Abstract
Fundo
genes específicos são metilado com alta frequência em neoplasia colorretal, e pode vazar para o sangue. Detecção de biomarcadores múltiplos ADN metilado no sangue pode melhorar a sensibilidade do ensaio para o cancro colo-rectal (CRC) em relação a um único marcador. Realizamos um estudo de caso-controle avaliando a presença de dois marcadores de metilação do DNA,
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e
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, em circulação para determinar se eles eram complementares para a detecção de CRC.
Métodos
os ensaios de PCR específicos de metilação foram desenvolvidos para medir o nível de metilado
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e
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em DNA extraído de plasma obtido a partir de 144 controles saudáveis colonoscopia confirmada e 74 casos de CRC
Resultados
rendimentos de DNA variou de 2 a 730 ng /mL de plasma. (média 18.6ng /mL; 95% CI 11-26 ng /ml) e não se correlacionou com sexo, idade ou status de CRC. Metilado
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e
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DNA foram detectados em, respectivamente, 48 (65%) e 50 (68%) dos 74 tipos de câncer. Em contraste, apenas 5 (4%) e 7 (5%) controles foram positivos para
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e
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metilação do DNA, respectivamente. Um modelo classificador de dois genes ( “uma ou” regra) melhorou segregação de CRC dos controles, com 57 dos 74 cânceres (77%) em comparação com apenas 11 dos 144 (7,6%) controles sendo positivo para
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e /ou
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metilação do DNA. níveis crescentes de DNA metilado foram observados como estágio CRC progrediu.
Conclusões
Detecção de metilado
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e /ou
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DNA no plasma podem ter aplicação clínica como um novo exame de sangue para CRC. Combinando os resultados dos dois ensaios de PCR específicos de metilação melhorada detecção CRC com alteração mínima da especificidade. Além disso validação deste exame de sangue de dois genes, com vista à aplicação na triagem agora é indicado
Citation:. Pedersen SK, Baker RT, McEvoy A, Murray DH, Thomas M, Molloy PL, et al. (2015) Uma análise de sangue de dois Gene para metilado DNA Sensitive para o cancro colorectal. PLoS ONE 10 (4): e0125041. doi: 10.1371 /journal.pone.0125041
Editor do Academic: Alejandro H. Corvalán, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Faculdade de Medicina, CHILE
Recebido: 13 de novembro de 2014; Aceito: 08 de março de 2015; Publicação: 30 de abril de 2015
Direitos de autor: © 2015 Pedersen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi co-financiado pelo Clinical Genomics Pty Ltd, ea Commonwealth Scientific and industrial Research Organisation (CSIRO). LCL, SKP, RTB, AM, DHM e MT são empregados por Clinical Genomics Pty Ltd. PLM, SM e TL são empregados por CSIRO. GPY é um consultor pago of Clinical Genomics Pty Ltd. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:.. Os seguintes autores declaram potencial interesses concorrentes, na medida em que foram empregadas por ou recebeu honorários de consultoria de, Clinical Genomics Technologies Pty. Ltd .: LCL, SKP, RTB, AM, DHM, MT, e GPY. LCL, RTB, SKP, PLM, SM, TL são inventores em um ou mais pedidos de patentes sobre os biomarcadores de metilação do DNA descritas neste documento. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O câncer colorretal (CRC) é um grande desafio para a saúde pública e de triagem é uma ferramenta importante no cancro controle em países com um encargo significativo CRC. No entanto, as taxas de participação com triagem com base na colonoscopia invasiva ou amostragem fecal são baixos [1]. Uma recente pesquisa de assuntos rastreio em idade suporta a aceitabilidade provável de um exame de sangue para CRC com 78% dos participantes preferindo um exame de sangue para um exame de fezes [2].
As recentes melhorias em tecnologias moleculares demonstraram que ácidos nucleicos derivadas de tumores no sangue podem ser detectadas de uma forma robusta e reprodutível [3]. Em particular, não há acumulação de documentar literatura circulante ADN mutado e /ou específico de tumores metilado e ARN [08/04].
Temos anteriormente descrito a descoberta e validação de uma gama de novos hipermetilado genes característicos das colorrectal tecido neoplásico [9]. Os ensaios específicos de metilação concebidos para detectar estes genes hipermetilado mostrou sinal mínimo em ADN extraído a partir de sangue reunido de dadores saudáveis, para um subconjunto dos marcadores de [9]. Com base em seus níveis relativos de fundo potencial escolhemos dois genes, de cadeia ramificada transaminase aminoácido 1,
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e ikaros zinco família de proteínas dedo 1,
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[9,10], como candidatos de chumbo para a avaliação como base de um exame de sangue para CRC.
Nós relatamos a avaliação de dois ensaios de PCR específicos de metilação para a detecção de metilado
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e
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DNA extraído de amostras de plasma de 218 indivíduos colonoscopia examinadas (144 controles saudáveis e 74 casos CRC) para determinar se os biomarcadores de metilação foram complementares para a detecção de CRC.
Materiais e Métodos
casos e controles
o sangue foi obtido a partir de voluntariado e temas agendados para colonoscopia em Flinders Medical Centre (FMC) ou Repatriação Hospital Geral (Adelaide, SA, Austrália) que deram consentimento por escrito na concordância com o protocolo do estudo revisado e aprovado pelo informada Comissão de Ética e Pesquisa do Hospital e Comitê de Ética Repatriação Geral do Flinders Medical Centre. O sangue foi coletado por flebotomia após preparo intestinal, mas antes da colonoscopia. O diagnóstico clínico foi determinado com base na colonoscopia e avaliação histológica. Cancros foram encenadas de acordo com Cancer AJCC encenar 7
ª edição. amostras de plasma adicionais de assuntos colonoscopia examinadas foram adquiridos Proteogenex Inc. CA, EUA (PGX) que recolheu o sangue de voluntários 3-10 dias após a sua colonoscopia exploratória. Os espécimes foram selecionados para análise retrospectivamente ao diagnóstico colonoscopia-based. casos de câncer (FMC: n = 25, PGX: n = 49) foi selecionado com base na disponibilidade de volume, enquanto que os controles (FMC: n = 85, PGX: n = 84) foram selecionados com base em nenhuma aparência de hiperplásicas e adenomatosos pólipos (mas permitindo condições benignas, tais como hemorróidas e doença diverticular), com uma tentativa de jogo do género em idade os casos CRC disponíveis para teste.
preparação plasma
O componente de plasma do sangue total coletado em K
tubos 3EDTA VACUETTE (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) foi isolado por centrifugação a 1500g durante 10 minutos a 4 ° C (freios desactivados na centrífuga). A fracção de plasma da camada superior foi recuperada e a centrifugação foi repetida. O plasma resultante ‘de dois spin foi armazenado a -80 ° C até à sua utilização. O tempo total da coleta de sangue para congelamento de plasma havia mais de quatro horas em todos os sites de recrutamento.
Process Controls
plasma reunido de dadores gênero e da mesma idade com menos de 30 anos de idade foi comercialmente origem (Bioreclamation, Nova Iorque, EUA) e utilizado puro como um controlo negativo ou cravado com ADN totalmente metilado sonicada humano genómico (Millipore, MA, EUA), 1250pg /ml, como um controlo positivo. Estes controlos de processo foram realizados como lotes 2 litros e subsequentemente armazenado como alíquotas de 4 ml a -80 ° C até à sua utilização.
Desenho do Estudo
espécimes de plasma foram tratados aleatoriamente em lotes de 24 amostras, incluindo uma controle de processo positivo, um controle de processo negativo e 22 amostras clínicas (fenótipos cego para testar os operadores).
Isolamento e conversão de bissulfito de DNA circulante livre de células
DNA circulante (cfDNA) sem celular extraiu-se a partir de plasma de 4 ml utilizando o QIAamp Circulating ácido nucleico Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A extração foi semi-automática em dois manipuladores de líquidos QIACube (12 amostras por instrumento por corrida) como recomendado pelo fabricante (Qiagen). Volume de eluição foi ajustado para 40 uL e o eluído foi manualmente re-aplicado à coluna de sílica, para melhorar o rendimento cfDNA. O kit de conversão rápida Bissulfito EpiTect (Qiagen) foi usada para converter bissulfito isolado cfDNA. O bissulfito convertido ADN foi purificado em QIACube instrumentação utilizando o kit EpiTect Além disso bissulfito (Qiagen) com duas modificações: 1) a partir de colunas o kit de Ácido Nucleico QIAamp circulante foi utilizado no lugar de colunas fornecidas no kit Epitect Além disso bissulfito; 2) O tampão de ligação Epitect Plus foi preparado com isopropanol em vez de etanol. Volume de eluição foi ajustado para 40 uL e o eluído foi manualmente re-aplicado à coluna de sílica, para melhorar o rendimento cfDNA. Um total de 36μL bissulfito convertido cfDNA foi recuperado a partir de 4 ml de cada amostra de plasma. recuperação bem sucedida de bissulfito convertido cfDNA foi confirmada em duplicado de entrada de 5 � 1: 5 bissulfito diluída convertido ADN utilizando um ensaio de ACTB PCR como descrito anteriormente [11], com modificações menores (ver Tabela S1). Cada corrida de PCR incluíram três amostras de controlo não-molde e uma curva padrão com base numa quatro vezes diluições em série de 5 ng de ADN humano bissulfito-convertido isolado a partir de células brancas do sangue (WBC; Roche Applied Science, Basileia, Suíça), preparado no um fundo de água isenta de nuclease (Promega, WI, EUA). A massa de bissulfito recuperado convertido cfDNA para cada amostra processada foi estimada a partir da curva padrão, utilizando regressão linear se encaixa ao limiar de ciclo (Ct) valores (ver Fig S1).
Detecção de metilado
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e
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DNA
Aparência do metilado
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e
DNA IKZF1
em circulação foi medida na entrada triplicado de 5 � bissulfito purificado convertido DNA (por exemplo, equivale para 0,5 mL de plasma por PCR) utilizando ensaios específicos e metilação de bissulfito conversion- como previamente descrito [9] com modificações menores (ver Tabela S1). Resumidamente, os dois ensaios de PCR em tempo real direcionados locais CpG metilados em regiões abrangendo 102- ou 95- nucleotídeos, quer no interior, ou apenas a montante do primeiro exão do
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e
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genes, respectivamente (ver Fig S2). a amplificação do alvo de ADN foi efectuada durante 50 ciclos num LightCycler LC480, o modelo II (Roche). Os valores Ct foram calculados usando um
nd algoritmo 2 derivado fornecido com o software LC480. O
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ensaio de PCR (sonda de hidrólise) e
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ensaio de PCR (SYBR verde /derreter) foram qualitativamente chamado de “positiva” para o
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metilação se uma mudança total na intensidade de fluorescência acima dos níveis de fundo foi medida dentro de 50 ciclos de amplificação por PCR. Além disso, para
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chamados positivos, o componente de análise de perfil de fusão do
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ensaio de PCR teve que dar uma temperatura de fusão superior a 80 ° C (ver S1 Tabela). PCR com nenhum sinal foi atribuído um valor de Ct arbitrário de 50 para fins gráficos. Cada execução PCR incluiu três amostras no-modelo de controle, três 5 ng bis-convertido DNA WBC (Roche) amostras de controlo negativo, e uma curva padrão com base em 4 vezes diluição em série de 5 ng de ADN genómico humano totalmente metilado bissulfito-convertidos (Millipore) preparada em um fundo de ADN WBC converteu-bissulfito (Roche) (ver Fig S2). Cada concentração ponto padrão continha um total de DNA 5 ng. Os ensaios específicos de metilação foram quantitativa de 20 pg (0,4%) para 5 ng (100%) do DNA alvo metilado num fundo de ADN WBC (R
2 valores quadrados:
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, 0,9370;
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, 0,9387, S2 Fig), mas capaz de detectar até 5 pg (equivalente a 1-2 cópias genômicas) de metilado
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e
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DNA. A massa de metilado
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e
DNA IZKF1 Compra de cada espécime processados foi estimada a partir da curva padrão, utilizando regressão linear se encaixa aos valores Ct. A massa de metilado
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ou
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DNA foi expressa como a massa média (picograma; pg) de metilado
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ou
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DNA per ensaio triplicado PCR ou por ml de plasma (ver S2 Tabela).
Resultado Amostra Interpretação
Recuperação de DNA convertido bissulfito foi confirmado se pelo menos uma réplica foi positivo no
ACTB
ensaio qPCR. Os restantes bissulfito de DNA convertido Depois, analisou como entradas em triplicado de 5 � quer na
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ou
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ensaios qPCR. Os seguintes dados foram coletados para cada amostra processada: dois
ACTB
medições qPCR Ct, massa de DNA convertido bissulfito, três
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medições qPCR Ct, três metilado
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massa medições, três
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qPCR Ct medições e três metilado
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medições (S2 tabela). Todas as curvas de amplificação por PCR foram inspeccionadas visualmente. Antes de desmascarar fenótipos de amostra, um espécime foi qualitativamente definida como clinicamente positivo para CRC fins de relatório se qualquer um dos três exemplares, nas
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ou
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ensaios de PCR foram positivos.
estatísticos de análise
As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism v5.0d para Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, CA). Para gráficos de densidade de quantidades de metilado
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ou
DNA IKZF1
, as amostras com resultados “Sem Sinal” foram omitidos. Cada um dos ensaios em triplicado continham ADN isolado a partir do equivalente de 0,5 ml de plasma. A densidade empírica de ln (metilado
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, pg) ou ln (metilado
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, pg
)
foi estimado separadamente para controles saudáveis, fase inicial (fase I + II) e fase tardia (fase câncer III + IV). Assumindo uma distribuição de Gauss para os valores de massa metilação (PG), para dar o máximo de entropia (o pior caso) com a média e variância observada, as densidades foram novamente avaliado. Usando estas densidades, calculamos a função de distribuição cumulativa (F (x) = P (X≤x)) e relatar 1-F (x) para ln (pg) metilado
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e
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valores de 3, 3,9 e 4,6. Nós também relatam a relação de probabilidade relativa aos controles saudáveis.
Resultados
Isolamento de DNA livre de células a partir de amostras de plasma
Dez lotes individuais foram realizados para processar as amostras de plasma 218 . Controlos de processo confirmou nenhuma variação de confusão no processamento em lote (dados não mostrados). O
ACTB
ensaio qPCR confirmada recuperação bem sucedida de bissulfito de ADN convertidas a partir de todas as 218 amostras de plasma processados (ver Fig S3 e S2 Tabela) e as concentrações de ADN mediana em relação ao fenótipo e condições clínicas de recolha encontram-se resumidos na Tabela 1. a maioria dos rendimentos de DNA foram recuperadas dentro de um intervalo de concentração de duas vezes (95% CI gama: 11.2-26.2ng /mL). rendimentos significativamente mais baixos de ADN convertido bissulfito foram recuperados a partir de amostras recolhidas pela FMC, em comparação com os rendimentos médios recuperados a partir de amostras recolhidas por PGX (concentrações medianas: FMC: 7,0 ng /mL, PGX: 17.8ng /mL, t-teste Valor de p 0,0001, consulte S3 Fig). diferenças de protocolo Inter-site foram relatados para causar a variação mais forte em concentrações de ADN que circulam medidos [12]. Nós cuidadosamente monitorizados procedimentos de coleta e processamento para garantir protocolos comuns. A única variação sistemática que poderia explicar estes rendimentos de DNA contrastantes foram os diferentes pontos de tempo em que o sangue foi colhido em relação à colonoscopia. Não houve correlação entre a quantidade de DNA recuperado de plasma e fenótipo clínico (ver Fig S3) em contraste com estudos que incluíram uma maior proporção de câncer em estágio final [13,14]. Além disso, não foi observada correlação entre a produção de DNA, a idade do paciente ou sexo (dados não mostrados).
Detecção de circular metilado
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e
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DNA
os níveis de metilado
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e
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DNA em bissulfito convertido DNA recuperado das amostras de plasma 218 foram medidos por análise em triplicado de um volume de plasma equivalente a 0,5 ml de plasma por PCR bem. Sessenta e oito das amostras de plasma 218 foram positivos para ambos os
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e /ou
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metilação (Tabela 1 e S2 Tabela). Não foi observada correlação entre as taxas de positividade de ensaio e rendimento de bissulfito recuperado convertido cfDNA, idade do paciente (Fig 1) ou ao sexo (ver Fig S4). Estatisticamente significativamente maiores taxas de positividade foram medidos em casos de CRC em comparação com controlos para ambos os ensaios de metilação (FIG 2, os valores de p 0,0001). O
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ensaio de metilação foi positiva em 53 dos 218 espécimes analisados, incluindo 48 (65%) de câncer e 5 (4%) controles. O
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ensaio teve uma taxa de positividade um pouco maior, com 57 amostras positivas, incluindo 50 (68%) casos de CRC e 7 (5%) controles. O aumento das taxas de positividade foram observados com estágio CRC para ambos os marcadores como mostra a Tabela 1. Localização das lesões eram conhecidos por 70 dos 74 casos de câncer (S2 tabela). Não houve diferença nas taxas de positividade medidos em proximal contra cancros distais (proximal, n = 21, 16 positivos (76%); distal, n = 49, 38 positivos (78%), teste-t valor p: 0,9029).
parcelas de correlação de sinais médias Ct medidos nos
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(triângulos pretos) e
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(triângulos brancos) ensaios de metilação contra (a) massa de bissulfito recuperado convertido DNA plasma por mL ou (B) a idade dos indivíduos no momento da coleta de sangue. Ensaio replica com “nenhum sinal” foi atribuído o valor Ct arbitrário de «50» para fins depiction.
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(painel superior, triângulos pretos) e
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(painel inferior, triângulos brancos) ensaios específicos de metilação foram utilizados para avaliar a aparência de circular metilado
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e
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DNA em 218 amostras de plasma incluindo 144 controles saudáveis e 74 tipos de câncer. Mann-Whitney t-testes foram realizados em taxas de positividade calculados para cada classe fenotípica para derivar os valores de P. Os intervalos de confiança de 95%, calculado (IC 95%) são indicadas.
complementaridade metilação biomarcador
Sessenta e oito espécimes foram positivos em pelo menos um dos dois ensaios de metilação, dos quais apenas 42 foram positivos para ambos os marcadores de metilação (41 casos CRC e um controle). Figura 3A mostra que um resultado qualitativo combinada com base em, pelo menos, uma réplica positiva quer na
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ou
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ensaio de metilação produzido a precisão da classificação mais elevada (IC 0,8469, 95%: 0,7848-0,9091 ) em comparação com qualquer dos dois marcadores sozinhos (
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; 0,8070, IC 95% 0,7368-0,8771,
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; 0,8135, IC 95%: 0,7448-0,8822). O modelo classificador 2-gene ( “uma ou” regra) teve uma sensibilidade estimada para CRC de 77% (IC 95%: 65,8-86,0), com uma especificidade de 92,4% (IC 95%: 86,7-96,4; Fig 3), melhorando assim a taxa de detecção de cancro por mais de 10%, com menos do que uma diminuição de 4% em especificidade. A positividade do ensaio de dois genes combinados para CRC fases I-IV foi de 50%, 68%, 87% e 100%, respectivamente (Tabela 1).
Os valores de precisão de sensibilidade, especificidade e discriminação para o
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,
IKZF1 Comprar e ensaios de dois genes combinados foram calculados utilizando os verdadeiros e falsos taxas de positividade medidos em 144 controles saudáveis e 74 casos de câncer (a) e, posteriormente plotados no espaço Receiver Operator Characteristic (ROC) parcelas (B). Os ensaios de um único gene: Uma amostra de plasma foi qualitativamente chamado “positiva” se, pelo menos, um de PCR replicadas resultou num sinal de Ct. ensaio de dois genes: Um espécime foi qualitativamente chamado “positivo” se pelo menos uma réplica nem no
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ou
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ensaios produziu um valor Ct
Níveis de metilado
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ou
DNA IKZF1
contra a gravidade da doença
Boa correlação foi observada no ciclo de limiar (CT), os valores medidos em amostras positivas para ambos
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e
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metilação do DNA (co-eficiência correlação R
2 = 0,9053, Fig 4A). Cada um dos ensaios em triplicado continham ADN isolado a partir do equivalente de 0,5 ml de plasma. As massas médias de metilado
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ou
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DNA medido em CRC fases II, III e IV foram significativamente maiores em comparação com a massa média de metilação medido em número limitado de controles que foram positivos (Figura 4B e 4C). A relação entre os níveis medidos de circular metilado
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ou
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DNA no plasma e câncer em estágio foi modelado para estimar a probabilidade de câncer, dado um metilado
BCAT1
ou
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estimativa da massa DNA por ensaio triplicado. plotagens de densidade foram estimados (Fig 5A e 5B, linhas quebradas) usando apenas massas de metilação positivos para o plasma de fenótipos conhecidos classificados como controles saudáveis, câncer em estágio inicial (fase I + II) e câncer em estágio final (fase III + IV). As parcelas de densidade modelados, assumindo que os níveis de metilação observados foram desenhados a partir de uma distribuição normal (Figura 5A e 5B, linhas sólidas), em que utilizada para estimar as probabilidades cumulativas (Figura 5C) que uma amostra de plasma a partir de uma classificação conhecida produziria uma Câncer observada nível de metilação do DNA derivado igual a ou maior do que o correspondente a 20, 50 ou 100 pg. Determinou-se que menos de 8% das amostras de plasma de controlo positivo são encontrados para conter pelo menos 20 pg de metilado
BCAT1
ou
IKZF1
DNA, enquanto que 63-77% dos cancros em fase inicial teve 20 pg ou mais. Assim, a probabilidade de uma amostra de plasma com ≥ 20 pg metilado
BCAT1
ou
DNA IKZF1
ser um câncer em estágio precoce é de cerca de 9: 1 e 210: 1, respectivamente (início do estágio de CRC: ao controle). Além disso, uma amostra de plasma com 100 pg de metilado
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DNA é aproximadamente 2,5 vezes mais propensos a ser desenhado a partir de um tema com CRC fase tardia (Fase III ou IV) do que um sujeito com CRC fase inicial (fase I ou II).
(a) curva de correlação de médio CT (log (Ct)) medido pela
BCAT1
ou
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ensaios de 144 controles saudáveis (preto círculos) e 74 CRC (círculos brancos). PCR replica com nenhum sinal foi atribuído um valor de Ct arbitrário de 50 para fins depiction. quadrantes quadrados (a) a (d) representa: (a) 15
BCAT1
negativo, mas
IKZF1
casos positivos; (B) 42
BCAT1
e
IKZF1
casos positivos, incluindo 41 cancro e um controle; (C) 11
BCAT1
positivo, mas
IKZF1
casos negativos; (D) 150
BCAT1 Comprar e
IKZF1
casos negativos. A análise de regressão linear foi realizada em 38 dos 41
BCAT1
e
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casos de CRC positivos (quadrante b), omitindo três valores atípicos CRC. linhas diagonais tracejadas indicam a faixa de 95% CI. O valor quadrado R calculado é mostrado. A massa (ng) de metilado
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(B) e
IKZF1
(C) DNA foi calculada e traçada como massa de metilação por mL de plasma extraídas 144 casos de controle, 4 Fase I, 28 Fase II, 23 de Stage III, 8 Stage IV (8 casos de CRC com encenação desconhecido omitidos). níveis médios e medianos em massa em cinco classes fenotípicas estão indicadas abaixo dos gráficos. Mann-Whitney t-teste realizado em valores medianos, ***: p valor 0,05, ns:. Não significativa, em comparação com os 144 casos saudáveis de controle
A massa média estimada de (A)
BCAT1 Comprar e (B)
IKZF1
ADN em cada um dos ensaios em triplicado contendo ADN isolado a partir do equivalente de 0,5 ml de plasma de controlos saudáveis (linhas pretas,
BCAT1
: n = 5,
IKZF1
: n = 2 * ), cancro da fase inicial (linhas azuis, estágio I + II,
BCAT1
: n = 19,
IKZF1
: n = 17) e câncer em estágio final (linhas vermelhas, fase III + IV ,
BCAT1
: n = 22,
IKZF1
: n = 26) foram utilizados para calcular as parcelas de densidade de probabilidade empíricos, omitindo resultados sem sinal (linhas tracejadas). As linhas a cheio: médias de população foram calculadas assumindo uma distribuição normal para cada uma das três classificações fenotípicas (μ) e desvios-padrão (σ). * Cinco dos sete
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casos de controle tinham sinais TC positiva nos últimos 5 ciclos de PCR, portanto, nenhuma estimativa de massa. (C) a probabilidade cumulativa de uma amostra de plasma com
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ou
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níveis de metilação do DNA iguais ou superiores a 20-, 50- ou 100 pg de DNA metilado proveniente de um paciente com o fenotípica indicada classificação; os limiares de massa foram determinados como a área sob a curva (linhas a cheio nos painéis A e B) para ln (PG) valores acima de 3, 3,9 e 4,6, respectivamente (ver linhas verticais tracejadas e setas) nos painéis A e B. Probabilidade rácios relativos aos controles saudáveis são mostrados entre parênteses.
Discussão
Temos relatado anteriormente o desenvolvimento de dois ensaios de conversão e de PCR específica de metilação bissulfito usado para detectar colorectal metilação específica neoplásica na loci gene
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e
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[9]. Nós optimizados
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e
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ensaios qPCR metilação para a detecção da metilação proporções tão baixas como 0,1%, enquanto tais baixos níveis de DNA derivado de tumor têm sido relatados em amostras de plasma de pacientes com estágio CRC início [4,15]. Neste estudo de caso-controle demonstramos que metilado
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DNA é detectada mais frequentemente em casos de CCR (65% e 68%, respectivamente) do que nos controles saudáveis colonoscopia confirmados ( 4% e 5%, respectivamente) e que os dois marcadores de metilação do DNA complementar (positivo combinado de 77% e 7,6% em CRC e controlos saudáveis, respectivamente).
Um total de casos de cancro foram 41/74 positiva para ambos metilado
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e
DNA IKZF1
em comparação com apenas 1/144 controle). Combinando os resultados dos dois ensaios resultaram em uma acurácia discriminatória de 0,8469 que foi melhor do que sozinho quer ensaio (
BCAT1 ensaio
: 0,807,
IKZF1
ensaio: 0,8135), Fig 3. Considerando uma ou um ou outro ensaio de dois genes, mais casos de CRC foram detectadas, com uma correcta segregação de 57/74 (77%) e apenas 11/144 (7,6%) controles saudáveis sendo erroneamente classificados. Estes dados de dois genes fornecem convincentes evidências, simples que múltiplos marcadores biológicos podem melhorar a sensibilidade sem grande comprometimento do utilitário de diagnóstico em termos de menor especificidade.
Detecção de metilado
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e
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DNA no sangue não dependem da idade ou sexo do assunto, ou a quantidade de bissulfito recuperado convertido cfDNA. Uma relação significativa foi observada apenas para o fenótipo clínico. Tanto a frequência de detecção e da quantidade de metilado
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e /ou
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DNA liberado no sangue aumentou com o estágio do câncer. O último foi estatisticamente significativa no estágio II, III e IV cancros, com uma massa metilação mais elevados observados em comparação com o nível medido nos poucos indivíduos saudáveis de controlo positivo (Figura 4). Observações semelhantes também foram observados para o bem estudado
SEPT9
ensaio de metilação [16,17]. Por modelos de montagem de classificação do câncer (controlos, cedo ou tarde o cancro), vamos mostrar o potencial da utilização do nível de metilado
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e /ou
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DNA no sangue para estimar a probabilidade de um ser devido à presença de cancro resultado positivo (Figura 5). Tomados em conjunto, os dados suportam um modelo simples em que a capacidade de detectar marcadores de ADN derivadas do tecido no sistema circulatório é uma função da extensão da invasão pelo lesão [18].
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e
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estão ambos envolvidos no crescimento do tumor e invasão [19,20]. A hipermetilado
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lócus foi demonstrada para diversas patologias, incluindo CRC [21,22] e regulação epigenética aberrante provoca uma mudança na proporção de três principais
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transcritos de mRNA diferindo apenas no primeiro exão, que abriga regiões não traduzidas alternativas [20]. Como as isoformas BCAT1 afectar a proliferação celular é desconhecida, mas especula-se que a produção disfuncional de aminoácidos de cadeia ramificada podem afectar a síntese de macromoléculas necessários para a divisão celular, talvez no ponto de controlo do ciclo celular G1 para S [23].
O fator de transcrição,
IKZF1
, regula numerosos eventos biológicos e seu papel na linfopoese e leucêmica neoplasia tem sido extensivamente estudadas. Uma rede de fatores epigenéticos e transcrição regular
IKZF1
atividade genética [24] e emergentes de dados implica que
IKZF1
também é crucial para a regulação da proliferação e diferenciação de células de origem não hematopoiética, incluindo cólon [25]. Com o complexo NURD como o principal parceiro interagindo [26], Ikaros controla a atividade transcricional de um pequeno conjunto de genes [23,27], incluindo
Notch1
[28]. A via de sinalização Notch é crítico para muitas interacções célula-célula, incluindo a formação de invadopodia [29].
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é um regulador negativo de formação pseudopodia [30], que é um evento-chave que inicia difusão celular e propulsão num ambiente de tecido e estroma (revisto recentemente por [31]). Assim, a perda de
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expressão podem desempenhar um papel activo na invasão tumoral, onde as células tumorais metastáticas, através de mecanismos bem compreendidos migrar para o sistema vascular [32]. Nós especular se
IKZF1
é talvez um regulador a montante do
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atividade.
A via Notch desempenha um papel crucial no processo de auto-renovação das células-tronco da cripta do cólon e sua produção de proliferar e progenitores de células indiferenciadas-amplificação de trânsito, que se movem até a cripta e para a vilosidade onde eles mais, diferenciar [33,34]. Especulamos que a perda de
IKZF1
actividade devido à hipermetilação, leva a sinalização Notch constitutivamente activa que inibe a diferenciação de células progenitoras cripta e resulta num grande aumento de células transientes amplificadoras indiferenciada, como previamente descrito [35-37].
O aumento observado entre positividade cancros fase I-IV implica que a detecção de marcadores de ADN metiladas derivadas de tumores no sangue pode depender em grande parte da vascularização do tecido neoplásico e colorrectal aumentada invasão em geral [18,38]. Se for verdade, em seguida, uma sensibilidade normalizado para a detecção de marcadores derivadas de tumor em circulação não será afectado por a fracção de I cancros fase, como a maioria dos cancros da fase I são susceptíveis de ter qualquer linfática ou invasão de vasos venosos [18]. Como tal, os ensaios à base de sangue não são susceptíveis de detectar uma fracção significativa de cancros em fase inicial que podem ser detectadas por colonoscopia. Isso pode explicar a baixa sensibilidade observada em uma recente avaliação prospectiva da
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em 7.900 participantes assintomáticos, onde foram detectados apenas 48% dos 53 casos de CRC (incluindo vinte e dois cânceres fase I) e 11% dos adenomas [17]. O nosso próprio conjunto de dados incluiu apenas quatro cancros Estágio I, e enquanto dois (50%) destes foram detectados, os números de amostra são actualmente muito baixa para concluir se a
BCAT1
/
test IKZF1
metilado vai dar uma boa detecção de cancros Fase I. Inclusão de variáveis relacionadas com a vasculatura (invasão vascular, capacidade de sobrevivência vascular e angiogênese tumoral) parece melhorar a estratificação de pacientes com câncer [39].