Abstract

A heparina de ligação factor de crescimento epidérmico fator de crescimento semelhante (HB-EGF) é um membro da família do factor de crescimento epidérmico e tem uma variedade de funções fisiológicas e patológicas. A modulação da actividade de HB-EGF pode ter um potencial terapêutico na área da oncologia. Nós exploramos as possibilidades terapêuticas caracterizar-se o

in vitro

atividade biológica do anticorpo monoclonal anti-HB-EGF Y-142. receptor de EGF (EGFR) de ligandos e espécies especificidades de Y-142 foram testados. Neutralizantes actividades de Y-142 contra HB-EGF, foram avaliados em EGFR e de sinalização erb B4. As actividades biológicas de Y-142 foram avaliadas na proliferação de células cancerosas e ensaios de angiogénese e comparados com o anti-EGFR cetuximab anticorpo, o CRM197 inibidor HB-EGF, e o anticorpo anti-factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) bevacizumab anticorpo. O epitopo de ligação foi determinada com o varrimento de alanina. Y-142 reconhecido HB-EGF, bem como a anfirregulina ligando de EGFR, e ligou-se especificamente ao ser humano HB-EGF, mas não de HB-EGF roedor. Além disso, Y-142 neutralizada a fosforilação induzida por HB-EGF do EGFR e erbB4, e bloqueou a sua sinalização a jusante de ERK1 /2 e AKT. Nós também descobrimos que Y-142 inibiu HB-EGF-induzida a proliferação de células do cancro, de proliferação de células endoteliais, a formação de tubos, a produção de VEGF e de forma mais eficaz do que o cetuximab e CRM197 e de que Y-142 foi superior ao bevacizumab na inibição de HB-EGF formação do tubo induzida. Seis aminoácidos no domínio tipo EGF foi identificada como o epitopo de ligação Y-142. Entre os seis aminoácidos, a combinação de F115 e Y123 determinada a anfirregulina a reactividade cruzada e que F115 representaram a selectividade das espécies. Além disso, sugere-se que a actividade neutralizante potente de Y-142 foi derivado a partir do seu reconhecimento de R142 e Y123 e a sua elevada afinidade para HB-EGF. Y-142 possui uma actividade neutralizadora de HB-EGF potente que modula várias actividades biológicas de HB-EGF, incluindo a proliferação de células de cancro e actividades angiogénicas. Y-142 pode ter um potencial a ser desenvolvido em um agente terapêutico para o tratamento de cancros HB-EGF-dependentes

Citation:. Sato S, Drake AW, Tsuji I, J Fan (2012) A Anti Potent -HB-EGF anticorpo monoclonal inibe a proliferação de células cancerosas e múltiplas Atividades angiogênico do HB-EGF. PLoS ONE 7 (12): e51964. doi: 10.1371 /journal.pone.0051964

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Agosto, 2012; Aceito: 09 de novembro de 2012; Publicação: 14 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Sato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nenhuma corrente fontes de financiamento externas deste estudo

Conflito de interesses:. os autores têm as seguintes participações. Este estudo foi financiado pela Takeda San Francisco, Inc. e Takeda Pharmaceutical Company Limited. Todos os autores eram funcionários da Takeda San Francisco, Inc. ou Takeda Pharmaceutical Company Limited e eram pagos como tal. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

A heparina de ligação do factor de crescimento epidérmico (EGF ) factor de crescimento -like (HB-EGF) é um membro da família EGF dos factores de crescimento que se liga ao receptor de EGF (EGFR) e ErbB4 [1], [2]. HB-EGF é sintetizada como uma forma ligada à membrana, proHB-EGF, que é conhecida por ser um factor de crescimento juxtacrine [3], [4]. proHB-EGF sofre ectodom�io derramamento por proteases [5], bem como a queda é acelerado quando as células proHB-EGF-expressando estão expostas a certas condições de estresse [6], [7]. A forma solúvel resultante de HB-EGF (EGF-SHB) tem uma actividade mitogénica potente através da activação do EGFR [1]. Após a clivagem, o fragmento de HB-EGF C-terminal se transloca para o núcleo, e induz a expressão do gene de cyclinA e cyclinD2 por suprimir a função de PLZF e BCL6, respectivamente, [8], [9].

Estudos recentes têm revelada uma variedade de funções fisiológicas de HB-EGF, incluindo o desenvolvimento de tecidos [10] – [12], a cicatrização de feridas da pele [13], e a gravidez [14], [15]. HB-EGF, também foi encontrada para ser associada com processos patológicos, incluindo a hipertrofia cardíaca [16], hipertensão pulmonar [17], aterosclerose [18], [19], e a transformação oncogénica [20]. Mais recentemente, uma evidência crescente demonstrou que HB-EGF é sobre-expressa em vários tipos de cancros [21] – [25] e a sobre-expressão foi mostrado para correlacionar com prognóstico pobre [24], [26], [27 ]. Devido a estas conclusões, os agentes anti-HB-EGF foram ativamente buscados para aplicações terapêuticas. Um inibidor de HB-EGF mutante da toxina da difteria, CRM 197, está na Fase I de desenvolvimento clínico para o tratamento de cancros do ovário avançado [28]. Anti-HB-EGF anticorpos U3-1565 e KHK2866 estão actualmente em fase I de ensaios clínicos para cânceres sólidos [29]. se espera que um anticorpo monoclonal terapêutico anti-HB-EGF ter uma meia-vida mais longa em comparação com CRM197 [30], [31], mas a geração de anticorpos anti-HB-EGF potentes tem sido um desafio e alguns anti-HB-EGF anticorpos monoclonais com uma actividade funcional foram relatados [29], [32], [33]. Recentemente, relataram a geração de anticorpos monoclonais anti-HB-EGF neutralizantes [34]. Neste estudo, relatamos a caracterização de um dos anticorpos monoclonais anti-HB-EGF, Y-142, por meio da análise das suas actividades funcionais e de epítopo de ligação. A potente actividade biológica dos Y-142 foi comparado com os do cetuximab anticorpo anti-EGFR, o CRM197 do inibidor de HB-EGF, e de bevacizumab anticorpo anti-VEGF.

Materiais e Métodos

Materiais

humano, ratinho, rato e SHB-EGF, e EGFR-hFc foram anteriormente preparados a partir do sobrenadante da cultura de células 293F (Invitrogen) transfectadas com cada plasmídeo de expressão de [34]. ligandos de EGFR, anti-anfirregulina anticorpo (anti-ARG) monoclonal anti-EGFR, anti-erbB4, anti-HB-EGF, e anticorpos policlonais anti-Arg, marcado com FITC anti-CD31, anti-VEGF, anti-VEGF biotinilado , (marcado com HRP) anticorpos anti-fosfotirosina marcado com peroxidase de rábano silvestre foram adquiridos a partir de R D Systems. Anti-fosforilado ERK1 /2 e anticorpos anti-AKT fosforilados foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. anticorpo anti-IgG de coelho marcado com Alexa488-se obtido a partir de Invitrogen. IgG de controlo do rato, estreptavidina marcada com HRP, marcado com HRP anti-ratinho, anticorpos de IgG anti-cabra, de cabra marcado com Cy5 anticorpo específico anti-IgG de ratinho Fcy, e anticorpo Fc de IgG anti-humano foram adquiridos à Jackson ImmunoResearch Laboratories. Cetuximab e CRM197 foram de ImClone e Sigma Aldrich, respectivamente. Sulfo-tagged anticorpo anti-rato e estreptavidina marcada com sulfo foram adquiridos da Meso Scale Discovery. anticorpo anti-fosfotirosina marcado com sulfo foi preparado por marcação com anticorpos anti-fosfotirosina (Millipore) com reagente marcador sulfo MSD (Meso Scale Discovery).

anticorpo monoclonal

anti-HB-EGF Anticorpo Geração

Y-142 foi gerado anteriormente [34]. Em breve, Y-142 foi preparado através da imunização de ratinhos BALB /c (Japan Clea) com injecções subcutâneas de limpet hemocianina de conjugado SHB-EGF e injecções de abdominais 293F células transientemente transf ectadas com um plasmídeo de expressão proHB-EGF. Y-142 foi purificado a partir do seu sobrenadante de cultura de hibridoma com rProteinA Sepharose (GE Healthcare). O estudo animal foi realizada em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Takeda Pharmaceutical Company Limited (número de autorização: 2802).

Cultura de Células

linha de células de câncer de ovário SK-OV-3, peito a linha celular de cancro T47D, e linha celulares de cancro colorrectal SW480 foram adquiridos da American Type Culture Collection e mantida com 5A, RPMI1640 de McCoy, e Leibovit’z meio L-15 suplementado com soro a 10%, respectivamente. fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram adquiridos a partir de Lonza e mantida com FGM-2 e EGM-2 kits (Lonza), respectivamente.

Especificidade de ligação de teste

Humano, rato, ou rato SHB-EGF foi imobilizado numa placa de 384 poços MSD (Meso Scale Discovery). A ligação não específica foi bloqueada com PBS contendo BSA a 1%. Y-142 foi então adicionado a cada poço e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Foi adicionado anticorpo anti-IgG de rato marcado com sulfo e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. MSD Leia Tampão de T (Meso Scale Discovery) foi adicionado e a quimioluminescência foi medida com um sector de Imager 6000 (Meso Scale Discovery). EGFR ligando de especificidade de Y-142 foi determinada por incubação de diversas concentrações de Y-142 durante 1 hora numa placa de 384 poços imobilizada ligando-EGFR seguido por incubação de anticorpo marcado com HRP de IgG anti-ratinho durante 1 hora a temperatura ambiente. TMB Peroxidase EIA Substrate (BioRad) foi então adicionado à placa de 384 poços e a reacção foi parada após 15 minutos pela adição de 1 N H

2SO

4. de ligação ao ligando de EGFR anticorpo foi então detectado através da medição da absorvância a 450 nm, utilizando um instrumento de SPECTRA MAX (Molecular Devices).

Medição da Biofísica K

D

KinExA experiências foram realizadas usando um instrumento KinExA 3200 (Sapidyne) a 22 ° C. SHB-EGF foi reconstituída em PBS. SHB-EGF e Y-142 amostras foram preparadas em tampão desgaseif içada a vácuo HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM e 0,005% de Tween-20) a partir de GE Healthcare filtrada com BSA a 0,01% e 0,02% de azida de sódio. Para o anticorpo de detecção, de IgG anti-ratinho de cabra marcado com Cy5, foi utilizado Fcy específica. Para cada experiência KinExA, 20 ug de SHB-EGF foi diluída em 1 ml de carbonato de sódio 50 mM (pH 9,2) o qual foi adicionado directamente a 50 mg de esferas de azlactona (UltraLink Biosupport, Thermo Scientific), e balançado durante a noite a 4 ° C . Depois de balanço, as esferas foram lavadas uma vez com Tris-HCl 1 M (pH 8,5) contendo 1% de BSA e agitados durante 1 hora à temperatura ambiente no mesmo tampão. pérolas acopladas foram adicionados ao reservatório do grânulo no instrumento KinExA e diluída para 30 ml com HBS-N (HEPES 10 mM e NaCl 150 mM, GE Healthcare) contendo 0,02% de azida de sódio, que foi também o tampão de corrida para o instrumento KinExA. Todas as esferas juntamente com antigénio foram utilizadas imediatamente após a preparação.

Para K

D-12, controlados experiências concentrações de SHB-EGF a uma gama de 4,04 FM-207 pM foram equilibradas à temperatura ambiente durante 72 horas com 13:03 Y-142 sítios de ligação. O volume fluiu através do pacote de grânulo para cada amostra no K

titulação controlado-D foi de 23 mL a uma taxa de fluxo de 0,25 mL /min. Para as experiências de controlo com o anticorpo, 12 concentrações de SHB-EGF a uma gama de 4,67 FM-239 pM foram equilibradas à temperatura ambiente durante 24 horas, com locais de ligação de 35,6 pM Y-142. O volume fluiu através do pacote de grânulo para cada amostra na titulação controlado por anticorpo foi de 3 mL a uma taxa de fluxo de 0,25 mL /min. K

D-controlado de dados e dados controlados por anticorpos foram encaixam simultaneamente com um modelo de cooperatividade positiva dupla curva usando software KinExA (Versão 3.13, Sapidyne).

SHB-EGF Encadernação inibição de EGFR

a actividade inibidora de Y-142 contra a ligação de SHB-EGF ao EGFR-hFc foi detectada como descrito anteriormente [34]. Em resumo, o anticorpo de IgG anti-Fc humana foi imobilizado numa placa de 96 poços durante a noite a 4 ° C. Depois as placas foram bloqueadas com PBS contendo 20% Immunoblock (Dainippon Sumitomo Pharma), adicionou-se EGFR-hFc e feita reagir durante 1 hora à temperatura ambiente. Y-142 foi então adicionado e incubado a uma concentração de 6,7 nM, na presença de 0,63 nM biotinilado SHB-EGF e 25 ng /ml de heparina de sódio durante 1 hora a 37 ° C, seguido pela adição de estreptavidina marcada com HRP e incubou-se durante 1 hora a 37 ° C. SureBlue micropoços TMB Substrato foi então adicionada e a reacção foi parada após 15 minutos pela adição de 1 N H

2SO

4. A absorvância a 450 nm foi medida utilizando SPECTRA MAX. A ligação de SHB-EGF ao EGFR-hFc na presença de Y-142 foi calculada como a percentagem da ligação que foi medido de ligação SHB-EGF ao EGFR-hFc na ausência de Y-142 no máximo. O sinal de controlo de ligação mínima foi detectado na ausência de EGF e SHB-Y-142.

EGFR Ensaio de Fosforilação

fosforilação do EGFR foi detectada como descrito anteriormente [34]. Resumidamente, as células SK-OV-3 foram plaqueadas a 1 x 10

4 células /cavidade em meio de McCoy 5A contendo 1% de soro para uma placa de 96 poços. Depois de uma cultura de 1 dia, as células foram incubadas com 10 nM de SHB-EGF ou 10 nM ARG conjunto com Y-142 ou anticorpo monoclonal anti-ARG durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram lisadas em tampão de lise celular (Cell Signaling Technology) com um cocktail inibidor de protease (Roche Applied Science) e um cocktail de inibidores de fosfatase (Sigma Aldrich). Os lisados ​​celulares foram então incubadas numa placa revestida com anticorpo policlonal anti-EGFR durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por uma incubação com o anticorpo anti-fosfotirosina marcado com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de uma incubação com peroxidase TMB Substrato AIA durante 15 minutos, a reacção foi parada pela adição de 1 N H

2SO

4. fosforilação do EGFR foi detectada medindo a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de placas Envision (Perkin Elmer). fosforilação do EGFR na presença de Y-142 ou um anticorpo anti-ARG foi calculada como a percentagem da fosforilação máxima EGFR medida na ausência de Y-142. O controle mínimo de fosforilação foi sinal detectado na ausência de SHB-EGF, Arg, Y-142, e anti-ARG anticorpo.

ErbB4 Ensaio de Fosforilação

células T47D foram semeadas a 2,5 x 10

4 células /cavidade em uma placa de 96 poços com meio RPMI1640 contendo 10% de soro e cultivadas durante um dia. Depois de serem plaqueadas, as células foram durante 1 dia privadas de soro e depois tratou-se com 10 nM SHB-EGF em conjunto com várias concentrações de Y-142 durante 30 minutos a 37 ° C. Os lisados ​​celulares foram preparados tal como no ensaio de fosforilação do EGFR descrito acima e, em seguida, incubadas num revestidos por anticorpo MSD placa de 384 poços anticorpo policlonal anti-erbB4 durante 1 hora à temperatura ambiente. Para detectar a fosforilação do receptor, anticorpo anti-fosfotirosina marcado com sulfo foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. MSD ler o buffer T foi então adicionado como um substrato e quimioluminescência foi medida com um fosforilação ErbB4 Imager Sector 6000. na presença de Y-142 foi calculada como a percentagem da fosforilação máxima ErbB4 medida na ausência de Y-142. O controle mínimo de fosforilação foi sinal detectado na ausência de EGF e SHB-Y-142.

ERK1 /2 e AKT Ensaios de Fosforilação

Para a detecção da fosforilação de ERK1 /2 ou AKT , SK-OV-3 células foram plaqueadas como descrito acima. As células plaqueadas foram então fixadas com 3,8% de paraformaldeído durante uma hora à temperatura ambiente, lavou-se com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (tampão de lavagem) três vezes, e bloqueadas com tampão de lavagem contendo BSA a 1%, soro de cabra a 2%, 0,3% gelatina de peixe fria pele, 0,1% Triton X-100, e 0,05% de azida de sódio. As células foram então incubadas com anti-fosforilada /2 anticorpo ERK1 ou anticorpo AKT anti-fosforilado durante a noite a 4 ° C, lavadas três vezes com tampão de lavagem, e incubou-se com anticorpo anti-IgG de coelho Alexa488-marcado durante 2 horas à temperatura ambiente. A fim de medir a proteína total em cada poço, as células foram incubadas com o éster de succinimidilo Alexa647 (Invitrogen) em tampão de lavagem. ERK1 /2 e AKT, bem como de proteína total foram detectados com um instrumento Micro ImageXpress (Molecular Devices). Os níveis de fosforilação de ERK1 /2 e AKT foram normalizados com a quantidade total de proteína em cada poço. níveis de fosforilação foram calculados como a percentagem dos níveis máximos de fosforilação detectados na ausência de Y-142. O sinal de controlo mínimo foi detectado na ausência de SHB-EGF e Y-142.

Proliferação Celular Ensaio

células SK-OV-3 foram adicionados a 3 × 10

3 células /poço em meio de McCoy 5A contendo 1% de soro e HUVEC foram adicionados com a mesma densidade em EBM-2 (Lonza) meios contendo soro despojado-carvão a 5% (Hyclone) a placas de 96 poços e cultivadas durante um dia. As células foram ainda cultivadas na presença de 10 nM de SHB com EGF-Y-142, cetuximab, ou CRM197 durante 3 dias. Várias concentrações de cetuximab e CRM197 foram utilizados em conformidade com estudos anteriores [35], [36]. A proliferação celular foi detectado com CellTiter-Glo (Promega) usando Envision. A proliferação celular de SK-OV 3 e células HUVEC foi calculada como a percentagem do nível de proliferação medida na ausência de SHB-EGF, Y-142, cetuximab, e CRM197.

Formação tubo de ensaio

NHDF foram semeadas a 1 x 10

4 células /poço com um kit de FGM-2 em uma placa de 96 poços pretas de fundo claro, e cultivadas durante 3 dias. Mil HUVEC foram semeadas sobre a monocamada de NHDF com meio EBM-2 contendo soro despojado carvão a 2% na presença de 50 nM de SHB-EGF com várias concentrações de Y-142, cetuximab, CRM197, ou bevacizumab. A ampla gama de concentrações de cetuximab, CRM197, ou bevacizumab foi utilizado em conformidade com estudos anteriores [35] – [37]. Após um período de incubação de 4 dias, as HUVEC foram coradas com anticorpo anti-CD31 marcado com FITC. As células CD31-positivas foram detectadas utilizando um instrumento Acumen ex3 (TTP Labtech). formação do tubo, na presença de Y-142, cetuximab, CRM197, ou bevacizumab foi calculada como a percentagem da formação do tubo detectado na presença de SHB-EGF, Y-142, cetuximab, CRM197, e bevacizumab.

(a) a actividade de ligação de Y-142 a EGFR ligandos por ELISA. As várias concentrações de Y-142 foram incubadas em uma placa imobilizada ligando-EGFR. A ligação foi depois detectado com um anticorpo IgG anti-ratinho marcado com HRP. Os pontos de dados representam a média ± desvio padrão (SD) de valores adquiridos em duplicado. (B) A actividade de ligação de Y-142 a humana, de ratinho, de rato e de HB-EGF por ELISA. A actividade de ligação a diferentes espécies de HB-EGF foi medida por ELISA utilizando uma tecnologia baseada em electroluminescente. As várias concentrações de Y-142 foram incubados numa placa de SHB-EGF imobilizado. A ligação foi detectada com anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com sulfo. Os pontos de dados representam a média ± desvio padrão de valores adquiridos em duplicado. alinhamento ácido (C) amino do domínio do tipo EGF de ligandos de EGFR. Um ponto indica um aminoácido diferente de HB-EGF. Um traço representa uma lacuna. Pontas de setas marcadas com um número indicam os epitopos de ligação Y-142 identificados na Fig. 6. alinhamento ácido (D) Amino do domínio EGF de humano, rato, e rato HB-EGF. Um ponto indica um aminoácido idêntico ao humano HB-EGF. Pontas de setas marcadas com um número indicam os epitopos de ligação Y-142 identificados na Fig. 6.

anticorpo monoclonal VEGF Medição

Anti-VEGF foi imobilizado em uma alta placa de ligação MSD durante a noite a 4 ° C. Cada poço foi em seguida, bloqueadas com PBS contendo 1% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente. O sobrenadante da cultura a partir do ensaio de formação do tubo acima descrito foi então adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. anticorpo anti-VEGF biotinilado foi em seguida feita reagir durante 1 hora à temperatura ambiente seguida por uma incubação com estreptavidina marcada com sulfo durante 1 hora à temperatura ambiente. Ler t O tampão foi então adicionado como um substrato e quimioluminescência foi medida com um instrumento 6000 Sector Imager. A quantidade de VEGF no sobrenadante da cultura foi calculada como uma percentagem da quantidade de VEGF na presença de SHB-EGF.

Western Blot

SHB-EGF e ARG foram fervidas em tampão de amostra de Laemmli ( BioRad) com ou sem o ditiotreitol 10 mM durante 5 minutos a 95 ° C. A não reduzido ou reduzido SHB-EGF ou ARG foram então sujeitas a electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio. SHB-EGF foi detectada quer com 3 ug /mL de Y-142 ou 3 ug /mL de anticorpo anti-HB-EGF policlonal como anticorpo primário, seguido pela incubação com HRP-anticorpo marcado anti-IgG de rato ou anti marcado com HRP -goat anticorpo IgG, respectivamente, como o anticorpo secundário. ARG foi detectada quer com 3 ug /mL de Y-142 ou 3 ug /mL de anticorpo anti-ARG policlonal como anticorpo primário, seguido pela incubação com marcado com HRP anti-rato IgG de anticorpo ou um anticorpo anti-IgG de cabra marcado com HRP , respectivamente, como o anticorpo secundário.

mapeamento de Epitopos

estudo de mapeamento de epitopos foi efectuado como descrito anteriormente [33]. Em resumo, os plasmídeos de mutantes de alanina proHB-EGF de expressão foram preparados com um kit de mutagénese Além disso KOD (TOYOBO). Cada plasmídeo de expressão foi transfectado em células SW480 com Lipofectamina LTX com o Plus reagente (Invitrogen) em placas de 96 poços. Dois dias após a transfecção, as células foram lavadas uma vez com PBS (+) (PBS com CaCl 0,5 mM

2 e MgCl 0,5 mM

2) e, em seguida, incubadas em BSA a 1% contendo PBS durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram então lavadas três vezes com PBS (+) e incubadas com 200 nM de Y-142 ou anti-HB-EGF anticorpo policlonal durante 30 minutos a 4 ° C. Após os passos de lavagem, marcado com HRP de IgG anti-rato ou marcado com HRP de cabra anti-IgG-anticorpo foi adicionado para detectar o anticorpo policlonal Y-142 ou anti-HB-EGF, respectivamente. Depois de lavar duas vezes com PBS (+), peroxidase TMB Substrato EIA foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 15 minutos. A reacção foi parada pela adição de 1 N H

2SO

4. A ligação do anticorpo foi detectada através da medição da absorvância a 450 nm utilizando um instrumento Envision. A fim de ter em consideração as diferenças entre os níveis de expressão proHB-EGF, a ligação de Y-142 para cada mutante proHB-EGF foi normalizada com a da HB-EGF anti-anticorpo policlonal de cada mutante. A percentagem de ligação de Y-142 foi então calculado usando a seguinte fórmula: ligação Y-142 (%) = (A /B) /(C /D) x 100, onde A representa a absorvância a 450 nm de Y-142 em mutante proHB-EGF, B representa a absorvância (450 nm) de anticorpo policlonal anti-HB-EGF no mutante proHB-EGF, C representa a absorvância (450 nm) de Y-142 no tipo selvagem proHB-EGF, e D representa a absorvância (450 nm) de anticorpo policlonal anti-HB-EGF no tipo selvagem proHB-EGF.

Resultados

especificidade de ligação de Y-142

neutralizantes anti- anticorpos HB-EGF foram previamente gerado por uma abordagem de hibridoma [34]. No estudo, caracterizamos um dos anticorpos monoclonais anti-HB-EGF, Y-142. Nós primeiro testou o perfil de ligação de Y-142 a EGF ligantes utilizando ELISA (Fig. 1A). Y-142 mostrou comparável à ligação de HB-EGF e a anfirregulina (ARG), mas não para os outros quatro ligandos de EGFR. Em seguida, examinaram especificidade das espécies de Y-142, testando a sua ligação ao ser humano, camundongo e rato HB-EGF. Como mostrado na Fig. 1B, Y-142 obrigado a humana SHB-EGF mas não para ratos e ratinhos HB-EGF.

Biofísica Medição da K

D para Y-142 a HB-EGF

A K

D valor de Y-142 a humano HB-EGF foi medida usando o método de ensaio de exclusão de cinética (KinExA). K

dados de titulação controladas-D foram obtidos utilizando um intervalo de concentrações de EGF SHB-equilibrada com uma concentração constante Y-142 local de ligação (2 × a concentração molecular) de 13:03. Para as experiências de controlo com anticorpo, várias concentrações de SHB-EGF foram equilibradas com um Y-142 concentração local de ligação constante de 35,6 pM. Numa análise de dupla curva, o K

curva controlado-D contém mais do K

D informação, enquanto a curva controlado com anticorpo retorna um valor para a concentração local de ligação do anticorpo monoclonal. Este último parâmetro pode ser comparada com a concentração local de ligação nominal de o anticorpo monoclonal que se pode determinar se a estimativa K

D deve ser ajustado para a actividade do antigénio em alguns casos [38]. O K

D controlado por dados de titulação e dados de titulação controlada por anticorpos foram inicialmente ajuste em uma análise de dupla curva com um modelo de ligação 1:01 equilíbrio padrão. Observou-se, no entanto, que as curvas de titulação sob recolhidos tanto K

D- e condições controladas de anticorpos diminuíram com um declive mais acentuado do que o descrito pelo modelo padrão 01:01. Este declive mais acentuado só pode ser explicada pela utilização de um modelo de cooperatividade positiva. No modelo de cooperatividade positiva, a ligação de HB-EGF para um local de ligação do anticorpo monoclonal faz com que a afinidade do segundo local de ligação do anticorpo para aumentar a [39]. Assim, um modelo de equilíbrio positivo cooperatividade foi usada para ajustar os dados de titulação de dupla curva que proporcionou um melhor ajuste para o conjunto de dados da curva dupla, obtendo-se um eficaz K

D = 13:50 (Fig. 2). Além disso, o coeficiente de Hill resultante (n = 1,68) foi maior do que 1, que também indicou cooperatividade positiva (n = 1 significa independente de ligação) [39].

dupla curva de titulação de KinExA equilíbrio SHB-EGF a Y-142. K

controlado-D dados (parte inferior curva ajustada) foram adquiridos por equilibrar SHB-EGF em uma faixa de concentração de 4,04 FM-207 PM com sítios de ligação 13:03 Y-142. dados controlado por anticorpos (curva superior justo) foram adquiridos por equilibrar SHB-EGF em uma faixa de concentração de 4,67 FM-239 PM com sítios de ligação de 35,6 pM Y-142. Todos os pontos de dados foram adquiridos em duplicado. Ambas as curvas foram simultaneamente apto para um modelo de cooperatividade equilíbrio positivo padrão, produzindo um eficaz K

D = 13:50 (0,31), onde o número entre parênteses é o intervalo de confiança de 95% do ajuste, e um coeficiente de Hill n = 1.68.

neutralizar a actividade de Y-142 contra a SHB-EGF e ARG Sinalização

Como a sobre-expressão de HB-EGF tem sido relatada em tecidos de câncer [21] – [25] , a neutralização da funcionalidade SHB-EGF é esperado como uma potencial terapêutica promissora. actividade neutralizante de Y-142 contra SHB-EGF foi avaliada por conseguinte, em ambos os ensaios bioquímicos e à base de células. O EGFR é um dos receptores de HB-EGF, e a ligação de SHB-EGF ao EGFR leva à fosforilação do EGFR e activação da sua sinalização a jusante. Verificou-se que a ligação de SHB-EGF ao EGFR-hFc foi completamente bloqueado com Y-142 (Fig. 3A). A actividade de bloqueio de SHB-EGF de Y-142 foi traduzido com a completa inibição da fosforilação do EGFR induzida pelo EGF-SHB (Fig. 3B). Além disso a EGFR, SHB-EGF se liga e activa ErbB4 via de sinalização [2]; de facto, mostrou que Y-142 poderia neutralizar a fosforilação induzida por EGF de SHB-erbB4 expresso endogenamente em células T47D (Fig. 3C). Importante, a actividade de neutralização de Y-142 EGFR afectada jusante eventos de sinalização. Como mostrado nas Figs. 3D e 3E, Y-142 neutralizada a fosforilação induzida por EGF de SHB-ERK1 /2 e AKT, respectivamente. Tomados em conjunto, os nossos resultados mostraram que SHB-EGF se liga e activa o EGFR e erbB4, e de que Y-142 pode neutralizar a sinalização do EGFR e ErbB4 induzida SHB-EGF

(A) A actividade inibidora de Y-142. para SHB-a ligação de EGF ao EGFR. De EGFR-hFc foi incubado em um de Fc de IgG placa revestida com anticorpo anti-humano. Y-142 foi, em seguida, incubadas a uma concentração de 6,7 nM, na presença de 0,63 nM biotinilado SHB-EGF durante 1 hora a 37 ° C. SHB-EGF ligado ao EGFR-hFc foi detectada por estreptavidina marcada com HRP. a ligação a EGFR-hFc na presença de Y-142 SHB-EGF foi calculada como uma percentagem do “controlo” SHB-ligação de EGF ao EGFR que ocorreu sem Y-142. Os pontos de dados representam a média + SD de valores adquiridos em triplicado. (B) actividade neutralizadora de Y-142 contra a fosforilação do EGFR. As células SK-OV-3 foram tratadas com 10 nM de SHB-EGF e 67 nM Y-142. Os lisados ​​celulares foram incubados em uma placa revestida com anticorpo anti-EGFR, seguido por uma incubação com o anticorpo anti-phosphorytosine marcado com HRP. fosforilação do EGFR na presença de Y-142 foi calculada como uma percentagem do “controlo” fosforilação do EGFR que ocorreu sem Y-142. Os pontos de dados representam a média + SD de valores adquiridos em triplicado. (C) a actividade neutralizante de Y-142 contra fosforilação ErbB4. Os lisados ​​celulares de células T47D, como preparado na Fig. 3A foram incubadas em uma placa revestida com anticorpo anti-erbB4. A fosforilação de ErbB4 foi detectada por um anticorpo anti-fosfotirosina marcado com sulfo. ErbB4 fosforilação na presença de Y-142 foi calculada como uma percentagem do “controlo” fosforilação ErbB4 que ocorreu sem Y-142. Os pontos de dados representam a média + SD de valores adquiridos em duplicado. (D) e (E) neutralização da actividade Y-142 contra (D) ERK1 2 fosforilação /e (E) a fosforilação de AKT. Em (D) e (E) SK-OV-3 de células tratadas com 10 nM de SHB-EGF e 200 nM Y-142 foram coradas com um 2 o anticorpo anti-fosforilado ERK1 /ou um anticorpo AKT anti-fosforilado, respectivamente, seguido de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com Alexa488-. Fosforilada ERK1 /2 e AKT fosforilada foram ambos detectados com um instrumento ImageXpress Micro e calculada como uma percentagem dos níveis de fosforilação de “controle” que ocorreu sem Y-142. Os pontos de dados representam a média + SD de valores adquiridos em duplicado. (F) a actividade neutralizante de Y-142 a ARG. células SK-OV-3 foram tratadas com 10 nM ARG além de várias concentrações de Y-142 (2 nm, 6,7 nm, de 20 Nm e 67 Nm). O anticorpo monoclonal anti-ARG (67 nM) foi utilizado como um controlo positivo. Os lisados ​​celulares foram incubados em uma placa revestida com anticorpo anti-EGFR seguido por uma incubação com um anticorpo anti-phosphorytosine marcado com HRP. fosforilação de EGFR foi calculado como uma porcentagem do “controle” fosforilação de EGFR, que ocorreu sem Y-142. Os pontos de dados representam a média + SD de valores adquiridos em triplicado.

Num teste de especificidade de ligação, Y-142 ARG reconhecida, bem como SHB-EGF, ambos os quais são ligandos de EGFR (Fig. 1A) . Em seguida, testou-se Y 142 podiam neutralizar a actividade biológica de Arg. Colocámos a hipótese de que Y-142 seria capaz de neutralizar a funcionalidade de Arg por causa da sua actividade neutralizadora contra SHB-EGF e reactividade cruzada para ARG. No entanto, fomos capazes de demonstrar que a fosforilação do EGFR induzida por ARG foi apenas parcialmente neutralizado por Y-142 (Fig. 3F), ao passo que Y-142 bloqueou completamente a fosforilação do EGFR induzida pelo EGF-SHB (Fig. 3B). Estes resultados sugeriram que Y-142 poderia neutralizar tanto SHB-EGF e Arg actividades funcionais, ainda que a actividade ARG em EGFR só é parcialmente bloqueado por Y-142

Comparação de SHB-EGF neutralizar a actividade de Y-142 com. aqueles do cetuximab, CRM197, e bevacizumab

a actividade neutralizante de Y-142 contra SHB-EGF foi comparado com dois inibidores conhecidos da via EGFR cetuximab e: CRM197. Cetuximab, um anticorpo monoclonal anti-EGFR utilizado como um agente terapêutico do cancro, suprime o crescimento de células de cancro dependentes de EGFR por inibição da activação do EGFR. CRM 197, um mutante da toxina da difteria, se liga a proHB-EGF e a internalização de CRM197 subsequente faz com que a inibição da síntese de proteínas. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.