Abstract

Fundo

Xenotropic murino retrovírus relacionados com a leucemia (XMRV) é um recentemente retrovirus descoberto que tem sido associada ao câncer de próstata humana e síndrome da fadiga crônica (SFC). Ambas as doenças afetam uma grande parte da população mundial, com câncer de próstata que afeta um em cada seis homens, e CFS afetando um número estimado de 0,4 a 1% da população.

principais conclusões

Quarenta e cinco compostos, incluindo vinte e oito medicamentos aprovados para uso em humanos, foram avaliadas contra a replicação do XMRV

in vitro

. Verificou-se que o inibidor de integrase retroviral, raltegravir, era potente e selectiva contra XMRV em concentrações submicromolares, em células MCF-7 e células LNCaP, uma linha celular de cancro da próstata e cancro da mama, respectivamente. Outro inibidor da integrase, L-000870812, e dois inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa, zidovudina (ZDV) e tenofovir disoproxil fumarato (TDF) também inibiu a replicação XMRV. Quando combinados, estes medicamentos exibido efeitos principalmente sinérgicos contra este vírus, o que sugere que a terapia de combinação pode atrasar ou impedir a selecção de vírus resistentes.

Conclusões

Se o XMRV prova ser um fator causal na próstata câncer ou CFS, essas descobertas podem permitir o desenho racional de ensaios clínicos

Citation:. Singh IR, Gorzynski JE, Drobysheva D, Bassit L, Schinazi RF (2010) raltegravir é um potente inibidor de XMRV, um vírus implicado no cancro da próstata e Síndrome de Fadiga crônica. PLoS ONE 5 (4): e9948. doi: 10.1371 /journal.pone.0009948

editor: Peter Sommer, Institut Pasteur Coréia, República da Coreia

Recebido: 18 de fevereiro de 2010; Aceito: 11 de março de 2010; Publicação: 01 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Singh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte pelo NIH concessão 2P30-AI-50409 (CFAR a RFS) e pelo Departamento de Assuntos de Veteranos (RFS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. RFS é um fundador e principal acionista da RFS Pharma, LLC, que está desenvolvendo amdoxovir clinicamente e ele recebe royalties das vendas de 3TC. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Xenotropic murino retrovírus relacionados com a leucemia (XMRV) é um recentemente descoberto agente infeccioso [1 ] que tem sido associada ao cancro da próstata humano [2] e síndroma de fadiga crónica (CFS) [3]. Ambas as doenças afetam uma grande parte da população mundial, com câncer de próstata que afeta um em cada seis homens, e CFS afetando um número estimado de 0,4 a 1% da população [4], [5]. ácido ou proteínas nucleico XMRV são encontrados em 27% dos cancros da próstata e em 68% dos pacientes com síndrome de fadiga crônica, e em menos de 4-6% dos controles normais, sugerindo uma associação entre o vírus ea doença humana [2], [3 ].

CFS, uma doença debilitante caracterizada por fadiga severa, tem tido uma etiologia incerta desde o seu reconhecimento. Embora tenham sido propostos uma série de agentes virais e toxinas ambientais a ser associado com CFS, já foi apresentada nenhuma evidência clara para estes (revisto em [6]). A recente associação de XMRV com CFS do Instituto Peterson Whittemore em Reno, Nevada, enquanto longe de ser comprovada causal, é a associação viral mais forte a ser feito ainda. Três relatórios recentes, utilizando ADN plasmídeo como controlos positivos, não encontrou XMRV em pacientes com CFS na Europa [7] [8] [9]. A prevalência de XMRV no câncer de próstata na Europa é incerto, com o relato de um grupo alemão a presença de XMRV em próstatas humanas [10], eo outro não detectar qualquer [11]. Contudo, a noção de que um retrovírus pode ser envolvida em ambos cancro e uma doença neuroimune em seres humanos não é sem precedentes. T-célula humana vírus linfotrópico, tipo 1 (HTLV-1), outro retrovírus, faz com que tanto o linfoma de células T /leucemia, bem como paraparesia espástica tropical, uma mielopatia devido a defeitos imunes resultantes da infecção virai.

infecciosa XMRV foi isolado a partir de soros de pacientes com SFC [3]. A presença de partículas circulantes de retrovírus infecciosos no sangue invoca um cenário de não ao contrário a infecção com um outro retrovírus, vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Uma vez que não existe um tratamento eficaz para esta doença debilitante profundamente, a utilização de agentes anti-retrovirais que têm provado ser razoavelmente segura para o uso humano, pode ser benéfico. A descoberta de agentes anti-retrovirais eficazes contra o XMRV permitiria desenho racional de ensaios clínicos para prevenir a progressão do cancro da próstata ou para tratar CFS.

Neste estudo, relatamos o efeito de 45 compostos na replicação do XMRV em MCF- 7 e células LNCaP, as linhas celulares geradas a partir da mama e da próstata cancros humanos, respectivamente. Foram estudados drogas usadas no tratamento de infecções por HIV-1, assim como compostos utilizados para tratar outras infecções virais em seres humanos. XMRV é um Gammaretrovirus, intimamente relacionado com o vírus da leucemia de murídeo (MLV) [1]. Ao nível dos aminoácidos, que partilha identidade de sequências com considerável Moloney vírus da leucemia murina (MoMLV), um protótipo de MLV. A semelhança máxima entre XMRV e proteínas de MoMLV é encontrado nas sequências para protease virai (96% de identidade), e o mínimo é semelhança entre as duas proteínas de envelope (66% de identidade) [1]. Infelizmente, muitos agentes anti-retrovirais não-activamente utilizados foram testados para a actividade contra a MLV, com a excepção de AZT, o que suprime eficazmente MLV [12], e foi recentemente demonstrado ser eficaz contra XMRV assim [13]. Em contraste, embora haja uma grande quantidade de informação sobre a actividade antiviral contra proteínas essenciais HIV-1, há muito pouca semelhança entre as proteínas do HIV-1 e XMRV, com as proteases (PR) dos dois vírus partilham 28% de identidade ao aminoácido nível de ácido, as proteínas da transcriptase reversa (RT) que compartilham 17% e as proteínas integrase (IN) compartilhando apenas 14% de identidade. Esta semelhança de sequências baixo faz com que seja difícil de prever que, se algum, dos agentes anti-retrovirais que sejam eficazes contra o HIV-1 que seja eficaz contra XMRV. Nós escolhemos várias drogas de cada principal classe de agentes anti-retrovirais: inibidores da transcriptase reversa nucleosídeos e não-nucleosídeos (NRTIs e NNRTIs), EM inibidores, e os inibidores da PR (PI). As proteínas do invólucro do XMRV e HIV-1 são muito divergentes no tamanho (70 kD e 160 kD, respectivamente), utilizam diferentes receptores para a entrada viral e não compartilham qualquer semelhança significativa. Portanto, peptidomiméticos que actuam sobre a proteína do envelope de HIV-1 para evitar a entrada do vírus não foram incluídos neste estudo. Alguns inibidores que são conhecidos por inibir a replicação de retrovírus do que outros vírus também foram avaliados. Um número significativo dos compostos testados no presente estudo, viz. 28 de um total de 45, estão já aprovados pela FDA para o tratamento de infecção com HIV-1 ou de outros vírus. Descrevemos aqui pela primeira vez que o inibidor de integrase, raltegravir (RAL), é extremamente potente e selectivo contra o XMRV, quando usado em baixas concentrações submicromolares em ambos os sistemas de cultura celular. Outro inibidor de NO, L-000870812, e dois NRTIs, AZT e tenofovir disoproxil fumarato (TDF), também inibem a replicação do XMRV, mas a concentrações mais elevadas. Quando combinados, estes compostos exibem efeitos sinérgicos, sugerindo modalidades combinadas para tratar a infecção XMRV, assim, retardar ou impedir a selecção de vírus resistentes.

Resultados

Nós testamos um total de 45 compostos pertencentes a diferentes classes de inibidores de VIH-1, e em alguns de outros inibidores de retrovírus, à sua capacidade para inibir a replicação do XMRV em células de cultura de vírus. células LNCaP e MCF-7 foram escolhidos por sua capacidade de suportar

in vitro

replicação robusta de XMRV. As células MCF-7, devido às suas melhores propriedades de crescimento em cultura foram inicialmente utilizados para testar todos os compostos 45 (Figura 1). Os compostos com actividade anti-XMRV foram subsequentemente testados em ambos LNCaP e células MCF-7 (Tabela S1). Para determinar se uma redução na libertação virai possa ser devido a toxicidade do composto e não devido a actividade anti-retroviral específica, morfologia celular foi monitorizado a cada 24 h por exame microscópico, e um MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difeniltetrazólio] ensaio colorimétrico foi utilizado para medir o potencial de citotoxicidade produzida pelos compostos. Os sobrenadantes foram recolhidos a cada 24 horas e ensaiadas quanto à libertação virai medindo a actividade de RT. A inibição da actividade de RT (ver Figura 2) foi uma média de mais de 6/3 experiências, cada uma realizada em duplicado, e utilizada para calcular a mediana (CE

50) e de 90% as concentrações eficazes (CE

90) para cada um dos compostos (Figura 1). Para fins de comparação, todos os compostos avaliados nestes estudos foram também testados contra o HIV-1

LAI em linfócitos humanos primários.

Todos os compostos foram avaliados em duplicado, pelo menos, três vezes. Os valores mostrados são uma média de ensaios replicados. * (4

S

) -8-cloro-4-metil-5- (3-metilbut-2-enil) -3,4,5,6-tetra-hidro-1H- [1], [3 ] diazepino [4,5,6-cd] indole-2 (2AH) -tiona.

Os inibidores de HIV-1 da transcriptase reversa

Os seguintes inibidores NRTI de HIV-1 RT foram testados nos ensaios de replicação XMRV: AZT, 3′-azido-3′-desoxiadenosina (AZA), 3′-azido-3′-desoxiguanosina (AZG), a 3′-azido-3′-desoxi-5-metil -citidina (CS-92), lamivudina (3TC), emtricitabina [(-) – FTC], tenofovir (TNV) e a sua forma de pró-fármaco TDF, 9- (β-D-1,3-dioxolan-4-il) guanina (DXG) e a sua forma pró-fármaco, amdoxovir (DAPD, AMDX), (-) – carbovir (CBV), estavudina (d4T) e o seu análogo de citosina correspondente (D4C), Videx (ddl), zalcitabina (ddC), e 3 ‘ -fluoro-3’-desoxitimidina (FLT). Também testámos o efavirenz NNRTIs, e um derivado de TIBO que foi demonstrado ser eficaz num sistema de murino [14]. Entre estes, os mais potentes inibidores XMRV foram AZT e TDF (Figura 2, A, B). A CE

50 e CE

90 em células MCF-7 foram de 0,11 uM e 7,3 uM para AZT, e 0,24 | iM e 15,3 uM para o TDF, respectivamente (ver Figura 1). A CE

50 e CE

90 valores foram também determinados em células LNCaP, uma linha celular de cancro da próstata, e não havia uma diferença consistente de até cinco vezes entre as duas linhas de células, o que pode estar relacionado com a sua diferindo as taxas de captação de nucleósido e de bioconversão para o análogo de nucleósido-trifosfato activa. A CE

50 e CE

90 em células LNCaP foram de 0,14 mM e 1,1 mM de ZDV, e 0,9 mM e 4,2 mM para TDF, respectivamente. CBV, AZA, FLT e D4T todos mostraram mais do que 70% de inibição da replicação do XMRV (ver Tabela S1), mas a concentração muito mais elevada de 100? M. AZG, CS-92, (-) – FTC, 3TC, ddI, DAPD e DXG eram essencialmente inactivo em 100 uM (Figura 1). TFV também foi ineficaz contra XMRV, provavelmente devido à sua natureza polar, o qual pode não permitir de fármaco suficiente para penetrar nas células. O efavirenz NNRTIs (EFV) e o derivado de TIBO, não demonstrou qualquer actividade contra a grande XMRV.

libertação viral a partir de células infectadas com LNCaP XMRV na presença de concentrações crescentes de (A) ZDV (B) TDF ( C) RAL e (D) G-000870812, foi determinada medindo a actividade de RT nos sobrenadantes. A percentagem de inibição foi calculada com base em células infectadas expostas a DMSO sozinho sendo definido como 0% de inibição, e células sem tratamento prévio, na ausência de quaisquer compostos definidos na inibição de 100%. A viabilidade das células foi verificada por microscopia, quantificada pelo ensaio de MTT, e representada por barras sombreadas. Os dados para cada composto foram derivados a partir de uma média de pelo menos três experiências independentes, cada uma realizada em duplicado.

Inibidores de VIH-1 integrase

inibidores raltegravir (RAL ou MK- 0518) e L-000870812 [15] também foram avaliados quanto à sua capacidade para inibir a XMRV nos dois sistemas de células (Figura 1, Figura 2 C e D). De todos os compostos testados, RAL foi o mais potente, com uma CE

50 de 0,005 ^ M e uma CE

90 de 3,5 uM em células MCF-7, e uma CE

50 de 0,03 jiM e uma CE

90 de 0,46 M em células LNCaP (Tabela S1). L-000870812, mostraram actividade contra a replicação do XMRV em concentrações consideravelmente mais elevadas, com uma CE

50 e CE

90 de 0,16 micron e 26,9 uM em células MCF-7, e 0,7 uM e 4,5 uM em células LNCaP, respectivamente .

Os inibidores da protease HIV-1

Nove conhecidos de HIV-1 IPs foram avaliados quanto a actividade contra o XMRV (Figura 1). O mais eficaz foi nelfinavir, embora com um EC

50 de 34,3 mM. A seguir PIs tinham actividades muito modestos anti-XMRV: atazanavir (CE

50 de 64,8 mM), amprenavir (CE

50 de 68,0 mM), lopinavir (CE

50 de 72,2 mM) e ritonavir ( CE

50 de 76,4 mM). Darunavir, indinavir, saquinavir e tipranavir eram essencialmente ineficaz contra XMRV

in vitro

, quando testado até 100 mM.

Inibidores de outros vírus do que o HIV-1 |

A escolha número de agentes antivirais que inibem a outros retrovírus que vírus também foram avaliados. Estes incluíram a drogas anti-herpética aciclovir (ACV), o ganciclovir (GCV), vidarabina (ara-A), 5-iodo-2′-desoxiuridina (IdUrd), penciclovir (PCV), foscarnet (PFA), VISTIDE (HPMPC) ; as drogas anti-hepatite entecavir (ETV), a telbivudina (LDT) e ribavirina (RBV). ETV também foi selecionado porque ele foi recentemente relatado para inibir a replicação do HIV-1, ambos

in vitro Comprar e em seres humanos [16]. Outros compostos reivindicados para ser eficaz contra o XMRV, MLV, o HIV-1 e de outros vírus, tais como a cloroquina [17], a dehidroepiandrosterona (DHEA) [18], azul de metileno e aspirina foram também avaliados quanto à actividade anti-XMRV

in vitro

. O azul de metileno é conhecido por ter actividade anti-herpética e também podem inactivar o VIH-1 [19]. Infelizmente, a maioria dos compostos listados acima, excepto IdUrd foram ineficazes contra XMRV, ou foram eficazes em concentrações tóxicas (Figura 1). IdUrd demonstrou um baixo índice terapêutico (TI, a proporção de CC

50 /CE

50) e não pode ser considerado como um agente antiviral específica contra XMRV.

efeitos da combinação de compostos activos sobre a replicação XMRV

combinações binárias dos compostos mais potentes, viz. RAL, L-000870812, TDF e ZDV foram testados para a actividade contra o XMRV em células LNCaP. Os compostos foram testados em concentrações crescentes, em três diferentes conjuntos, com a razão entre os dois compostos mantida constante. Os dados foram analisados ​​utilizando o método originalmente descrito por CalcuSyn Chou e Talalay [20]. Um resumo dos resultados para todas as combinações avaliadas em células LNCaP é apresentado na Figura 3.

Índice de combinação (IC) de valores foram determinados para uma interacção mutuamente exclusivos utilizando o programa CalcuSyn, onde CI 1 indica sinergismo, IC = 1 indica efeito aditivo e CI 1 indica antagonismo. Ponderada do valor CI média (CI

wt) foi designado como [CI

50 + 2CI

75 + 3CI

90 + 4ci

95] /10. RAL, raltegravir; TDF, tenofovir disoproxil fumarato; . ZDV, zidovudina

Para as combinações testadas (RAL com TDF ou ZDV ou L-000870812; TDF com ZDV ou L-000870812; L-000870812 com ZDV), um aditivo ou interacção sinérgica na sua maioria era observado em todos os níveis, sem efeito aparente citotoxicidade nas concentrações mais elevadas utilizadas. Na análise computacional para qualquer um dos quatro medicamentos (RAL, TDF, L-000870812, ou ZDV), o coeficiente de correlação linear (

valores r

) da trama do efeito mediano ou para suas combinações relação constante entre 0,92 e 0,99 (dados não mostrados), correspondentes a lei de acção de massas. O

in vitro

efeito da combinação de RAL com qualquer TDF ou ZDV, mostrou uma redução da dose favorável em qualquer proporção. Além disso, todos os Index (Cl) valores de combinação (ver Materiais e Métodos) eram menos do que 1, o que sugere sinergia quando as proporções de combinação de qualquer um ou TDF e ZDV RAL foram analisados ​​(Figura 3). Além disso, combinações duplas de ambos ZDV e L-000870812 ou TDF também foram testados. Os valores de IC ponderada (IC

em peso) de 0,1 a 0,5 para o TDF + ZDV, indicado efeitos sinérgicos em todas as proporções testadas (Figura 3). Além disso, a combinação dupla de L-000870812 e o AZT na proporção 01:02 indicou um efeito quase aditivo (IC

em peso de 1,0); No entanto a proporção de 1:0.4, o valor de CI foi de 0,3, indicando sinergismo (Figura 3). De significância foi de que todas as combinações duplas contendo RAL, o agente antiviral mais potente contra o XMRV, demonstrou sinergia acentuada em todos os níveis de efeito sem qualquer citotoxicidade aparente. Curiosamente, a combinação dos dois em inibidores não foi antagonista ou aditivo, mas verificou-se ser sinérgica, o que sugere que estes dois compostos podem ter diferentes mecanismos antivirais (ver discussão).

Discussão

na ausência de uma etiologia clara, o tratamento de SFC tem sido tanto empírica e não convencionais. Terapias incluíram terapia imunoestimulante através de injecções de Staphylococcus toxóide [21], a terapia de imunoglobulina intravenosa [22] [23], [24], e hidrocortisona [25], cada um com resultados irregulares. Interferon-β e inibidores de TNF-α foram julgados em um pequeno número de pacientes. Anti-depressivos, AINEs, fármacos ansiolíticos, estimulantes, fármacos anti-alérgicos e anti-hipotensivos foram todos usados, mas não são universalmente benéfico [26]. A falta de uma terapia eficaz tem levado ao uso de extratos de plantas [27], a homeopatia [28], [29], a hipnose [30], a acupuntura [31], e todo o corpo de aceleração periódica estresse [32], nenhum com benefícios sustentados. As únicas modalidades de tratamento que tenham quaisquer benefícios comprovados são programas de terapia cognitivo-comportamental e de esforço progressivo, sendo que ambos aparecem para ajudar, melhorando habilidades de enfrentamento em vez de reduzir os sintomas [33]. Se, XMRV prova ter uma associação causal com a doença humana, então o conhecimento de que certos agentes anti-retrovirais inibem o XMRV em concentrações submicromolares

in vitro

, e têm efeitos sinérgicos quando combinados, conforme demonstrado neste estudo, pode levar a testes clínicos. Descobrimos que RAL, L-000870812, AZT, e TDF inibir fortemente XMRV em cultura de células, com RAL sendo o mais potente, numa CE

50 de 0,005 uM, e outros, tais como L-000870812 (CE

50 = 0,16? M), AZT (CE

50 = 0,11? M) e TDF (CE

50 = 0,24 ^ M), sendo bastante eficazes bem. Além disso, estes compostos tiveram índices terapêuticos elevados, com valores para ZDV = 591; TDF = 218; RAL = 18.460 e L-000870812 = 378, indicando que ele deve ser possível atingir níveis antivirais terapêuticas com o mínimo de toxicidade.

Vários compostos que nós avaliados tiveram um efeito limitado sobre a replicação XMRV

in vitro

. Alguns desses efeitos podem ser explicados por mecanismos actualmente compreendidas. Por exemplo, tanto o 3TC e (-) – FTC precisa de um motivo YMDD funcional em RT para ser activa. A mutação M184V em RT HIV-1 faz com que o vírus resistentes a 3TC e (-) – FTC [34]. Estes fármacos são ineficazes contra MoMLV, porque em MoMLV RT, V é o resíduo natural nesta motivo em lugar de M. Da mesma forma, V é também o resíduo natural nesta localização em XMRV RT, tornando 3TC e (-) – FTC ineficaz. Porque nenhum dos IPs do VIH-1 foram eficazes contra o XMRV (a conclusão de que foi reportado para os IPs seleccionado antes [13]) permanece pouco claro neste momento, mas pode estar relacionado com o tamanho da bolsa PI, bem como outros bioquímica e factores estruturais.

Houve uma diferença nas actividades dos compostos quando testados em diferentes tipos de células, o que pode estar relacionado com a absorção de drogas por células, os diferentes níveis de dNTP natural nas células, assim como diferente fosforilação intracelular capacidade [35]. Em geral, a CE

50 para os compostos activos listados acima foram mais baixos em células MCF-7 de células LNCaP, sugerindo uma maior potência. Em relação ao HIV-1, os compostos eram em geral menos potente contra XMRV do que o HIV-1, especialmente na CE

90 nível.

O uso de monoterapia para tratar infecções de HIV tem levado ao aparecimento de droga vírus resistentes [36], [37]. A constatação de que RAL, L-000870812, TDF e ZDV têm fortes efeitos sinérgicos quando combinada em combinação dupla é um bom augúrio para a terapia de combinação em caso de infecção XMRV. Se paralelos infecção XMRV outras infecções retrovirais, então o uso de terapia antirretroviral combinada pode manter a supressão XMRV, evitar o surgimento de resistência aos agentes anti-retrovirais e possivelmente também causar melhora da doença. No caso do HIV-1, a terapia de combinação funciona especialmente bem quando as drogas combinadas têm alvos de proteínas virais diferentes, ou no caso de nucleósidos, utilizam diferentes quinases para a sua activação para análogos de NTP [31]. Nós, portanto, criteriosamente selecionados combinações de medicamentos que inibem o XMRV, como RAL com ZDV ou TDF ou L-000870812. Quando os dados foram analisados ​​utilizando o método de Chou e robusta Talalay, aditivo ou interacções sinérgicas foram encontrados em todos os níveis de efeito quando estes agentes foram testados em células LNCaP. De importância é que nenhum antagonismo foi observado para qualquer uma das combinações avaliadas nestas células. Para nossa surpresa, mesmo os dois em inibidores exibido um efeito sinérgico. Tanto no inibidores actuam através da inibição da reacção de transferência de cadeia, mas se o seu mecanismo de acção pode ser idêntico, eles exibem um efeito aditivo na combinação. Um efeito sinérgico sugere que pode haver diferenças sutis mecanicistas nas ações de estes dois em inibidores, uma descoberta que é corroborado por experiências bioquímicas inéditos (comunicação pessoal, Dr. Daria Hazuda, Merck Research Laboratories, West Point, PA). É importante observar aqui, que XMRV difere do HIV-1 em um aspecto que é significativa para estes estudos: XMRV isolados mostram diversidade de sequências muito limitado em comparação com o VIH-1 ou de MLV. De todos os XMRV sequenciado isolados que existem actualmente, tanto a partir de casos de cancro da próstata, bem como CFS, obtidos a partir de partes geograficamente distantes dos Estados Unidos, os dois genomas menos relacionados diferem uns dos outros em apenas 27 de um total de mais de 8100 nucleótidos. Um grau semelhante de diversidade genética limitada foi encontrado para HTLV-1 [38], um outro retrovírus implicado em ambos câncer e doenças neuroimmune. Tem sido sugerido que esta falta de diversidade em sequências XMRV implica que o número de ciclos de replicação dentro de um indivíduo infectado é limitada [39]. Isto sugeriria que o XMRV tem um potencial consideravelmente menor para o desenvolvimento de mutações resistentes a drogas, como comparado com o HIV-1. Além disso, é provável que uma combinação de apenas duas drogas pode ser suficiente para impedir o aparecimento de vírus mutante resistente a drogas, embora esta situação teria de ser testado antes de quaisquer indicações terapêuticas pode ser feito. Nós tentamos selecionar para vírus resistentes RAL em cultura por vários meses, e ainda não foi bem sucedido em isolar vírus resistentes aos medicamentos.

Quando um ensaio para medir a carga viral se torna XMRV, níveis de vírus disponíveis no sangue pode tornar-se um marcador substituto objetivo para uma resposta eficaz aos medicamentos antivirais, além de resultados clínicos. Embora ainda não está claro se todas as doenças são causadas diretamente pelo XMRV, nossos dados indicam que as infecções XMRV pode ser prevenida ou tratada com agentes antivirais específicos. Na presença de qualquer evidência de causalidade das doenças humanas, nossos achados devem servir de base para a concepção de ensaios clínicos para tratá-los.

Materiais e Métodos

XMRV, células e infecção por XMRV

células 293T (ATCC, CRL-11268) foram transfectadas com pXMRV1, um clone infeccioso de XMRV [2]. Vírus libertado no sobrenadante foi colhido e titulado por inoculação de células MCF-7, uma linha celular de cancro da mama (ATCC, HTB-22) a 70% de confluência, com uma série de diluições de dez vezes de XMRV em meio isento de soro, seguido 36-48 horas mais tarde por fixação das células em paraformaldeído e processamento de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho desenvolvido contra inactivado XMRV [2]. preparações de vírus típicos deu títulos de cerca de 2-5 × 10

6 unidades infecciosas /ml. O vírus foi diluído num meio isento de soro e usado para inocular as células, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de aproximadamente 3, na presença de vários compostos anti-virais, tal como descrito abaixo. LNCaP, uma linha celular de cancro da próstata (ATCC, CRL-1740) e células MCF-7 foram cultivadas até cerca de 50% de confluência em DMEM contendo 10% de soro de fetal de bovino inactivado, 100 ug /ml de penicilina, e 100 UI /ml de estreptomicina. As células foram lavadas duas vezes com salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS, Gibco), e incubadas com o inoculo virai durante 90 min a 37 ° C na presença de 95% de ar e 5% de CO

2, as células foram lavadas duas vezes com DPBS , individual com tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%; Cellgro), e contados. Mil células foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços, em conjunto com um volume igual de meio contendo o inibidor retroviral em duas vezes a concentração desejada. Os inibidores foram dissolvidos em DMSO e água, dependendo da sua solubilidade, e foram todos testados a 0,01 a 100 uM em incrementos de 10 vezes. Quando foi encontrado o medicamento para ser activo na concentração de 0,01 | iM, outras diluições de 1 nM a 0,01 nM foram testados. Cada inibidor foi testada em duplicado, um mínimo de três vezes separadas em células MCF-7 de uma forma completamente cego usando compostos codificados, e a média dos resultados. Os compostos activos também foram avaliados quanto à actividade antiviral em células LNCaP para confirmar a actividade de uma linha celular secundária conhecida para suportar a replicação XMRV. Para os controlos, foram utilizados poços contendo água ou DMSO em concentrações adequadas.

Os ensaios para a replicação citotoxicidade e XMRV

Cada poço foi cuidadosamente monitorizados para sinais de toxicidade celular devido aos inibidores por observação microscópica cada 24 h. Além disso, a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de proliferação celular CellTiter 96 One Solution aquosa de acordo com o fabricante (Promega, Madison, Wisconsin). libertação viral a partir de células foi ensaiada medindo a actividade de RT no sobrenadante. Para isso, o sobrenadante de cada poço foi recolhido a cada 24 horas e congelados a -20 ° C, até que foi analisada por ensaio de RT para a libertação virai, tal como descrito anteriormente [40]. Em breve, oligo (dT) · poli (rA) ensaios de iniciador-molde foram realizadas na presença de marcado radioactivamente [α-

32P] dTTP e Mn

2+. Após incubação os sobrenadantes virais com a mistura reaccional TA durante 1 h a 37 ° C, as amostras foram manchados em DE81 DEAE papel de celulose (Whatman) e marcador não incorporado lavados com 2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M de NaCl e 0,015 M de sódio citrato). -Virião associadas RT foi analisada utilizando um PhosphorImager Typhoon 9410 (GE Healthcare) e quantificada com o programa Image J (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Inibição da libertação viral, como medido no dia 6 após a inoculação foi em média mais de 3-5 experiências e representados graficamente. O antiviral CE

50 e as concentrações citotóxicas (CC

50), foi determinada a partir da curva de concentração-resposta utilizando o método de efeito mediano [20]. HIV-1 Os ensaios de replicação foram realizados como descrito anteriormente usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) obtidas a partir da American Red Cross, Atlanta, GA, que foram estimuladas com fito-hemaglutinina (PHA) durante 72 horas [41].

os estudos de associações

Para avaliar se os efeitos antivirais de combinações duplas de drogas de: RAL com TDF ou ZDV ou L-000870812; TDF com ZDV ou L-000870812; L-000870812 com ZDV eram sinérgico, aditivo ou antagonista, foram avaliadas combinações de drogas em várias proporções constantes. RAL, L-000870812, ZDV e TDF foram testados isoladamente para determinar a CE

50 e CE

90 valores, pelo menos três vezes, cada uma em duplicado. Para a análise do efeito mediano, os compostos foram combinados em várias razões com base em múltiplos da sua CE

50 ou CE

90 valores. Para cada droga (por si só ou em combinação), de três a quatro experiências independentes e foram realizadas todas as amostras foram processadas em duplicado. A análise foi realizada usando o software CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, EUA) (ver Figura 3 para valores CI), que permite automatizado simulação de sinergismo e antagonismo em todos os níveis de dose e efeito e exibe os métodos de Chou e Talalay [20] , incluindo lote efeito mediana e valores de IC. Porque os efeitos elevada são mais terapeuticamente relevante do que o baixo grau de efeitos, foi calculada a CI média ponderada adicional (IC

em peso), que utiliza a fórmula: Cl

em peso = [IC

50 + 2CI

75 + 3CI

90 + 4ci

95] /10, onde o IC

50, IC

75, IC

90, CI

95 são os valores de IC a 50 %, 75%, 90% e 95% de inibição, respectivamente. [20], [42].

Informações de Apoio

Tabela S1.

EC50, EC90 e CC50 valores de compostos activos contra XMRV em células MCF-7, como testado em células infectadas com LNCaP XMRV. Compostos verificou ter actividade significativa em células MCF-7 foram testadas em células LNCaP de actividade. Todos os compostos foram avaliados em duplicado, pelo menos, três vezes. Os valores mostrados são uma média de ensaios replicados. Os valores correspondentes em células MCF-7 são mostrados para comparação

doi:. 10.1371 /journal.pone.0009948.s001

(0,11 MB TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Mervi Detorio e Melissa Johns por sua excelente assistência técnica, e Daniel Choe e Robert Schlaberg por sua ajuda com experiências preliminares.