Abstract

receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é amplamente expresso em câncer de cabeça e pescoço. No entanto, a terapia alvo-EGFR só tem eficácia modesta no câncer de cabeça e pescoço, através de mecanismos que não são totalmente compreendidos. Aqui, encontramos que a inibição do EGFR por erlotinib estimulou a fosforilação e ativação do STAT3 levando ao aumento da expressão de Bcl-2 /Bcl-XL em células de câncer de cabeça e pescoço, o que pode diminuir a eficácia terapêutica do erlotinib contra o câncer de cabeça e pescoço. Erlotinib-enhanced resultados STAT3 fosforilação, pelo menos em parte, da supressão do seu fosfatase fisiológico, PTPMeg2. knockdown específico de STAT3 por interferência de RNA sensibilizado significativamente as células cancerígenas de cabeça e pescoço para erlotinib tratamento. inibição farmacológica da STAT3 por niclosamide não só fosforilação STAT3 estimulada por erlotinib bloqueado, mas o crescimento cabeça e pescoço câncer também sinergicamente reprimida

in vitro

e

in vivo

. inibição combinada de EGFR e STAT3 por erlotinib e niclosamide de forma mais eficaz a apoptose induzida em tecidos tumorais sem toxicidade para tecidos normais. Com base em nossos resultados, o tratamento com erlotinib combinado com niclosamide pode oferecer uma abordagem terapêutica eficaz para melhorar o prognóstico do câncer de cabeça e pescoço

Citation:. Li R, Você S, Hu Z, Chen ZG, Sica GL, Khuri FR, et ai. (2013) Inibição de STAT3 por Niclosamide synergizes com Erlotinib contra o Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 8 (9): e74670. doi: 10.1371 /journal.pone.0074670

editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2013; Aceito: 05 de agosto de 2013; Publicação: 03 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por R01CA136534 (XD), NCI P50 CA128613 (DMS) e R33 CA161873 (ZGC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cabeça e pescoço cancros constantemente entre os seis tipos de cancro mais frequentemente diagnosticado no mundo [1]. Mais de 90% dos cânceres de cabeça e pescoço são carcinomas de células escamosas do trato aerodigestivo superior, incluindo a cavidade oral, faringe, laringe, e seios paranasais (1). carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) constitui cerca de 2,5% dos diagnósticos de câncer nos Estados Unidos, com 41,380 novos casos diagnosticados e cerca de 7.890 mortes em 2013 [2]. Apesar dos avanços nas terapias convencionais, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia, a taxa global de sobrevivência para SCCHN não foi significativamente melhorado nas últimas décadas. Receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) é amplamente expresso em SCCHN e tem sido utilizado como um alvo importante para o tratamento desta [3] doença. O erlotinib, um inibidor da tirosina-cinase EGFR (TKI), tem sido utilizada para o tratamento de SCCHN, mas a sua eficácia é modesto [5]. O mecanismo de contabilidade para a eficácia limitada de erlotinib na cabeça e terapia do cancro do pescoço não é totalmente compreendido. É possível que a inibição do EGFR por erlotinib pode induzir a activação de alguns via (s) de sobrevivência de sinalização que amortece a eficácia de erlotinib contra SCCHN.

STAT3, um membro da família de factores de transcrição STAT de, é activada em cânceres diversos, e recentemente foi validado como um alvo terapêutico atractivo na terapia do câncer, incluindo câncer de cabeça e pescoço [6-10]. Além disso, as amostras de SCCHN também têm níveis mais elevados de STAT3 do que o tecido normal [11]. STAT3 citoplasmática latente torna-se activado por meio de fosforilação no resíduo Tyr705 por Janus quinase associada (JAK) ou factor de crescimento de tirosina-quinase associada ao receptor (Src) [12]. Fosforilada STAT3 dimeriza através de uma Src homologia interacção 2-fosfo-tirosina recíproco e acumula-se no núcleo, onde activa a transcrição de uma grande variedade de genes, incluindo Bcl-2 /Bcl-XL, ciclina D1, c-myc, etc [13, 14]. Além de quinases JAK STAT3 (isto é,), fosforilação da STAT3 é também fortemente regulada por um processo de desfosforilação, que é mediado pela proteína tirosina fosfatase PTPMeg2 [15]. PTPMeg2 foi recentemente identificado como um novo fosfatase STAT3 fisiológica que desfosforila directamente STAT3 no resíduo Tyr705 [15]. administração intratumoral de STAT3 chamariz inibiu o crescimento de tumores de xenoenxertos de SCCHN

in vivo

[16], o que sugere que a STAT3 é um alvo terapêutico potencial para SCCHN. Apesar da promessa de um certo número de abordagens racionais para segmentar função STAT3, nenhum inibidor de molécula pequena STAT3 parece estar pronto para o desenvolvimento clínico medida [17].

niclosamida foi recentemente relatado como um inibidor potente contra o cancro da STAT3 células [18]. Neste relatório, nós mostramos que erlotinib melhora fosforilação STAT3 por regulação negativa da sua fosfatase PTPMeg2 levando a níveis elevados de Bcl-2 /Bcl-XL, o que reduz a sensibilidade do SCCHN à do erlotinib tratamento. Niclosamide, como um inibidor de STAT3, pode bloquear a fosforilação induzida por erlotinib da STAT3 levando à supressão sinérgica de câncer de cabeça e pescoço.

Materiais e Métodos

Materiais

Niclosamide foi comprado a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Erlotinib foi obtido a partir de LC Laboratories (Woburn, MA). A fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-STAT3 (Tyr705), fosfo-JAK2 (Tyr1007 /1008), caspase activa 3 e survivina anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA). β-actina e anticorpos Mcl-1, e a sua PTPMeg2 shRNA controlo shRNA foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). PTPMeg2 anticorpo foi obtido a partir de R D systems (R D systems, MN). Bcl2 foi obtido a partir de Calbiochem (Darmstadt, Alemanha). Bcl-XL foi comprado de Epitomics, Inc. (Burlingame, CA). QD605 cabra conjugado anti-IgG de coelho (vermelho), QD705 IgG de cabra anti-ratinho conjugado (verde) e reagente antifade ProLong® ouro com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) foram adquiridos a partir de Invitrogen Life Technologies Inc (Carlsbad , CA). Todos os outros reagentes utilizados foram obtidos a partir de fontes comerciais, a menos que indicado de outra forma.

linhas de células e cultura de células

linhas celulares de SCCHN humano Tu212 e Tu686 foram estabelecidas a partir de HNSCCs primárias e mantidas em DMEM /F12 (1 : 1) meio com 10% de soro bovino fetal, tal como descrito anteriormente [19]. Estas linhas de células foram utilizadas para as experiências descritas sem autenticação adicional.

Preparação de lisatos celulares e Western blot

As células foram lavadas com PBS frio e ressuspensas em tampão de EBC arrefecido com gelo (0,5% de Nonidet P-40, Tris 50 mM, pH 7,6, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, e 1 mm- β-mercaptoetanol) contendo mistura de inibidor de protease definida I. Após a lise das células por ultra-sons e centrifugação a 14000 xg durante 15 min a 4 ° C , o sobrenadante resultante foi recolhido como o lisado de células totais. A expressão de proteínas foi analisada por Western blot, como descrito anteriormente [20].

quantitativa de transcrição reversa PCR (RT-PCR)

Para quantitativa de RT-PCR, o ARN total foi transcrito de forma inversa e purificado com aleatório hexâmeros e SuperScript III (Invitrogen). A amplificação foi levada a cabo usando 2 × SYBR Green mistura de PCR (Bio-Rad, CA) por ABI 7500 em tempo real do sistema de PCR (Applied Biosystems) como descrito [21,22]. primers específicos: para Bcl2 humana: para a frente, 5′-GGT GGA GGA GCT CTT CAG G-3 ‘e reverter, 5′- ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3′; para o ser humano Bcl-XL: para a frente, 5’- ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC -3 ‘e reverter, 5′-TGG GAT GTC AGG TCA CTG AA-3′; e para a β-actina: para a frente, 5’- TCA GGA TCC ACG TGC TTG TCA -3 ‘; reverso, 5’- TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC TTT GA -3 ‘. Quantificações relativas de expressão de genes foram realizados de acordo com o método Ct comparativo utilizando β-actina como padrão interno. Quantificação da expressão de genes foi analisado com o programa de software 2.0.5 7500 V e quantificada pelo método 2-ΔΔCt. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes.

RNA Interferência

Lentivirus pSIH1-puro-STAT3 shRNA e pSIH1-controle puro shRNA foram obtidos a partir Addgene (Cambridge, MA). O plasmídeo de controlo shRNA-A sequência codifica um shRNA mexidos que não irá conduzir à degradação específica de qualquer mensagem celular. Controle shRNA sequência hairpin: CCT AAG GTT AAG TCG CCC TCG CTC GAG CGA GGG CGA CTT AAC CTT AGG. STAT3 shRNA sequência hairpin: GAT CCG CAT CTG CCT AGA TCG GCT ATT CAA GAG ATA GCC GAT CTA GGC AGA TGT TTT TTG. PTPMeg2 shRNA e o seu controlo shRNA foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Para a produção pseudovírus, STAT3 ou shRNA PTPMeg2 shRNA foram co-transfectados em células 293FT com a mistura de plasmídeo de empacotamento lentivector (Sistema Biosciences, CA) utilizando o kit de transfecção NanoJuice (EMD Chemical, Inc.) como descrito [23]. Depois de 48h, os meios contendo vírus foram colhidas por centrifugação a 20.000 x g. As células foram infectadas com a mídia contendo vírus na presença de polibreno (8 ug /ml) para seguir 24h que clones positivos estáveis ​​foram selecionados utilizando 1 ug /ml de puromicina.

Sulforodamina B (SRB) ensaio

os efeitos inibidores de erlotinib e niclosamida sobre o crescimento celular foi avaliado utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB), tal como descrito [24]. As células foram cultivadas em poços em triplicado utilizando placas de 96 poços. Após crescimento durante a noite, as células foram tratadas com erlotinib, niclosamida ou a combinação durante 48 h. A fração de células sobreviventes foi determinada como descrito [24].

Cabeça e pescoço xenotransplantes e tratamentos

O Animal Care e Use Comitê Institucional da Universidade de Emory aprovou o protocolo de experimentos com animais com câncer. ratinhos nus com seis semanas de idade nu /nu foram adquiridos a Harlan e alojados sob condições isentas de agentes patogénicos em gaiolas microisolator. Os xenoenxertos foram criados por injecção de 5 × 10

6 Tu212 de células numa solução de sal equilibrada no tecido subcutâneo sobre a região do flanco de ratinhos nus. Os tumores foram deixados crescer para um volume médio de 250 mm

3 antes do início do tratamento, como descrito [25]. Portador de tumor os murganhos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento (n = 8 por grupo) como se segue: (1) controlo de veículo (DMSO a 0,5%, 100 uL /​​d i.p.); (2) erlotinib (40 mg /kg /d i.p.); (3) niclosamida (20 mg /kg /d i.p.); (4) erlotinib (40 mg /kg /d) + niclosamida (20 mg /kg /d). O volume do tumor foi avaliado por medições de calibre uma vez a cada dois dias e calculado utilizando a fórmula: V = (LxW

2) /2 (L: comprimento; W: largura) como descrito [26]. Depois de 14 dias consecutivos de tratamento, os ratinhos foram sacrificados por inalação de CO

2. Os tumores colhidos foram usadas para análise posterior.

A imuno-histoquímica (IHC) análise

IHC coloração do tecido tumoral, utilizando caspase activa coelho anti-humano 3 anticorpo foi realizada como descrito [25]. Resumidamente, os tumores colhidos foram embebidos em parafina e cortada em secções de 4