD44s) contém apenas 10 exões, incluindo os primeiros 5 exões da extremidade 5 ‘e os últimos 5 exões da extremidade 3’, por conseguinte, falta os exões variantes no meio, referido como V1-V10 ou exões 5a -15 em nomenclatura padrão [1, 4, 5]. CD44s é a isoforma mais ubíquos, amplamente expressa na superfície da maioria dos tecidos e todas as células hematopoiético em que é responsável pela homing de linfócitos e outra célula-célula e as interacções célula-matriz extracelular. Um grande número de isoformas de splicing alternativo de CD44 existentes que contêm uma combinação de exões variantes (V1 a V10) inseridos na região justamembranar extracelular sob o controlo de proteínas reguladoras de splicing epitelial (PEIS) 1 e 2 [6]. Muitos isoformas variantes CD44 tem expressão específica de tecido; CD44v8-10 é expresso em tecidos epiteliais e nos carcinomas do tipo epitelial do pâncreas, da próstata, da mama, do pulmão e [7], em que tem sido extensivamente estudada como um marcador específico de células malignas, com o aumento da expressão observada durante a carcinogénese gástrica em um modelo de murino e na adenoma a progressão do carcinoma colorrectal em cancro humano [8-10] e cancros gástricos [11].

CD44s isoformas e variantes de CD44 tem sido implicado na resistência à droga e identificados como marcadores de células estaminais [ ,,,0],12]. No cancro do ovário, os estudos utilizando a expressão de CD44s e suas isoformas variantes em resultados contraditórios avaliar o prognóstico produziram, com alguma exibição diminuiu prognóstico, e outros melhorada prognóstico, ou nenhum efeito [13]. No entanto, os estudos sobre as isoformas contendo diferentes exões variante individual no cancro do ovário de um modo geral sugerido melhoria na sobrevivência global associada com isoformas de splicing de CD44 [14]. A variante epitelial emenda 8-10, expressando V8, V9 e V10 juntos, não foi examinado no câncer de ovário seroso de alto grau; Portanto, é a confiabilidade e viabilidade, em predizer o prognóstico foi investigada neste estudo.

Materiais e Métodos

The Cancer Genome Atlas (TCGA) análise de dados

dados de expressão (Nível 3 ) sobre CD44s documentados e isoformas variantes CD44 para tumores do ovário seroso cystadenocarcinoma foi analisado em uma coorte de 255 indivíduos no TCGA (após censura amostras de tumores recorrentes e se concentrar apenas sobre a doença de alto grau (G2 e G3)). Usamos Nível 3 dados para evitar re-analisar os conjuntos de dados brutos; Para mais informações consulte a publicação original [15]. Com base no arquivo de anotação para a análise RNAseqV2 (S1 Table), definiu-se uma isoforma CD44 como v8-10 contendo os CHR11 exons: 35.229.652-35.229.753: +, CHR11: 35.231.512-35.231.601: + e CHR11: 35.232.793-35.232.996: +. A análise de sobrevida da parte superior e inferior de 10% com base na média de expressão dos três (v8-10) exons, foi executado usando a “sobrevivência” e um pacote de “survMisc” em R. Especificamente, utilizou-se o supremo (Renyi) versão do o teste de log-rank que é projetado para a análise de atravessar curvas de sobrevivência.

tumor de tecido análises Micro-matriz

Um segundo grupo de pacientes cystadenocarcinoma seroso do ovário 210 de alto grau internado no Massachusetts general Hospital e Brigham and Cancer Center Hospital Dana Farber das mulheres entre 1993-2009 [16] foram estudados em análise placa interna (IRB) aprovou protocolos (MGH2007P00001918 ou DFCI 02-051). amostras do núcleo do tumor (3 mm) foram obtidos no momento da cirurgia redutora inicial, pontuados de acordo com as diretrizes Fédération Internationale de Obstetrícia Ginecologia (FIGO), e foram fixados em formalina e embebidos em parafina. Todos os tumores biópsias, descartadas amostras identificou-de ascite, e respectivas informações do paciente foram coletados sob protocolos IRB-aprovados depois foi obtido consentimento informado por escrito. Cada novo bloco de parafina continha 24 núcleos tumorais distribuídos aleatoriamente, com pelo menos 2 núcleos por paciente, e foram seccionados a 7 microns de espessura, como descrito anteriormente [17]. A imuno-histoquímica foi realizada em lâminas com microarray de tumores secções (TMA) como publicado anteriormente [16], antes de serem bloqueadas utilizando uma solução de 1% de albumina de soro bovino (BSA) com soro de burro a 2% em tampão fosfato salino (PBS) durante 1 hora a sala temperatura, incubadas com um anticorpo para CD44v8-10 (CD44v9 RV3) [4] em 1: 12.500 a noite numa câmara humidificada a 4 ° C, lavadas com PBS, e incubaram-se utilizando um secundário de cabra anti-rato de peroxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo ( Santa Cruz biotechnology, Dallas TX) a 1: 200 durante 1,5 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas e coradas com uma solução de diaminobenzidina (DAB), contra-coradas com Hematoxilina (Dako, Carpinteria CA), desidratado e lamínulas antes de ser digitalizado e digitalizados com um Scanscope (Leica, Buffalo Grove IL) e analisados ​​com o software Aperio Imagescope (Leica, Buffalo Grove IL). A positividade e intensidade (PI) pontuações foram calculados como o produto da fracção de área manchada (positividade) e a sua intensidade. Para a finalidade da análise de coloração, examinámos apenas os núcleos em que mais do que 50% do tecido permaneceram intactas sobre a lâmina de vidro. Com base neste critério, tivemos 6 pacientes para os quais foram calculados a pontuação PI utilizando um único núcleo, e 203 em que tomou a pontuação média PI a partir de 2 núcleos, para um total de 209 pacientes analisados. sobrevida do paciente foi calculado a partir da data do diagnóstico até à data da morte, ou entrada de cuidados paliativos quando não estiver disponível e convertido de dias a meses dividindo-se o número de dias em 30. A sobrevida global foi analisado por gráficos de Kaplan-Meier e significância estatística inferidas por log-Rank testes. Correlações com parâmetros clínicos foram feitos usando a análise do qui-quadrado. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Prism 6 (Graphpad, La Jolla CA).

Linhas Celulares

Uma série de linhas celulares de cancro do ovário primárias foi derivada de ascite de pacientes, por protocolo aprovado pelo IRB (# 2007P001918 /MGH) [16]. Resumidamente, após a centrifugação do fluido de ascite, os sedimentos celulares foram introduzidos na cultura de tecidos em duas condições diferentes (aderentes e esferóides). Em culturas aderentes, as células foram mantidas em confluência completa por várias semanas a vários meses até foram observados clones de células epiteliais apertados. Contaminando tipos de células (leucócitos, mesotelial, e células de fibroblastos) foram removidos por digestão com tripsina repetido até parcial podia ser observada nenhuma tipos de células contaminantes. Subsequentemente, as células foram passadas, pelo menos, 5 vezes a diluição de 1:10 para derivar linha celular homogénea estável. Alternativamente, para culturas esferóides (indicado pelo sufixo-SPH), as células foram plaqueadas em frascos de 24 h para as células normais e não-aderentes foram recolhidas e transferidas para novos frascos de ultra-baixo de fixação, enquanto as células ligadas foram descartados. esferóides culturas foram passadas pela dissociação e diluiu-se 1:10 em pelo menos 5 passagens para derivar linhas celulares homogéneas estáveis. O painel de linhas celulares primárias consiste em 16 cancros do ovário epiteliais serosa (pTAB, pTAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-SPH, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL- SPH, PTAM-SPH, Ptak-SPH), um endometrióides cancros epiteliais (PTAP-SPH), e um mucinoso câncer epitelial de ovário (PTG) cultivadas em condições de cultura aderentes e /ou esferóides.

linhas de células primárias foram mantidas em cultura de células em monocamadas em meio DMEM: F12 com 10% FFBS 1% de penicilina /estreptomicina, 1% de L-glutamina (Corning, Nova Iorque NY) ou como esferas não-aderentes na área do tumor meio isento de soro [16] a 37C, numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. linhas celulares Para além disso, o cancro do ovário estabelecidos OVCAR5 [18] e OVCAR8 [19], foram mantidas em meios DMEM com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 1% de penicilina /estreptomicina, 1% de L-glutamina (Corning, Nova Iorque NY).

Q-PCR e Princípio Análise de componentes

PCR quantitativa foi realizada em linhas de células primárias derivadas de ascite dos pacientes (pTAB, pTAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-SPH , ptAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, PTAP-SPH, PTAM-SPH) e nas linhas de células de câncer epitelial de ovário estabelecidos OVCAR-5 e OVCAR-8. Os sedimentos celulares foram obtidas após centrifugação, lavadas com tampão fosfato salino (PBS), e congeladas a -80 ° C, até a extracção de ARN utilizando um Qiagen RNeasy Mini Kit (Germantown, MD) e quantificados por Nanodrop. ADNc foi transcrito de forma reversa, utilizando 500 ng de ARN por amostra com Superscript III First Strand Super Mix Síntese (Invitrogen, Carlsbad CA), e qPCR foi realizado por fabricantes estabelecidos de transformação epitelial para mesenquimal (EMT), e incluindo pluripotência CD44s, CD44v8-10 [ ,,,0],20], vimentina, e-caderina, ESRP1, Zeb1, Lin-28, Sox-2, Oct-4, N-caderina, e EpCAM, com GAPDH como um padrão interno. A expressão relativa foi inferida pela determinação de limite de ciclo (Ct) e calculada usando 2 ^ transformação -ΔCt normalizados para GAPDH Ct. análise de componentes principais (PCA) foi realizada utilizando estes valores de expressão do gene após transformação log usando o pacote de “FactoMineR” em R. APC com mesenquimais, assim como marcadores epiteliais claramente separadas no primeiro componente, enquanto EMT e pluripotentes marcadores foram perpendicular no segundo componente, mas indistinguíveis uns dos outros.

análise de Western

As pelotas de células colhidas a partir de um painel de linhas celulares de ascites de doentes primárias (pTAB, pTAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW -sph, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, PTAP-SPH, PTAM-SPH, Ptak-SPH) e 2 linhas celulares de cancro estabelecidos (OVCAR-5 e OVCAR-8) Lavaram-se duas vezes com 10 ml de PBS gelado e extractos inteiros de células, preparados em 1x tampão de lise (Cell Signaling Technology, Danvers MA) em água estéril, contendo um cocktail inibidor da protease (Roche Indianapolis, IN) e comprimidos inibidores de fosfatase (Roche, Indianapolis IN). A proteína total por lisado foi obtido utilizando um ensaio de ácido bicinconínico Pierce (BCA) Kit de quantificação de proteína (Thermoscientific, Rockford IL) e quantidades iguais de proteínas (15ug) reduziu, carregado em cada pista, e separadas por NuPAGE a 4-12% (géis life Technologies, Carlsbad CA). As proteínas foram transferidas para Immobilon difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica MA), bloqueadas em leite magro a 5% dissolvido numa solução a 20 (TBST) solução salina tamponada com Tris e Tween e depois incubadas durante a noite a 4C para detectar completo transmembrana comprimento ou proteína intracelular com rato do anticorpo primário anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) [8], ou mouse CD44s anti (R + D, Minneapolis MN) (1: 500), de coelho anti Vimentin (Abcam, Cambridge MA) (1: 1000), ou de coelho anti-e-caderina (Abcam, Cambridge, MA) (1: 10.000) anticorpos, cada um diluído em 5% de leite magro em TBST. As membranas de PVDF foram então lavados com TBST e incubadas com um anticorpo secundário adequado, quer um (tecnologia Cell Signaling, Danvers MA), anti-coelho, anti-rato (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA), ou anti rato (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) anticorpo conjugado com um indicador de peroxidase de rábano, cada um a 1: 10.000 em leite 5% em solução de TBST, durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram de novo lavados em TBST e tratou-se com substrato de quimioluminescência ECL ™ Pico para visualização de proteínas (Thermoscientific, Rockford IL). abundância relativa de proteína foi medida por densitometria das bandas de Western blot e normalizada para a carga de proteína igual usando densidade de B-actina por análise de software J imagem.

ascite de pacientes foram obtidos a partir paracenteses terapêuticas frescos, por um protocolo IRB-aprovado (# 2007P001918 /MGH). 1 ml de fluido sobrenadante de ascites amostras foram sonicada, centrifugada à velocidade máxima durante 10 minutos para limpar, e diluiu-se 1:50 em tampão de lise, antes da execução de uma transferência de Western como descrito acima. As membranas foram incubadas com anti rato CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) ou de murganho anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500) durante a noite a 4C e desenvolvido como acima utilizando substrato femto quimioluminescência ECL ™ (Thermoscientific, Rockford IL) para determinar a presença do domínio extracelular clivada e segregada solúvel de CD44s CD44v8-10 e verter em fluido de ascites paciente. Como um controlo de carga o uso do anti-IgG humana de cadeia pesada e leve de rábano conjugado com peroxidase de 1: 20000 (Life Technologies, Carlsbad CA). As imagens foram capturadas por BioRad XR Gel Doc software imagem laboratório (BioRad, Hercules CA) e analisados ​​por Imagem-J como uma percentagem do IgG abundância cadeia leve. Shed nível de proteína foi então correlacionada com a sobrevida do paciente, com extremidades sendo data da morte, ou entrada de cuidados paliativos quando não estiver disponível.

A imuno-histoquímica de marcadores epiteliais e mesenquimais em pDXA explantado tumores

paciente- xenotransplantes derivados de ascite (pDXA), onde estabelecidas através da implantação de 5 milhões de células de linhas primárias de baixa passagem (PTAP-SPH, PTW, PTAM-SPH, PTH, pTAB-SPH, PTD) ressuspenso 1: 1 em Matrigel (Corning, Nova York NY ) e implantado por via subcutânea nos flancos de ratinhos NOD /SCID /IL2RGamma Jax ™ (Jackson Laboratory, Bar Harbor ME) ao abrigo de um protocolo experimental IACUC-aprovado (# 2009N000033) [16]. tumores OVCAR5 foram derivados utilizando um protocolo idêntico xeno usando 1 milhão de células. Os tumores resultantes foram fixadas em paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina e seccionados a 7 micrómetros de espessura na Fisher Scientific

Sonda Em mais lâminas de microscópio

(Fisher Scientific, Nova Iorque NY). As lâminas foram desparafinadas em xileno, re-hidratadas em álcool, e microondas em citrato de sódio tamponada (0,01 M) para a recuperação de antigénio durante 5 minutos a alta potência, 10 minutos à potência de 10%, e 10 minutos na potência de 20%, em seguida, enxaguadas em água destilada . As lâminas foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 3%, lavadas e bloqueadas utilizando uma solução de BSA a 1% com soro fetal de vitelo a 2% (FCS) em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, em seguida, incubadas com anticorpo CD44v8-10 (RV3 monoclonal de rato) (1: 12500), e comparados com os incubadas com CD44s (R + D, Minneapolis MN, 16ug monoclonal de rato /ml), anticorpo anti e-caderina (Abcam, Cambridge, MA, coelho) (1: 500), ou anti vimentina anticorpo (Abcam, Cambridge, MA, coelho) (1: 500) durante a noite numa câmara humidificada a 4 ° C. Após incubação com um anticorpo de HRP de cabra anti-rato (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX), com HRP de burro anti-rato ou um anticorpo de HRP anti-coelho de burro (1: 200) (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) durante 1,5 horas à sala temperatura, as lâminas foram lavadas e coradas com uma solução de DAB (Sigma Aldrich, St Louis MO), e contra-coradas com hematoxilina (DAKO, Carpinteria CA), desidratadas, e lamínulas. micrografias representativas foram obtidos por comparação espacial de proteínas previamente detectados por análise de Western das linhas de células primárias a partir do qual os tumores foram cultivadas.

Resultados

Expressão de isoformas de variantes de CD44 contendo o exão 8 a 10 ( V8-10) mRNA em The cancer Genome Atlas (TCGA) RNAseqV2 ovário dataset câncer

Para determinar os níveis de expressão de mRNA de CD44s e sua variante V8-10 contendo isoformas (Fig 1A) em tumores de ovário seroso, analisamos o recurso RNAseqV2 de TCGA, que inclui uma coorte de 255 amostras de tumor de grau 2 e 3. A expressão de exões individuais V8, V9 e V10 correlaciona-se fortemente ao longo de todas as amostras, as quais também podem ser observados para os exões “padrão” 1-5 e 15-18 (Fig S1), o que sugere que eles são predominantemente expressos como um bloco de V8 -10. Além disso, os exões V8-10 parecem ser o mais abundante de todos os exões variáveis, sugerindo cd44v8-10 contendo isoformas predominantes são os transcritos de splicing alternativo de CD44 (Figura 1B). Os pacientes foram estratificados com base nos níveis de expressão de mRNA médios de exons V8-10 em seu tumor e divididos em alta e baixa expressar grupos (superior e inferior 10%), a partir da qual e curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram gerados indicando uma significativamente melhor prognóstico em alta expressadores (p = 0,035) (Fig 1C). Para determinar a contribuição relativa de cada isoforma distinta contendo exons v8-10 comparamos sua expressão geral e estimados a influência na sobrevivência. A tendência para o aumento da sobrevida foi observada para todos, mas um isoformas CD44 contendo V8-10, embora nenhuma foi significativa em isolamento (S2 Fig). A análise multivariada Cox modelo de taxa de risco proporcional descobriu que apenas a idade teve um impacto significativo na sobrevida global (Tabela 1).

A) Representação esquemática das isoformas de splicing alternativos expressando exons variáveis ​​v8-v10. B) Distribuição de dados de expressão RNAseq2 mais de 254 amostras para todos os exons CD44 no conjunto de dados câncer de ovário TCGA. As amostras com nenhuma expressão foram omitidos desta figura. C) de Kaplan-Meier das curvas de sobrevida comparando CD44v8-10 alta e baixa expressando amostras e tabela correspondente com o número de pacientes em cada ponto no tempo. Nós definimos o alto expressando set (vermelho) eo baixo expressar set (preto) como as amostras com a expressão mais alta e mais baixa, respectivamente, usando a parte superior /inferior a 10% da expressadores, com o enredo que se estende até 5 anos. As barras representam censurado pontos de dados.

CD44v8-10 coloração em tumores primários está associada com maior sobrevida em uma coorte independente de pacientes com câncer de ovário seroso 210 de alto grau analisadas por microarray tumor imunohistoquímica

para confirmar as tendências observadas na análise dos dados TCGA sugerindo um melhor prognóstico foi associado com expressão CD44v8-10, decidimos examinar os níveis de proteína de CD44v8-10 em biópsias de tumores. A expressão de superfície da proteína transmembranar CD44v8-10 foi analisada no carcinoma do ovário seroso de alto grau por imunohistoquímica usando um anticorpo específico em CD44v8-10 um microarray de tumores contendo amostras de tumor primário a partir de uma coorte de 210 pacientes. Todos os tumores eram de histologia seroso de alto grau com a grande maioria (71%) teve como pelo menos FIGO Fase III, e de Grau 3 (89%) no momento do diagnóstico (Tabela 2). Todas as amostras de microarray de tumores primários analisados ​​foram tomadas no momento da cirurgia redutora inicial. coloração difusa e focal foi observada no epitélio colunar de papilas, frequentemente na camada basal (setas) (Figura 2A, 2B e 2C) do epitélio, mas não no estroma do tumor em qualquer um dos núcleos (Figura 2D), e sempre na superfície da célula em vez de uma localização intracelular ou citoplásmico (Fig 2B, inserção). A intensidade total de pixels positivos e número total de pixels positivas, conforme determinado pelo software Imagescope, foram combinados em uma pontuação positiva intensidade (PI), o qual foi calculada a média dos dois núcleos representativos para cada paciente, e utilizado para a estratificação de pacientes. Escolhemos a parte superior e inferior 10 e 20 por cento dos pacientes para comparar as diferenças entre expressores de sobrevivência baixas e altas de proteína de superfície CD44v8-10 transmembranar, e encontraram um aumento significativo na sobrevivência, tanto para cima de 10% e 20% dos pacientes que expressam níveis elevados de CD44v8-10, com uma sobrevida mediana de 30 e 29 meses quando comparados aos pacientes que expressam a mais baixa de 10% (p = 0,0181) e 20% (p = 0,0262), com uma sobrevida mediana de 49 e 52 meses, respectivamente (Fig 2E) . A composição da parte superior e inferior de 10% e 20% dos pacientes foi semelhante ao examinar os parâmetros clínicos de grau FIGO, fase, e a idade (Tabela S2), com excepção de uma diferença de o pequeno número de pacientes de grau 2. Quando esta população de grau 2 foi excluído da análise para descartar a influência desses tumores de grau mais baixos raros, a diferença de sobrevivência permaneceu significativa entre a maior ea menor expressadores de proteína CD44v8-10 (S3 Fig).

embebidos em parafina núcleos tissue microarray fixadas foram coradas por imuno-histoquímica utilizando um anticorpo contra o CD44v9, digitalizados utilizando um Aperio Scanscope, e analisados ​​utilizando o software Aperio Imagescope algoritmo de contagem positiva de pixel. Imagens representativas tomadas a elevada (40x) poder mostrar epitelial basal coloração em A e C, coloração epitelial superfície mais difusa em b, e estroma negativa com células epiteliais positivas isoladas d. e.) sobrevida global de pacientes com alto grau de carcinoma de ovário seroso por expressão variante de CD44. Esquerda variante expressão maior e menor 10% e direit maior e menor de 20% de expressão da variante, demonstra a sobrevida global significativa nos mais altos expressadores com p = 0,0181 e p = 0,0262, respectivamente.

a análise multivariada dos parâmetros clínicos registados incluindo a idade, grau, estágio, estado debulking, e CD44v8-10 intensidade de coloração foram analisados ​​para o seu efeito sobre o prognóstico (Tabela 3).

a idade teve o mais forte influência sobre o prognóstico seguido de CD44v9 intensidade de coloração do tumor, enquanto o estadiamento FIGO ou classificação e debulking status não foram significativas. Desde o cox razão de risco proporcional (Tabela 3) mostrou uma dependência para a idade e CD44v8-10 expressão do marcador da superfície, nós quisemos explorar correlação variável usando uma estratificação imparcial paciente para gerar uma árvore de decisão que maximiza as diferenças de prognóstico (Fig 3). Nós estratificada grupos de pacientes com base na idade, estágio FIGO, classificação, estado debulking, e expressão CD44v8-10. A classificação resultante mostrou que os pacientes de 59,2 anos de idade não se beneficiam significativamente de maior expressão de CD44. Os pacientes mais jovens mostram uma forte correlação de melhor sobrevida ao ter alta marcador de superfície CD44. Estas observações refinar os resultados do modelo de relação de cox perigo e definir uma árvore de decisão que poderia ser usado clinicamente para maximizar o poder prognóstico da coloração do tumor CD44v8-10 (Fig 3).

Os pacientes do sampleset matriz tumor foram estratificados usando Idade, CD44v9 intensidade de coloração (σ de expressão CD44v9), grau, estado debulking e pontuação FIGO. A análise multivariada foi realizada e efeito porte classificou para gerar uma árvore de decisão binária para maximizar o poder prognóstico de uma forma imparcial e atribuir significado estatístico. Apenas variáveis ​​estatisticamente significativas (idade e coloração CD44v9) são mostrados junto com seu efeito sobre a sobrevida global paciente em parcelas de Kaplan-Meier. As barras representam censurado pontos de dados.

A expressão de CD44v8-10 correlaciona-se com um fenótipo epitelial

Foi realizada análise de componentes principais (PCA) (FactoMiner) na expressão de mRNA, como definido por qPCR valores de 2

-ΔCt normalizadas para GAPDH, numa série de diferentes epiteliais (EPCAM, ESPR1, caderina-e) e mesenquimais (ZEB1, vimentina, N-caderina) marcadores num painel de 15 primário (pTAB, ptAB- SPH, linhas de células de cancro do ovário ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-SPH, ptAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, PTAP-SPH, PTAM-SPH) e 2 estabelecidos (OVCAR5, OVCAR8). O PCA confirmou que mRNA CD44v8-10 expressão se associa com outros marcadores epiteliais, enquanto CD44s expressão correlaciona-se com marcadores mesenquimais em câncer de ovário (Fig 4A). A expressão de marcadores de pluripotência (LIN28, SOX2, OCT4) foi associada com nem marcadores epiteliais nem mesenquimais, sugerindo stemness é independente da epiteliais ou mesenquimais status (Fig 4A).

A) Análise de componentes principais utilizando qPCR quantificação relativa de a expressão de células epiteliais, mesenquimais, e marcadores de pluripotência em linhas celulares de cancro do ovário primárias. Setas coloridas indicam as instruções para cada grupo de marcadores. B) A análise de Western de lisados ​​de proteína linha de células primárias para a expressão da proteína CD44v8-10 utilizando um anticorpo monoclonal de rato para CD44v8-10 humano.

De modo semelhante, a expressão da proteína CD44v8-10 em células derivadas de pacientes os lisados ​​de linhas por western blot demonstrou uma tendência da co-expressão de CD44v8-10 com e-caderina, ou CD44s com vimentina, de um modo mutuamente exclusivo (Figura 4B), confirmando os dados qPCR CD44v8-10 indicando que é um marcador de células epiteliais e CD44s um marcador mesenquimal no câncer de ovário seroso de alto grau.

para determinar a expressão espacial de CD44v8-10, e sua relação com os epiteliais ou tumorais mesenquimais histologia, xenotransplantes derivados de pacientes de ascite (de pDXA) [16] foram analisados ​​por imuno-histoquimica (IHC). No geral, os tumores cresceram

in vivo

recapitulou o epitelial ou mesenquimal heterogeneidade observada na linha de célula primária

in vitro

(Fig 4). Os tumores com um fenótipo epitelial altamente expressa níveis baixos de vimentina, que foi restrita a células do estroma (PTW, OVCAR5) e níveis elevados de expressão CD44v8-10, que era específico para a superfície celular das células cancerosas do tumor (Fig 5A, inserir). Inversamente, quanto mais tumores mesenquimais (PTH, esferas PTAM, e esferas pTAB) expressa vimentina em ambas as células cancerosas epiteliais, bem como as células estromais de tumor, e tinha muito baixo de expressão de CD44v8-10 (Fig 5B). Os tumores de fenótipo intermediário com ambas as características epiteliais e mesenquimais tinham expressão de vimentina CD44v8-10 e nas células epiteliais, bem como do estroma (figura 5C).

coloração de anticorpos de secções de tecido a partir de tumores desenvolvidos in vivo após injecção de 1 a 5 milhões de células de cancro do ovário derivado do paciente primárias. secções representativas de tumores derivados de OVCAR5, PTAP-SPH, Pt W (A), PTAM-SPH, PTH, pTAB-SPH (B) e PTD (C) são mostrados. CD44v8-10 e Vimentin coloração imuno-histoquímica é mostrado com counterstain hematoxilina em 100x. CD44v8-10 rotula a superfície de células de cancro epiteliais (de inserção), enquanto que as etiquetas vimentina em células estromais de tumores mais epiteliais e a maioria das células em mais tumores mesenquimais (inserção). Os tumores foram agrupados em epitelial (A), mesenquimal (B) ou fenótipo misto (C) com base na coloração.

Solúvel CD44v8-10 é detectável no sobrenadante das amostras de ascites e correlacionam-se com pior prognóstico

Foi avaliado o potencial para detectar o domínio extracelular solúvel de CD44v8-10 como um fragmento clivado em ascite fluido sobrenadante utilizando Western blot de 28 amostras de ascites de doentes diferentes. Solúvel clivado CD44s é expressa de forma homogénea em todas as amostras, incluindo os controlos de ascites benignos, sugerindo que é uma proteína do sangue ubíqua. Interessantemente, o domínio extracelular solúvel clivado e derramou de CD44v8-10 era detectável em 27 de 28 amostras de ascites de doentes ovarianos, com níveis muito variáveis, mas não foi detectável em ascites benignos do fígado, sugerindo que pode ser específico para o cancro. Um Western blot representativo de 6 ascite paciente é demonstrado na Figura 6A. A abundância de proteína do domínio extracelular solúvel de CD44v8-10 foi medido por densitometria das bandas de Western blot e normalizado para o carregamento igual de proteína utilizando IgG densidade cadeia leve por análise de imagem de software J. Após a estratificação de pacientes com base nos níveis CD44v8-10, observamos uma diminuição significativamente a sobrevida em pacientes com altos níveis de CD44v8-10 solúvel (50% superior), com uma sobrevida média de 39 meses contra 59,27 meses para a parte inferior de 50% (p . = 0,0481) (Fig 6B)

a) amostras de Ascites (N = 28; 6 amostras apresentadas como representativos) foram obtidos a partir de pacientes submetidos a terapêutica paracentese, e sondaram-se por western blotting para CD44v8-10, CD44s, e anti cadeia humana leve IgG como controlo de carga. densitometria de proteínas foi realizada e as amostras foram analisadas quanto a níveis de expressão de CD44v8-10 solúvel e separados em dois grupos iguais de altos e baixos níveis CD44v8-10.