Abstract

células tumorais circulantes (CTCs), galpão de tumores primários e disseminados em sangue periférico, estão desempenhando um papel importante na metástase. Mesmo após o isolamento dos CTC a partir de sangue, as células alvo são misturadas com uma população de outros tipos de células. Aqui, propomos um novo método para a análise de mistura de células ao nível de uma única célula usando um dispositivo microfluídico que contém micropoços eletroativos vestiu. Dieletroforética força (DEP), induzida pelos eléctrodos modeladas na superfície inferior dos micropoços, permite aprisionamento eficaz e posicionamento estável de células individuais para análises bioquímicas de alto rendimento. Foi demonstrado que vários on-chip incluindo análises de imunocoloração, viabilidade ensaio /apoptose e hibridização in situ fluorescente (FISH) ao nível de uma única célula pode ser realizado apenas pela aplicação de reagentes específicos para cada ensaio. Nosso método simples deve ajudar muito a discriminação e análise de células de câncer raro entre uma população de células sanguíneas

Citação:. Kobayashi M, Kim SH, Nakamura H, Kaneda S, Fujii T (2015) As análises de células de câncer no -Level Cell único Usando array Device eletroativos Micropoço. PLoS ONE 10 (11): e0139980. doi: 10.1371 /journal.pone.0139980

editor: Arum Han, Texas A M University, United States |

Recebido: 06 de setembro de 2015; Aceito: 18 de setembro de 2015; Publicação: 11 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kobayashi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos os dados são incluído no manuscrito

Financiamento:.. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Agência Japão Ciência e Tecnologia para o Núcleo de Investigação do Evolutivo Ciência e Tecnologia (CREST) ​​e para o Programa Estratégico Internacional de Pesquisa Cooperativa (SICP)

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

circulantes células tumorais (CTCs), galpão de tumores primários e metastáticos e fluindo para o sangue, são considerados. como uma das principais causas de metástases do cancro [1]. Contar o número de CTC no sangue periférico torna possível monitorizar o efeito terapêutico e prognóstico [2]. Um desafio na detecção dos CTC numa amostra de sangue é que a existência de CTC é extremamente raro e misturado com componentes de sangue normais (1 em 10

9 células do sangue). dispositivos microfluídicos são adequados para triagem e análise de células raras desde que um pode lidar eficientemente com os fluidos celulares complexas, com o mínimo de danos às células em suspensão [3, 4]. Além disso, a capacidade dos dispositivos de microfluidos para lidar com o grande volume de amostras de sangue completo já foi mostrado [5]. Recentemente, vários grupos têm vindo a desenvolver dispositivos de microfluidos para isolar CTC a partir de componentes de sangue normais, por exemplo, através da utilização de anticorpos, microposts revestidos dieletroforese, a separação baseada em tamanho por um microfiltro ou acoustophoresis, etc. [6-11]. Embora os métodos anteriores usando dispositivos microfluídicos demonstrado com sucesso separação de CTCs, as células separadas têm de ser recolhido e, preferencialmente, ser analisados ​​ao nível de uma única célula.

A questão prática na análise CTC é que as células cancerosas são misturados com células sanguíneas normais, mesmo após o isolamento dos CTC a partir de sangue. Os métodos de isolamento CTC anteriores mostram trade-off entre a recuperação de CTCs e depleção de células brancas do sangue (leucócitos) [9-11]; a taxa de recuperação mais elevada de CTCs, a taxa de esgotamento mais baixo de glóbulos brancos. Estes resultados indicam que as células cancerosas isoladas ainda são misturados com um grande número de glóbulos brancos. Por exemplo, um método utilizando a depleção de microfluidos WBC magnetophoretic permite que a depleção de 3,8 log de glóbulos brancos e um rendimento de 97% de células cancerosas [12]. Se uma amostra de sangue original contém células 10 com câncer e 10

6-glóbulos brancos, uma amostra purificada contém células 10-câncer e 156-glóbulos brancos após o isolamento com o método de esgotamento WBC magnetophoretic. Assim, após o isolamento das células alvo a partir de sangue, a discriminação entre as células cancerosas e glóbulos brancos é altamente necessário para detectar ou analisar as células alvo.

imunomarcação ou hibridação in situ fluorescente (FISH) é método amplamente usado para a discriminação de células cancerosas. No entanto, os protocolos convencionais, utilizando um tubo de ensaio ou uma placa de microlitro requerem grande volume de reagentes, incluindo anticorpos ou sondas para a hibridação. Além disso, as centrifugações, necessário para a troca de reagentes de cada ensaio, possivelmente causar perda crítica das amostras originais ou danos sobre a viabilidade celular, assim como a função da célula devido a fortes forças centrífugas que actuam sobre uma célula [13-15]. Um método simples e eficiente para ensaio bioquímico é, portanto, altamente desejável para diminuir possíveis riscos de os métodos convencionais.

Aqui, propomos um novo método para on-chip de células-câncer única análises usando matriz micropoços electroactivo (EMA) dispositivo. A EMA contém modelado eletrodos de película fina na parte inferior de cada micropoço para unicelular prendendo com dieletroforese (DEP) [16, 17]. Desde DEP vigor prevê trapping rápido, ativo e estável, poderíamos de forma eficiente as células cancerosas armadilha suspensa em solução de amostra. células presos pode ser realizada de forma estável em um chip por DEP, permitindo a troca rápida de reagentes com um volume de amostra extremamente pequena. Assim, de alto rendimento ensaios bioquímicos para células individuais vestiu são facilitados. Nós demonstramos a viabilidade da nossa abordagem com uma mistura de diferentes tipos de células através da realização de três tipos de ensaios; discriminação de células de câncer por imunocoloração, a viabilidade de ensaio /apoptose e fluorescente a hibridização in situ (FISH). Todo o processo para ensaios necessita apenas de injecção sequencial da suspensão de células e reagentes para as análises sem sistemas de válvulas complicadas ou tubos. Esperamos que o nosso método simples facilita de alto rendimento e uma única célula paralelo analisa, ao eliminar manipulações celulares extras fora do dispositivo.

eletroativos Micropoço matriz

Design by

O dispositivo consiste de um canal microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS), e um substrato de vidro que contém um grande número de micropoços fabricadas em (ITO) eléctrodos de óxido de índio e estanho interdigitada (Fig 1A). A distância entre os eléctrodos é cerca de 6 ^ m e o diâmetro de micropoços é de 30 um, que é maior do que o diâmetro das células alvo (20 um). E a altura da estrutura micropoço, que foi feita de resina epóxi, é de 25 uM. Os micropoços estão alinhadas com os eléctrodos interdigitados ITO, a fim de localizar um par de eléctrodos (ânodo e cátodo), em cada um dos poços. Um dispositivo contém 3168 micropoços. campo eléctrico aplicado é altamente localizada no interior de cada micropoço uma vez que os eléctrodos interdigitados estão localizados na parte inferior dos micropoços. Figura 1B mostra o procedimento de análise de uma única célula. Primeiro, as células são introduzidas no microcanal e preso em micropoços utilizando DEP positiva induzida pela alternância de tensão aplicada aos eléctrodos. Em seguida, os reagentes para as análises são introduzidos no canal de fluidos. Fig 1C mostra a imagem de células preso no micropoços.

(a) Configuração do dispositivo e as dimensões da microplaca e eletrodos interdigitados. câmbio (b) trapping celular e reagentes para análise de uma única célula. A suspensão de células é introduzida no canal microfluídico no dispositivo e as células são presos em micropoços de DEP positiva. Depois de aprisionamento de células, análises das células aprisionadas são realizados através da introdução de reagentes necessários para o microcanal. (C) Imagem de células DU145 Trapped (indicado pelas setas) em micropoços.

Fabrication

Figura 2 mostra o processo de fabricação do presente dispositivo. A forma dos eletrodos foram modeladas utilizando fotorresiste (AZP1350, AZ Electronic Materials) em um substrato de vidro revestido de ITO (TOA OPTICAL TECHNOLOGIES, LTD.), Seguido por ataque de ITO de 0,2 M FeCl solução

3 + HCl 6 M para 30 min à temperatura ambiente. Depois disso, o substrato foi limpo e enxaguado para remover o material fotosensitivo AZP1350 restante no ITO. A matriz micropoço é fabricado com fotorresiste (KMPR1005, NIPPON KAYAKU CO.) Em cima dos eletrodos padronizados. O fotorresiste estava nos eléctrodos revestidos de rotação, e um cromo foto-máscara modelado para a matriz micropoços foi alinhado com os eléctrodos de ITO estampados. O fotorresistente foi exposta a luz ultravioleta através de foto-máscara, seguido por desenvolvimento e enxaguamento.

(a) matriz de micropoços. Os eléctrodos interdigitados são fabricados por um processo convencional de padronização ITO e micropoços feitas de KMPR estão alinhados com o eléctrodo. (B) PDMS de chip fluídico. O chip fluídico é fabricado através do processo de soft-litografia. (C) Completado dispositivo de microfluidos feita por colagem duas partes em conjunto.

o PDMS chip de fluídica é fabricado através do processo de moldagem por réplica padrão como mostrado na Fig 2B. Fotorresistente (SU-8 2100, Microchem Co.), que serve como molde, foi modelado sobre uma bolacha de silício. O molde foi cuidadosamente limpos com isopropanol e água deionizada. (PDMS. Silpot 184, Dow Corning Toray, Co Ltd.) foi misturada com o agente de cura (proporção de 10: 1 em massa) e vertida sobre o molde. Em seguida, o PDMS foi aquecida a 75 ° C durante 1 hora, seguido de peeling da PDMS polimerizado a partir do molde. Furos como portas de acesso ao canal de fluxo foram perfurados para fora.

A fim de unir a matriz micropoços e PDMS de chip fluídico, eles foram expostos a O

2 plasma para ativar superfícies usando máquina reativa gravação iónica opostas ( RIE-10NR, Samco CO.). Também O

2 tratamento de plasma faz com que os micropoços KMPR eo hidrofílico canal de PDMS, o que garante fácil injeção de reagentes aquosos para o canal e os micropoços.

celular Trapping Usando DEP Força

neste estudo, as células introduzidas no microcanal estão ativamente preso em microplacas equipado com eletrodos interdigitados pela força DEP. DEP é um fenómeno no qual as partículas neutras mova quando é aplicado ao campo eléctrico não uniforme. A força DEP média de tempo pode ser aproximada em termos de efeitos dipolo como (1) onde

ε

m

é permissividade absoluta do meio,

r

é o raio da partícula, Re (

f

CM) é a parte real do fator de Clausius-Mossotti (

f

CM) relativa ao momento de dipolo induzido e e é o valor RMS do campo eléctrico aplicado. O

f

CM é (2) (3) (4) onde

ε

p

é permissividade absoluta do meio. As partículas desloca-se para um máximo do campo DEP (positivo) ou um mínimo de campo DEP (negativo) dependendo do Re (

f

CM) que representa a diferença entre as propriedades dieléctricas da partícula e o seu meio de suspensão (Figura 3) [18-20]. Re (

f

CM) pode ser controlada ajustando a condutividade do meio de suspensão e a frequência do campo eléctrico aplicado. Assim, as células estão presos em micropoços pela DEP positiva no caso de o dispositivo de EMA [16].

As partículas são atraídas para os eléctrodos devido à força DEP positiva, e repelidos dos eléctrodos devido à força DEP negativo .

Materiais e Métodos

Preparação de amostras

células U937 (linha celular de linfoma de monócitos leucêmica, obtidos a partir do Centro de Recursos RIKEN Bio, Japão), células DU145 ( a linha de células de cancro da próstata, obtidas a partir do Centro de Recursos RIKEN Bio, Japão) e as células PC3 (linha celular de cancro da próstata, obtidas a partir do Centro de Recursos RIKEN Bio, Japão) foram cultivadas numa incubadora humidificada (37 ° C numa atmosfera de 5% CO

2). O meio de cultura para todas as células foi RPMI 1640 (Invitrogen Corp.) suplementado com Soro de Bovino Fetal (10%, gemini Bio-products) e solução de penicilina-estreptomicina (1%, Sigma Chemical Co). O diâmetro médio de célula U937, células DU145 e PC3 célula foi de 10 uM, 20 uM e 22 uM, respectivamente. As células foram dispersas num tampão DEP (HEPES 10 mM, CaCl 0,01 mM

2, 59 mM de D-glucose e sacarose 236 mM; pH7.35) para ajustar a condutividade do meio de suspensão de células (21,4 MSM

-1) para a DEP positiva [21]. O tampão de DEP continha albumina de soro de bovino (1% p /v) para bloquear a adesão celular não específica. As células em meio de cultura foram centrifugados a 2000 rpm durante 5 min. Nós gentilmente removeu o meio de cultura e adicionou-se tampão DEP.

Configuração Experimental

O dispositivo microfluídico foi montada no palco de translação x-y localizado no microscópio invertido (IX71, OLYMPUS). As células foram monitorizadas com uma câmara (DP73, OLYMPUS), que foi instalado no microscópio. O potencial elétrico para DEP foi aplicada aos eletrodos ITO interdigitados com o gerador de função (WF1974; NF Corp.) através de um amplificador. (HSA4101; NF Corp.)

imunocoloração

células preso em os micropoços foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato) durante 10 minutos e lavou-se com PBS durante 5 minutos. Subsequentemente, eles foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 5 minutos e lavadas com PBS durante 5 minutos. As células foram imunocoradas com Hoechst33342 (DOJINDO) para o teor de ADN, conjugados com FITC anticorpos anti-citoqueratina (BD) para as células epiteliais e os anticorpos conjugados com PE anti-CD45 (Life Technology) para células de leucócitos durante 30 minutos. Finalmente as células foram lavadas com PBS durante 10 minutos. Os processos inteiros foram realizadas a uma taxa de fluxo de 3 mL min

-1.

Viabilidade e Ensaio de Apoptose

células foram expostas a Aprisionado Anexina V Alexa Fluor 488 (Invitrogen) no quarto temperatura na sala escura durante 30 minutos, seguida por permuta dos reagentes em reagentes misturados de tampão de ligação a Anexina (Invitrogen), iodeto de propídio (Invitrogen) e o azul calceína (Invitrogen) durante 10 minutos. Todo o processo foi realizado a uma taxa de fluxo de 3 min mL

-1.

Fluorescent Hibridização In Situ (FISH)

Interphase FISH foi realizada sobre as células preso no micropoços de acordo com o protocolo convencional com as seguintes modificações. Resumidamente, as células presos foram fixados com solução de Carnoy. O dispositivo foi lavada com 2 × tampão de solução salina-citrato de sódio (SSC, Abbott), desidratados numa série ascendente de álcool, e secou-se ao ar. foi adicionado à mistura da sonda (5’BCL-6 sonda marcada na sonda vermelho e 3’BCL-6 marcado em verde) para a hibridização. O ADN foi desnaturado a 73 ° C durante 5 minutos e depois hibridizou a 37 ° C durante 16 horas no termociclador (Beckman Coulter). Após incubação com 0,4 × SSC /0,3% de Nonidet P-40 (NP-40) a 73 ° C, o dispositivo foi transferida para 2 x SSC /0,1% de NP-40 à temperatura ambiente, foi no quarto escuro seco ao ar . DNAs foram contrastadas com DAPI (DOJINDO), selado com tampa de vidro.

Resultados e Discussão

Viabilidade do dispositivo para o On-Chip Imunomarcação

A viabilidade do presente dispositivo para análise de células-cancro único no chip foi demonstrada através da realização de imunocoloração após captura uma mistura de duas linhas celulares diferentes, incluindo células U937 (um modelo de células brancas do sangue) e células DU145 (uma linha de células de cancro). A suspensão de células foi introduzida no dispositivo com uma taxa de fluxo de 3 mL min

-1. Para a DEP positivo, 10-P e Vp potencial eléctrico sinusoidal a 8 MHz, foi aplicada aos eléctrodos de ITO interdigitados. Depois celular prendendo com DEP, realizou-se a imunocoloração para identificar as células presas. As células aprisionadas foram fixadas, permeabilizadas e coradas por injecção sequencial dos reagentes para a calha de dispositivo do orifício de acesso. As células foram coradas com Hoechst33342 (azul) Coloração ADN, anticorpos anti-citoqueratina conjugados com FITC (verde) para as células epiteliais e os anticorpos anti-CD45 conjugado com R-PE (vermelho) para células de leucócitos (Fig 4). células de citoqueratina-positivas foram considerados como uma célula de cancro, enquanto que as células CD45-positivas foram considerados como WBC. Fig 4 mostra prendido 11 células (em 10 poços, incluindo 1 poço com 2 células presas na parte superior esquerda), 3 células marcadas com o anticorpo anti-CK (verde) correspondentes a célula cancerosa e 8 células marcadas com o anticorpo anti-CD45 (vermelho) correspondente de WBC. Desta forma, a identificação de células cancerosas e WBC pode ser feito apenas por injecção sequencial de reagentes necessários para o dispositivo sem sistema de válvulas complexas ou equipamento adicional.

células DU145 presa e células U937 manchadas com Hoechst33342 (azul), O anticorpo anti-citoqueratina (verde) e anticorpo anti-CD45 (vermelho). imagem mesclada identifica células DU145 como um modelo de CTC (azul + verde).

Trapping desempenho nas diferentes linhas de células foi investigada pela contagem do número de células presas em micropoços após imunomarcação. Figura 5A mostra o padrão de captura de cada um dos tipos de células, onde a imagem representa toda a matriz no dispositivo e cada pixel representa cada micropoço. células DU145 tendem a ser preso na parte a montante da matriz de micropoços, enquanto as células U937 distribuídos aleatoriamente na matriz de micropoços. A razão pela qual seria o maior diâmetro de células DU145 do que a de células U937, gerando maior força DEP, como mostrado na Equação (1). Uma vez que a força induzida pela DEP é proporcional à cúbico de raio da célula, células DU145 recebe força maior do que a de células U937. O número total de células DU145 presos e células U937 foram 763 e 801, respectivamente. 39% das células foram introduzidas preso nos micropoços, e 33% dos micropoços foram ocupadas por uma única célula. Uma vez que os presentes micropoços eletroativos foram projetados para eficientemente armadilha de células DU145 único de que o diâmetro é maior do que a de células U937, o dispositivo mostra bom desempenho em aprisionamento de células DU145 única, onde 728 poços foram ocupadas por células DU145 individuais (598 poços foram ocupada por células DU145 individuais, e 130 poços foram ocupadas por células DU145 individuais e células U937 individuais). Apenas 15 poços foram ocupadas por duas ou três DU145 células. No entanto, várias células U937 podem ser facilmente preso em uma mesma micropoços desde célula U937 (11 um de diâmetro) é menor do que a de células DU145.

(a) na imagem de pixel de micropoços no dispositivo. Cada pixel corresponde cada micropoço no dispositivo e (b) Distribuição de conteúdo de células preso em micropoços. As cores mostram o conteúdo das células presas em micropoços.

Viabilidade e apoptose Ensaio

Foi investigada a viabilidade das células cancerosas aprisionadas para detectar e analisar selectivamente CTCs viáveis ​​que poderiam estar envolvidos na metástase. Uma vez que quase todas as células cancerosas no sangue são mortas por células citotóxicas tais como as células T, etc., e mortas devido aos anoikis ou o dano causado por tensão de corte [22], é altamente necessário para identificar células cancerosas viáveis entre uma população de células para análise posterior. Para verificar a viabilidade das células cancerosas, células DU145 foram presos nas microcavidades e cultivadas no dispositivo através da introdução de meio de cultura. Após 6 horas, as células foram coradas presas com calceína (azul) para células viáveis, anexina V (verde) para as células de apoptose ou PI (vermelho) para células mortas. Quase todas as células aprisionadas (85%) emitem fluorescência azul, indicando que as células são viáveis, mesmo após 6 horas de incubação sobre o dispositivo (figura 6).

Celular apoptótica

Anexina V (verde) manchas, PI (vermelho) manchas de células mortas e Calce�a (azul) manchas células viáveis. imagem mesclada identificar tanto celular por apoptose e morto (verde + vermelho). Imagens de células presas nos micropoços após 6 horas de incubação.

Fluorescent Hibridização In Situ (FISH)

Foi realizado FISH on-chip no EMA para localizar a presença ou ausência de seqüências específicas de DNA nos cromossomos vez que as células cancerosas muitas vezes induzem rearranjo cromossômico para a resistência às drogas. Para demonstração, B-Cell Lymphoma6 (BCL6; gene para a inibição da apoptose [23]) o rearranjo de genes foi avaliada em células PC3 cultivadas utilizando FISH on-chip. O FISH negativo mostra grande proximidade de pontos vermelhos (parte a montante do gene BCL6) e manchas verdes (parte jusante do gene BCL6). Considerando mostra FISH-positivos sonda quebra-apart dual-cores. Figura 7 mostra o resultado do ensaio de FISH para uma célula PC3 na matriz de micropoços. Translocação de gene de apoptose em células PC3 com êxito pode ser verificado por FISH on-chip, e cromossomo 3q27 da célula não causou translocação por causa manchas vermelhas e verdes aparecem no mesmo local.

As setas indicam sinal de BCL6 sondar. sinal verde mostra parte a jusante do gene BCL6 e sinal vermelho mostra a parte a montante do gene BCL6. Fundir imagem mostra o sinal amarela devido a sinais vermelhos e verdes estão no mesmo local. Isto significa cromossomo 3q27 não causa translocação.

Conclusões

Neste estudo, propusemos um novo método para única célula cancerosa análises usando o dispositivo EMA. O dispositivo permitiu-nos realizar interceptação de uma única célula eficiente e três tipos de ensaios bioquímicos; imunocoloração, a viabilidade de ensaio /apoptose e FISH no nível de uma única célula. Uma vez que as células individuais presos poderia ser realizada de forma estável dentro de micropoços, realizamos todo o processo para os ensaios, injetando sequencialmente os reagentes sem sistemas de válvulas ou tubagens complicados. O nosso dispositivo EMA simples combinados com ensaios analíticos altamente sensíveis promete de alto rendimento e análises paralelizadas de células cancerosas raras em uma população de outros tipos de células. Pode-se também aplicar esta técnica para o rastreio de um candidato a fármaco para o tratamento de tumores por monitorização da resposta de células alvo através de ensaios em chip.