Abstract

O uso de anticorpos anti-epidérmico do receptor do fator de crescimento (EGFR) representa uma espinha dorsal da opções terapêuticas para o tratamento de câncer colorretal metastático (mCRC). No entanto, esta terapia é pouco eficaz ou ineficaz em pacientes não selecionados. Mutações em genes KRAS, BRAF e PIK3CA surgiram recentemente como os melhores preditores de baixa resposta /ausente a terapia direcionada-EGFR. Devido à necessidade de opções de tratamento eficaz para pacientes com CCRm com estas mutações, neste relatório curto foi examinada a actividade anti-tumoral do mesilato de gabexato inibidor de protease, sozinho e em combinação com o cetuximab anticorpo monoclonal anti-EGFR, em um painel de CRC humano linhas de células que abrigam um padrão de expressão diferente de genes KRAS, BRAF e PIK3CA mutantes de tipo selvagem /. Os resultados obtidos mostraram que o mesilato de gabexato, inibiram significativamente o crescimento, potencial invasivo e a angiogénese induzida por tumor em todas as células de CRC empregues neste estudo (incluindo aqueles que albergam dupla KRAS /PIK3CA ou BRAF mutação /PIK3CA), enquanto o cetuximab afectado estes parâmetros só em células CRC com KRAS, BRAF e PIK3CA do tipo selvagem. Nomeadamente, a eficácia antitumoral de mesilato de gabexato e cetuximab em associação verificou-se ser não superiores do que o observado com mesilato de gabexato como agente único. No geral, estes resultados preliminares sugerem que o mesilato de gabexato poderia representar uma opção terapêutica promissora para pacientes com CCRm, particularmente para aqueles com mutações KRAS, BRAF e PIK3CA, quer como mono-terapia ou em adição para regimes de quimioterapia convencionais. Novos estudos para melhor elucidar mecanismo gabexato mesilato de ação em células CRC, portanto, são garantidos

Citation:. Brandi G, Tavolari S, De Rosa F, Di Girolamo S, Agostini V, Barbera MA, et al. (2012) antitumoral Eficácia da Protease Inhibitor mesilato de gabexato em células cancerígenas do cólon Abrigando KRAS, BRAF e PIK3CA mutações. PLoS ONE 7 (7): e41347. doi: 10.1371 /journal.pone.0041347

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 17 de fevereiro de 2012; Aceito: 20 de junho de 2012; Publicação: 24 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Brandi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

nos últimos quinze anos, a introdução de pelo seis principais drogas menos (oxaliplatina, irinotecano, capecitabina, bevacizumab, cetuximab e panitumumab), após a “era” de 5-fluorouracil como um agente único, melhorou a sobrevida global mediana de câncer colorretal metastático (CCRm) pacientes até 24 meses [ ,,,0],1], [2]. O emprego do receptor do factor de crescimento anti-epidérmico (EGFR) Anticorpos panitumumab e cetuximab, quer como mono-terapia ou em adição para regimes de quimioterapia convencionais, representa uma cadeia principal com as opções terapêuticas para o tratamento de CCRm. No entanto, estudos randomizados controlados têm fornecido evidências convincentes de que a terapia alvo-EGFR é pouco eficaz ou ineficaz em pacientes com CCRm não selecionados. Nos últimos anos, mutações ativadoras em códons 12 e 13 no oncogene KRAS (KRAS

G12V e KRAS

G13D) surgiram como os melhores preditores de baixa resposta /ausentes à terapia anti-EGFR nestes doentes, seja na primeira linha ou linhas subsequentes de tratamento [3] – [5]. Por esta razão, os pacientes com CCRm agora estão perfiladas para a mutação KRAS e do emprego de cetuximab e panitumumab atualmente é restrito apenas para aqueles que ostentam o KRAS tipo selvagem, tal como recomendado pela Agência Médica Europeia e da Sociedade Americana de Oncologia Clínica [6] . Embora a presença de KRAS tipo selvagem parece ser uma condição para a resposta à terapia alvo EGFR, até 50-65% dos doentes com CCRm não beneficiam deste tratamento, devido a mecanismos de resistência intrínseca adicionais [7]. A este respeito, o envolvimento de BRAF

V600E e PIK3CA

H1074R no exon 20 mutações no fracasso de tal terapia surgiu recentemente [7] – [11]. Devido à falta de uma terapia eficaz alvo, a descoberta de novas opções terapêuticas para pacientes com genes CCRm KRAS, BRAF e PIK3CA mutadas representa, portanto, uma área de investigação intensa.

A protease mesilato de gabexato inibidor demonstrou exercer uma actividade anti-tumoral significativa nas células de CRC, tanto in vitro como in vivo [12]. No entanto, o efeito deste fármaco, por si só ou em combinação com cetuximab, em células humanas de CRC abrigando um padrão de expressão diferente do tipo selvagem /mutada KRAS, BRAF e PIK3CA ainda permanece incerto. O presente estudo tem como objetivo investigar esta hipótese.

Resultados

Nós preliminar selecionou um painel de células CRC humanos abrigando um padrão de expressão diferente do tipo selvagem /mutação KRAS, BRAF e PIK3CA genes. Para este efeito, com base no Catálogo de mutações somáticas no cancro (cósmica) do banco de dados (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/) e no estudo de Jhawer et ai. [13], CACO-2, foram escolhidos HCT-116 células CRC SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e (ver Tabela 1 para os seus correspondentes KRAS, BRAF e PIK3CA estatuto). Notavelmente, nenhuma linha de células CRC com KRAS e BRAF mutações co-ocorrência foi encontrado e incluídos no presente estudo, de acordo com relatórios anteriores que mostram um padrão de exclusividade mútua para a mutação KRAS e BRAF no CRC humana [14]. O efeito do mesilato de gabexato, sozinho e em combinação com cetuximab, foi então investigado em Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e crescimento de células HCT-116, angiogénese potencial e induzida por tumor invasivo , uma vez que representa três processos fundamentais no início e progressão do cancro.

como se mostra na Figura 1, 24 e 48 horas de tratamento com cetuximab (100 ug /ml) foram encontrados para afectar a viabilidade celular apenas em células CRC portadores do tipo selvagem KRAS, BRAF e PIK3CA genes (Caco-2 e SW48), como esperado. Por outro lado, mesilato de gabexato (0,1-1 mM) induziu uma redução significativa de tempo e dose-dependente deste parâmetro em todas as linhas celulares de CRC incluídos no estudo (Caco-2: ic

50 48 h = 0,31 ± 0,01; SW48 : IC

50 48 hrs = 0,33 ± 0,01; HT-29: IC

50 48 hrs = 0,55 ± 0,03 mM; Colo205: IC

50 48 hrs = 0,46 ± 0,02; SW480: IC

50 48 hrs = 0,45 ± 0,02 mm; SW620: IC

50 48 hrs = 0,39 ± 0,02; RKO: IC

50 48 hrs = 0,49 ± 0,01 mm; LS174T: IC

50 48 hrs = 0,59 ± 0,03; HCT-116: IC

50 48 hrs = 0,56 ± 0.0 3 mm). Observou-se que o efeito provocado sobre a viabilidade celular por mesilato de gabexato sozinho foi semelhante à observada quando este fármaco foi administrado em combinação com cetuximab 100 mg /ml (Figura 1).

Avaliação por ensaio MTT de Caco-2 , SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e a viabilidade das células HCT-116 após 24 e 48 h de tratamento com cetuximab 100 ug /ml e mesilato de gabexato 0,1-1 mM, sozinho e em combinação. Três experimentos independentes foram realizados. Para cada linha celular, o valor médio das amostras não tratadas foi assumida como 100% e os valores médios de células tratadas foram representados como percentagem em relação aos seus controlos correspondentes. Cetux: cetuximab; GM: mesilato de gabexato. * P 0,05; ** P 0,001; *** P:. Não significativa

Em seguida, investigamos o efeito destas duas drogas em CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e HCT- 116 invasão. O tratamento durante 6 horas com mesilato de gabexato 1 mM reduziu significativamente o potencial invasivo em todas as linhas celulares testadas CRC (CACO-02:53%; SW48:42%; HT-29:45%; Colo205:43%;% SW480:55 ; SW620:69%; RKO: 63%; LS174T: 54%; HCT-116:52%) (Figura 2). Nomeadamente, uma tal diminuição não foi devida a um efeito citotóxico do fármaco, tal como confirmado por uma experiência paralela em que não se observou qualquer alteração significativa da viabilidade celular entre o controlo e as células tratadas no momento do tratamento (dados não mostrados). Por outro lado, 6 horas de tratamento com cetuximab 100 ug /ml não induziu alterações significativas no potencial invasivo de células de CRC, excepto em células Caco-2 e SW48, onde foi observado um 25% e 22% de inibição, respectivamente. Mais uma vez, quando este fármaco foi utilizado em combinação com mesilato de gabexato, o efeito provocado foi semelhante ao observado com o mesilato de gabexato como agente único (Figura 2).

Avaliação por ensaio de invasão de Boyden câmara de Caco-2, SW48 , HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e HCT-116 potencial invasivo após 6 horas de tratamento com cetuximab 100 ug /ml e 1 mM de mesilato de gabexato, sozinhos e em combinação. Para cada linha celular, o valor médio das amostras não tratadas foi assumida como 100% e os valores médios de células tratadas foram representados como percentagem em relação aos seus controlos correspondentes. De fotografias de células invasoras são representativos de três experiências independentes com resultados semelhantes. Cetux: cetuximab; GM: mesilato de gabexato. Barra de escala: 50 ^ m. * P 0,05; *** P:. Não significativa

Por fim, avaliamos o efeito do cetuximab e gabexato mesilato sobre a angiogênese induzida por tumor. Foi observado um efeito inibidor muito forte neste parâmetro quando examinamos a ação de mesilato de gabexato sozinho. Com efeito, 24 horas de incubação de células de EA.hy926 com o meio condicionado de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, as células LS174T e HCT-116, previamente tratadas durante 6 horas com esta droga ao dose de 1 mM, diferenciação de células endoteliais quase completamente inibido em estruturas do tipo capilar, tal como indicado pela presença de uma rede interligada de células em amostras de controlo e de células esféricas, isoladas ou em pequenos aglomerados, em aqueles tratados (Figura 3 anastomosando ). Também a este parâmetro, cetuximab isoladamente (100 ug /ml) foi encontrado para ser moderadamente eficazes apenas em linhas de CRC de células com o tipo selvagem KRAS, BRAF e genes PIK3CA (inibição do índice de formação do tubo, 22% e 20% em Caco-2 e células SW48, respectivamente). Devido à forte inibição de angiogénese induzida por tumores por mesilato de gabexato sozinho na dose de 1 mm, o efeito desta droga sozinha e em combinação com o cetuximab foi também avaliada com a dose de 0,1 e 0,5 mM. No entanto, também a estas doses, o efeito anti-angiogénico exibida por mesilato de gabexato mais cetuximab não foi superior do que a observada com mesilato de gabexato empregue como agente único (dados não mostrados).

Avaliação por ensaio in vitro de Matrigel angiogénese de diferenciação celular endotelial EA.hy926 em estruturas do tipo capilar após 24 horas de incubação com o meio condicionado de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, as células LS174T e HCT-116, anteriormente tratadas durante 6 h com cetuximab 100 ug /ml e mesilato de gabexato 1 mM, combinação por si só e em. índice de formação do tubo foi avaliada tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Para cada linha celular, o valor médio das amostras não tratadas foi assumida como 100% e os valores médios de células tratadas foram representados como percentagem em relação aos seus controlos correspondentes. As fotografias são representativos de três experiências independentes, com resultados semelhantes. Cetux: cetuximab; GM: mesilato de gabexato. Barra de escala: 50 ^ m. * P 0,05; ** P 0,001; *** P:. Não significativa

Em geral estes resultados, além de confirmar a falta de resposta ao cetuximab em células CRC com mutações KRAS, BRAF e PIK3CA, indicam que gabexato mesilato é capaz de exercer uma significativa actividade anti-tumoral em células abrigando CRC quer de tipo selvagem ou mutado genes KRAS, BRAF e PIK3CA, com uma eficácia comparável com a observada quando é utilizada em combinação com anticorpos anti-EGFR.

Discussão

terapia personalizada representa um objetivo atrativo em oncologia. Até à data, do genoma do câncer seqüenciamento tornou-se uma ferramenta poderosa para identificar mutações relacionadas ao câncer e para selecionar os pacientes que poderiam se beneficiar de um regime terapêutico específico. Neste contexto, a análise de mutação KRAS aumentou rapidamente o índice terapêutico da terapia alvo EGFR em pacientes com CCRm, restringindo o tratamento apenas para aqueles que albergam KRAS do tipo selvagem. Embora uma validação adicional é necessária antes de uma possível aplicação na prática clínica, tornou-se claro que BRAF e PIK3CA genotipagem adicional poderia melhorar significativamente a taxa de resposta objectiva nestes pacientes. De facto, a activação KRAS, BRAF e PIK3CA mutações são capazes de contornar a inibição farmacológica de EGFR, resultando assim numa activação constitutiva da proteína quinase AKT e vias activadas por mitogénio, conhecida por desempenhar um papel central no aparecimento e progressão [15] do cancro. Em termos de implicações terapêuticas, isto sugere que também pacientes com CCRm com genes BRAF e PIK3CA mutantes deve ganhar pouco ou nenhum benefício da terapia alvo-EGFR. Notavelmente, KRAS, BRAF e PIK3CA mutações são normalmente activados (até 50-60% como um todo) em pacientes de CRC [14]. Por esta razão, a descoberta de novas opções de tratamento eficaz em pacientes com CCRm que carregam tais mutações representa, atualmente, uma área intensiva de investigação [11], [16] – [18].

A protease gabexato inibidor mesilato é uma droga rotineiramente empregada na prática clínica na Itália, Japão e Coréia para o tratamento da pancreatite aguda e coagulação intravascular disseminada, em conjunto com a profilaxia de pancreatite colangiopancreatografia retrógrada endoscópica pós-[19], [20]. Nomeadamente, o perfil toxicológico mesilato de gabexato foi testado em humanos e efeitos secundários graves têm sido raramente descrito. Curiosamente, em estudos pré-clínicos anteriores, esta droga demonstrou uma atividade antitumoral potente, incluindo a inibição da CRC crescimento e metástases hepáticas de tumores primários em camundongos nus [12].

Este estudo pré-clínico teve como objetivo investigar a eficácia antitumoral putativa de gabexato mesilato, sozinho e em combinação com o cetuximab anticorpo monoclonal anti-EGFR, num painel de linhas celulares de CRC humanos que albergam um padrão de expressão diferente de genes de tipo selvagem /mutada KRAS, BRAF e PIK3CA. Os resultados obtidos (além de confirmar a falta de resposta a cetuximab em células de CRC que carregam tais mutações) mostrou que mesilato de gabexato foi capaz de exercer um efeito antitumoral amplo em tais células, sendo capaz de afectar significativamente a viabilidade celular, angiogénese potencial e induzida por tumor invasivo em todas as linhas celulares testadas neste estudo, incluindo aqueles que abrigam dupla KRAS /PIK3CA ou mutação BRAF /PIK3CA. A eficácia do mesilato de gabexato como agente único, foi verificou-se ser comparável ao observado quando este fármaco foi utilizado em combinação com cetuximab, indicando, assim, que a eficácia anti-tumoral destes fármacos em combinação não foi superior do que a de mesilato de gabexato empregue como agente único.

Notavelmente, o crescimento celular, um elevado potencial e angiogénese induzida por tumores invasivos são três processos fundamentais para o desenvolvimento e metastatisation cancro, representando, assim, um alvo atractivo para o tratamento do cancro. Por uma questão de facto, muitas estratégias terapêuticas com base na integração de inibidores selectivos de estas vias estão agora a ser amplamente explorado em estudos pré-clínicos e clínicos. Neste contexto, tendo também em conta o bom perfil toxicológico, os resultados preliminares mostraram neste curto relatório sugerem que gabexato mesilato poderia representar uma opção terapêutica promissora para pacientes com CCRm, particularmente para aqueles rolamento mutados genes KRAS, BRAF e PIK3CA, quer como mono-terapia ou em adição para regimes de quimioterapia convencionais. Novos estudos para melhor elucidar mecanismo gabexato mesilato de ação em células CRC, portanto, são garantidos.

Materiais e Métodos

Células e Cultura de Células

As linhas celulares de CRC humanos HT-29 , LS174T e HCT-116, bem como a linha celular endotelial EA.hy926 semelhante humana imortalizada, foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). RKO, CACO-2, SW480 e SW48, SW620 e linhas celulares Colo205 humanos CRC foram uma oferta generosa do Dr. Luigi Ricciardiello (Departamento de Clínica Médica, Hospital Sant’Orsola-Malpighi, da Universidade de Bolonha, Bolonha, Itália) e Prof. Massimo Derenzini (Departamento de Clínica de Radiologia e Ciências histopatológicos, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, Universidade de Bolonha, Bolonha, Itália), respectivamente. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 4,5 g /L de glucose (Euroclone, Milão, Itália), suplementado com 10% (v /v), 2 mM de L-glutamina de FBS (Euroclone), inactivado pelo calor, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 e rotineiramente passadas utilizando tripsina-EDTA a 0,025% (Sigma-Aldrich). Para cada linha de células empregado neste estudo, um teste de autenticação linha de células avaliando DNA curta em tandem repeat (STR) perfil foi realizada, a fim de excluir a contaminação ou erro de identificação com outras linhas celulares.

mesilato de gabexato (Foy, Sanofi Aventis, Milão, Itália) e cetuximab (Erbitux, (Merck, Darmstadt, Alemanha) foram diluídos para o meio para se obter a concentração final necessária antes de cada experiência. para ambas as drogas, as doses empregues (100 ug /ml para o cetuximab e 0,1-1 mM de mesilato de gabexato) foram escolhidas de acordo com estudos in vitro anteriores [12], [13], [21], [22]. Como o mesilato de gabexato tem sido relatada como sendo parcialmente degradado por albumina do soro [23], todos os experimentos foram realizados em meio isento de soro. em experiências realizadas com o meio condicionado de linhas celulares de CRC, as células foram tratadas com fármacos, sozinhos e em combinação, durante 6 horas e, em seguida, o meio condicionado foi colhido, centrifugado a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para remover células e resíduos, e congeladas a -80 ° C até à sua utilização.

Ensaio de viabilidade celular

experiências de viabilidade celular foram realizados por 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio (MTT). Resumidamente, Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e células HCT-116 (1 × 10

4 células /cavidade) foram plaqueadas numa placa de 96 poços em quadruplicado e permitiu -se aderir durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com cetuximab e concentrações crescentes de mesilato de gabexato, durante 24 e 48 horas. No final da incubação, adicionou-se MTT a cada poço e as células incubadas a 37 ° C durante 4 horas. cristais de formazan foram então dissolvidos por adição de DMSO. A absorvência foi então medida a 570 nm em um de 96 poços espectrofotométrica leitor microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para cada linha de células, o IC

50 o valor foi calculado por análise de regressão não linear, utilizando PRISM 5.01 versão do software (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

quimioinvasão Ensaio

A potencial invasivo de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e HCT-116 células foi avaliada por ensaio de quimioinvasão [24]. Resumidamente, filtros de policarbonato isento de polivinilpirrolidona (Millipore, Co. Cork, Irlanda) com 12 mm poros foram revestidas com Matrigel (Sigma-Aldrich). DMEM fresco suplementado com 10% de calor-inactivado FBS foi colocada na câmara inferior como quimioatractor e 1 × 10

5 células foram então semeadas na câmara superior e incubaram-se durante 6 horas com mesilato de gabexato e cetuximab, sozinhos e em combinação, a 37 ° C em 5% humidificada de CO

2. No final da incubação, as células não invasoras foram removidas da superfície superior dos filtros. Invadir as células na superfície inferior foram então fixadas durante 1 min em etanol a 95% e coradas durante 10 min com 0,5% w /v de azul de toluidina. No ensaio de migração, o mesmo procedimento de ensaio de invasão foi seguido, excepto que os filtros foram revestidas com gelatina (Sigma-Aldrich). As fotografias foram tiradas com um microscópio Olympus CKX41 invertido (Olympus Italia, Milão, Itália), equipado com uma câmera Olympus C5060-ADU (Olympus Italia). Para cada amostra, quatro campos ópticos aleatórios no × 200 de ampliação total foi analisado e o número médio de células invasoras foi calculado da seguinte forma:. Número de células invadindo dizer /número de células que migram correspondente significa

In vitro Angiogenesis ensaio

In vitro angiogénese foi avaliada pela diferenciação de células endoteliais em estruturas do tipo capilar em Matrigel. Resumidamente,-factor de crescimento enriquecido Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) foi colocado numa placa de 24 poços com gelo e deixou-se polimerizar durante 1 h a 37 ° C. células endoteliais EA.hy926 (1,2 × 10

5 /poço) foram então plaqueadas e incubadas durante 24 horas com uma quantidade igual de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T e HCT -116 meio condicionado, obtido como descrito acima na secção materiais e Métodos. meio condicionado de células do cancro é geralmente utilizada efectivamente em ensaios in vitro para imitar a angiogénese que ocorre durante a angiogénese do tumor in vivo [25]. No final da incubação, uma organização tridimensional foi observada através de uma luz de contraste de fase microscópio invertido. De fotografias de quatro campos representativos de cada amostra foram obtidos a 200 × ampliação total com um microscópio Olympus CKX41 invertido (Olympus Italia), equipado com uma câmara Olympus C5060-ADU (Olympus Italia). Uma medição semi-quantitativa de estruturas do tipo capilar (tubo de índice de formação) foi realizada como previamente descrito [26].

Análise estatística

Os resultados são expressos como a percentagem média ± D.P.. Os dados foram analisados ​​por ANOVA seguido pelo teste post hoc de Bonferroni, utilizando PRISM 5.01 versão do software (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Reconhecimentos

Os autores agradecem o Center for Applied Biomedical Research (CRBA, Hospital Sant’Orsola-Malpighi, da Universidade de Bolonha, Bolonha, Itália. ) para fornecer as instalações para o presente estudo e Dr. Carla Bini (Departamento de Medicina e Saúde Pública da Universidade de Bolonha, Bolonha, Itália) para autenticação linha de células.