Sumário

exossomas são vesículas ligadas à membrana secretadas 30-150nM que são facilmente isolados a partir de fluidos biológicos, tais como urina (UES). Exossomos contêm proteínas, micro RNA (miRNA), RNA mensageiro (mRNA), e longo RNA não-codificante (lncRNA) de suas células de origem. Embora miARN, proteína e lncRNA foram isolados a partir do soro como potenciais marcadores para a doença benigna e maligna, não se sabe se lncRNAs em UEs de cancro da bexiga urotelial (UBC) pacientes podem servir como biomarcadores. lncRNAs estão 200 nucleótidos de comprimento transcritos que não codificam proteínas e desempenham papéis críticos na biologia do tumor. À medida que o número de lncRNAs associados a tumores reconhecidos continua a aumentar, há uma necessidade para incluir paralelo lncRNAs na descoberta de biomarcadores e algoritmos alvo terapêutico. O lncRNA HOX transcrito de ARN anti-sentido (HOTAIR) foi mostrado para facilitar a iniciação e progressão do tumor e é associado com prognóstico pobre em vários cancros. A importância da HOTAIR na biologia do câncer despertou o interesse em usar HOTAIR como um biomarcador e alvo terapêutico potencial. Aqui mostramos HOTAIR e vários lncRNAs associados a tumores são enriquecidos em UEs de UBC pacientes com doença músculo-invasivo de elevado grau (HGMI pT2-pT4). Knockdown de HOTAIR em linhas celulares UBC reduz

in vitro

migração e invasão. Importante, a perda de expressão em linhas celulares HOTAIR UBC altera a expressão de genes epitelial para mesênquima transição (EMT) incluindo SNAI1, TWIST1, ZEB1, ZO1, MMP1 LAMB3, e LAMC2. Finalmente, usamos RNA-sequenciamento para identificar quatro lncRNAs adicionais enriquecidas em UEs paciente UBC. Estes dados sugerem que lncRNA UE-derivada pode potencialmente servir como biomarcadores e alvos terapêuticos

Citation:. Berrondo C, Linho J, Kucherov V, Siebert A, Osinski T, Rosenberg A, et al. (2016) Expressão da Longo RNA não codificante HOTAIR se correlaciona com a progressão da doença em cancro de bexiga e está contido no cancro da bexiga de pacientes exossomas urinário. PLoS ONE 11 (1): e0147236. doi: 10.1371 /journal.pone.0147236

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 12 de outubro de 2015; Aceito: 30 de dezembro de 2015; Publicação: 22 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Berrondo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. CTSI na Universidade de Rochester 5UL1TR000042-09

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

lncRNAs, são transcrições que são 5 ‘7-metilguanosina cobertas e quer poli-adenilada ou unadenylated e são 200 nucleotídeos de comprimento. Uma vez que o ruído genômica considerada, lncRNA estão provando ser importantes mediadores de processos celulares normais, incluindo, imprinting de desenvolvimento, compensação de dose, e diferenciação celular, bem como funções dentro de células maduras, tais como controle de splicing e regulação hormonal [1,2]. A desregulação da expressão lncRNA foi mostrado ser importante nos processos malignos, tais como a progressão do tumor [3-6].

Com o advento da ampla-transcriptoma ARN-sequenciação (ARN-SEQ) a descoberta de lncRNAs aumentou significativamente. Recentemente, Iyer

et al

aplicada

ab initio

montagem para bibliotecas de RNA-seqüenciamento (RNA-seq) de vários tumores para revelar milhares de linhagem e lncRNAs associados ao câncer ressaltando a importância de incluir lncRNA em biomarcadores e algoritmos de descoberta alvo terapêutico [7].

Uma excelente fonte para a descoberta de biomarcador é exossomos. Os exossomas são secretadas 30-150nM vesículas ligadas à membrana, que são prontamente purificadas a partir de meios de cultura e fluidos biológicos, incluindo soro, fluido de ascites e de urina (UEs) [8-14]. Exossomos participar na comunicação intercelular através da apresentação de proteínas, miRNA, mRNA, e lncRNA para as células receptoras [15,16].

Há evidências emergentes de que a embalagem transcrição em exossomos não é estocástica e pode contar com motivos de assinatura e secundário estrutura. [17-20]. Além disso, a sinalização oncogénica tais como KRAS resultados em empacotamento selectivo de miARN em exossomas, indicando que a transformação celular pode gerar um perfil específico exossomo-cancro que podem servir como biomarcadores [21].

Notavelmente, as comparações quantitativas de células produtoras contra exossomas mostram que exossomas são marcadamente empobrecido em ARNm, mas enriquecida em lncRNA [18-20]. Além disso, lncRNAs mostrar uma maior especificidade do que o ARNm de codificação de proteínas como biomarcadores de cancro [22]. Dado lncRNA é enriquecida em exossomas e exibem especificidade para o cancro que são candidatos atractivos para a descoberta de biomarcador.

Vários grupos têm demonstrado que miARN, mRNA e proteína em (SES), derivados do soro e urinários exossomas (UEs) pode servir biomarcadores para a doença, tanto benignas e malignas [23-36]. Por exemplo, nós previamente identificado, crescimento epidérmico repete fator-like e domínios I-like discoidin (EDIL-3) proteína 3 em exossomos de cancro da bexiga urothelial (UBC) linhas celulares e UEs isoladas de pacientes UBC com tumores invasivos musculares de alta qualidade (HGMI pT2-pT4) [34,37].

próstata e lncRNAs UBC associados foram isolados a partir de células anuladas ou flutuação livre na urina, e vários grupos identificaram lncRNA na UE a partir de pacientes com câncer de próstata [28, 38,39]. No entanto, não há estudos publicados demonstraram que lncRNAs UBC UE-derivadas podem servir como biomarcadores [28,38,39]. Uma vantagem de usar UEs é que a membrana exossomo protege o conteúdo de proteases e ARNases, que são ubíquas na urina [40]. Estudos recentes têm demonstrado que os tumores primários UBC conter lncRNA única, portanto, buscou-se captar tais lncRNA em UE de pacientes com a doença UBC HGMI [7]. Um importante membro da classe de lncRNAs associado a um tumor é HOTAIR, que é sobre-expressa, por tanto como 2000 vezes em tumores de doentes com cancro da mama em comparação com o tecido normal [3]. HOTAIR sobre-expressão também está associada com o aumento da capacidade de invasão e de prognóstico reservado [3,41]. Importante, HOTAIR tem sido demonstrado que regulam vários genes envolvidos na epitelial para mesênquima transição (EMT) incluindo caracol de dedo de zinco da família 1 (SNAI1), laminina, beta 3 (LAMB3), laminina, gama 2 (LAMC2), molécula de adesão juncional 2 (JAM2) e ABL proto-oncogene 2 (ABL2) [3,42-44].

a importância da HOTAIR na UBC está começando a vir à luz através de vários estudos recentes. Por exemplo, Yan

et al

. demonstraram que a expressão elevada de reincidência HOTAIR prevê invasiva não-muscular de grau elevado UBC (NMIBC) [45]. Eles também tocaram

In vitro

estudos que mostram que HOTAIR está envolvida na migração e invasão e repressão da proteína antagonista via canônica Wnt WIF-1 [45].

Martinez-Fernandez

et al

. investigada a possibilidade de que a expressão HOTAIR poderia servir como um marcador de prognóstico para a recorrência da doença em NMIBC [46]. Eles demonstraram que os doentes com níveis mais elevados de expressão HOTAIR também tinha anteriormente recorrência da doença. Além disso, eles mostraram que Enhancer de Zeste 2 Polycomb repressiva Complex 2 Subunidade (EZH2) regula a expressão de HOTAIR. Finalmente, eles usaram A Genomic Atlas Câncer (TCGA) conjunto de dados para o cancro da bexiga para mostrar que a expressão HOTAIR está correlacionada com a fase da UBC com os tumores T4 mais invasivos que têm o mais alto nível de expressão HOTAIR.

Em outro estudo , Sun

et al

. demonstraram que o miR-205 é importante para a inibição da proliferação, migração e invasão de linhas celulares de UBC. Eles identificaram a-ciclo celular ciclina regulação do gene J (CCNJ) como um novo alvo para miR-205. Importante, eles mostraram que HOTAIR participa do silenciamento de miR-205 expressão em células UBC através da regulação epigenética [47].

Em conjunto, estes estudos demonstram HOTAIR desempenha um papel crítico na UBC. Dada a importância da HOTAIR na progressão do tumor, existe um interesse crescente na utilização de HOTAIR como um biomarcador, bem como um alvo terapêutico em cancros nos quais é expresso de forma aberrante HOTAIR [2,48,49]. Importante, ter uma forma não-invasiva para detectar HOTAIR em pacientes com câncer, como UEs, seria ideal para o desenvolvimento de biomarcadores [15,16,23].

Aqui, nós expandir o escopo do envolvimento HOTAIR na UBC biologia. Por exemplo, identificamos fatores EMT adicionais que são afetados pela expressão de HOTAIR. Criticamente mostramos HOTAIR e outros lncRNA incluindo associada ao tumor lncRNAs HOXA conjunto antisense RNA 2 (HOX-AS-2), Antisense não-codificante RNA no

INK4

loco (ANRIL), longa intergênico RNA Regulador de Reprogramação (Linc-ROR), são sobre-expresso em linhas celulares de UBC e é enriquecida em exossomas isolados a partir de linhas celulares de UBC. Também mostram que HOTAIR, HOX-AS-2, metástase-associado transcrito de um adenocarcinoma do pulmão (MALAT1), e lincRoR são sobre-expressos em tumores e enriquecido em UEs a partir de pacientes com doença de UBC HGMI (pT2-pT4 em patologia cistectomia final). É importante ressaltar que usamos RNA-seq para identificar lncRNAs adicionais e novos enriquecidas em UEs de pacientes com HGMI (pT2-pT4) UBC em comparação com voluntários saudáveis. Encontramos quatro desses lncRNAs; Mola hidatiforme associado e imprimiu codificação de RNA 1 (HYMA1), intergênico longo de codificação RNA 477 (LINC00477) não proteico, LOC 100506688, Orthodenticle homeobox 2 antisense RNA 1 (OTX2-AS1)

Materiais e Métodos não proteico

pacientes e Voluntários

Este estudo foi aprovado pela Research Assuntos Review Board da Universidade de Rochester Medical Center (número de aprovação RSRB IRB # 46706). doentes sem tratamento prévio de quimioterapia submetidos cystectomy para a doença HG (Final cistectomia patologia pT2-pT4) foram incluídos neste estudo. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes, e mantidos em arquivos seguros por regulamentos RSRB. Os dados da pesquisa foram codificados para garantir que os indivíduos não puderam ser identificados, directamente ou através de identificadores associados, de acordo com o Departamento de Saúde e Serviços Humanos regulamentos para a protecção dos seres humanos (45 CFR 46,101 (b)). números de identificação sujeitos também foram recodificados para publicação. Foram coletadas urina, tumores e tecidos normais distai (DNT) a partir de pacientes. O tecido foi obtido a partir de patologia em blocos de parafina e fixado em formalina incorporados (FFPE). O tecido foi corado com hematoxilina e eosina para determinar o tecido que possui o tumor e DNT (pelo menos 3 cm de distância a partir do tumor, conforme medido por um patologista independente). Os voluntários eram saudáveis ​​18+ anos de idade, sem história de doença urológica.

RNA-Sequenciamento e Análise de Dados

quantidade de ARN foi determinada utilizando um espectrofotômetro NanoDrop e qualidade foi determinada com um Agilent Bioanalyzer, usando o ensaio de Pico. ARN de controlo de qualidade, a preparação da biblioteca e a sequenciação foi realizada pela Universidade de Rochester Genomics Research Center (GRC), utilizando bibliotecas de cDNA ribo-empobrecido gerados pelo kit de ARN TruSeq V2 (Ilumina). cDNA foi fragmentado, com código de barras com adaptadores Illumina-fabricados, e PCR amplificado. Ilumina HiSeq2500 foi usada para high-throughput ARN-A sequenciação. Vinte milhões de 125 pb par-ended lê foram obtidos /amostra

Para o processamento de dados NSG.; raw 125 pb lê foram de-mutiplexed. Baixa complexidade lê e contaminação do vector foram removidos. O kit de ferramentas FASTX (fast_quality_trimmer) foi usado para remover bases com índices de qualidade abaixo Q = 13 e alinhados ao genoma humano versão do assembly hg19 /GRCh37 usando Burrows-Wheeler alinhador com as configurações padrão. Ler as contagens foram gerados com HTSeq e abotoaduras /Tophat foi usada para análise de expressão diferencial [50]

Linhas Celulares

BC linhas celulares utilizados:. SV-HUC, 5637, TCC-SUP, T24 , UMUC3, HT1376, J82, e RT4, obtida a partir de ATCC. células HEK293 que foram usadas para a embalagem viral. As células foram cultivadas em meios apropriados e de acordo com as directrizes da ATCC. identidade da linha celular UBC foi geneticamente validado pela DDC Medical

shHOTAIR e shScramble clones estáveis ​​

HEK293 células foram transfectadas com plasmídeos:. pSPAX2, pMD2G e GFP-expressando shRNA HOTAIR (shHOTAIR) ou Scramble controle (shScramble) constrói lentiviral vetor, que estavam presentes generosos de Sistemas BioScience (mountain View, CA). células T24 TCC-SUP e foram infectados com shHOTAIR ou lentivírus shScramble e selecionados por puromicina (2 ug /ml) e separadas por FACS. Knockdown de HOTAIR foi confirmada por qRT-PCR.

siARN

T24 células foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma concentração de 6×10

4 células /poço, e incubou-se durante a noite. Incubação e transfecção de siRNA usando DharmaFECT 1 reagente (GE Life Sciences, Dharmacon) foi realizada de acordo com o protocolo de fabrica. Especificamente, para cada poço, foram utilizados 2.5μL de 5mM siRNA e 1.37μL de DharmaFECT 1 reagente (GE Life Sciences Dharmacon). O siRNA utilizados foram publicados anteriormente: siHOTAIR (siRNA-1 UAACAAGACCAGAGAGCUGUU; siRNA-2 CCACAUGAACGCCCAGAGAUU); e controlar siGFP (CUACAACAGCCACAACGUCdTdT.) foi obtido a partir GE Life Sciences Dharmacon [51].

exossomo Elaboração e Análise de Rastreamento

linhas de células produtoras de exossomo TCC-SUP e T24 foram cultivadas em Bioflasks como acordo com as recomendações do fabricante (linha de células 1000AD) no meio de cultura apropriado suplementado com FBS 10% livre de exossoma (EF-FBS). EF-FBS foi preparada por ultracentrifugação a 100,000 x g a 4 ° C durante 18 horas.

exossomas foram colhidas por centrifugação e ultracentrifugação em série como descrito anteriormente [34,52]. exossomo proteína foi quantificada utilizando um kit de MicroBCA (Pierce) e análise de partícula foi realizada utilizando o sistema de caracterização de nanopartículas LM10 (NanoSight) equipado com o laser azul 488.

cicatrização de feridas, bem Trans-3D e invasão Ensaios

Um ensaio de cicatrização foi usado para a migração avaliada [53]. As feridas foram medidas no momento zero, apenas depois de fazer a ferida e quatro mais tarde. o fechamento da ferida foi medida utilizando o software ImageJ.

Um ensaio de trans poços foi usado para determinar a invasão como descrito anteriormente com modificações [54]. 1 × 10

5 células em meio basal foram adicionados a 8um poros inserções trans poços (Corning Inc.) pré-revestidas com reduzida do fator de crescimento Cultrex (Trevigen Inc). Inserções foram colhidas, fixadas e coradas com 1% de azul de toluidina, fotografado, ea área total de células coradas de azul foi calculado usando o recurso de análise de partículas de software ImageJ.

Para a análise invasão 3D, 1325 células /190 ul foram semeadas em mictrotissue 3D

® placas (Sigma) no dia 0 [55,56]. Após a formação esferóide, o meio foi substituído com extrato de membrana basal (BME) (Cultrex). imagens esferóides foram feitas usando ProgRes

® CapturePro 2.7.7 (Jenoptik) visto com Axio observador A1 microscópio (Zeiss). Invasion foi medido como comprimento e número de saliências na mídia usando ImageJ.

Western Blot Analysis

Para 20ug Western blot de exosome ou ligado de células de proteína foram analisados ​​por 10% SDS-PAGE. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de MicroBCA (Pierce) de acordo com as recomendações do fabricante. Alix (3A9) (Cell Signaling Technology, Cat # 2171, diluição 1: 1000), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Cat # SC-32233, diluição 1: 200), Caracol (C15D3) (Cell Signaling Technology, Cat # 3879, diluição de 1: 1000), ZEB1 (H-102) (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: SC-25388, 1: 200 de diluição), e beta-tubulina (Cell Signaling Technology, Cat # 2128, diluição de 1: 1000). IgG-peroxidase de rábano, peroxidase de cabra anti-IgG de rábano e anti-IgG de ratinho-peroxidase de rábano anti-coelho foram utilizados como anticorpos secundários (Santa Cruz Biotechnology). detecção quimioluminescente foi realizada usando Super Signal Oeste Femto sensibilidade máxima de substrato (Thermo Scientific) de acordo com as recomendações do fabricante. captura de imagem foi realizada utilizando um sistema de imagem ChemiDoc (Bio-Rad).

Imunofluorescência

Para imunofluorescência de células shHOTAIR e shScramble TCC-sup, foram fixados em paraformaldeído a 4% e bloqueada em 0,5% soro normal de cabra em PBST (0,3% de Triton X-100 em PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram incubadas em ZEB1 (H-102) anticorpo (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: SC-25388, diluição 1:50 em PBST) durante a noite a 4 ° C, lavadas três vezes com PBS, depois incubadas com o anticorpo secundário de cabra anti- IgG de coelho (H + L) Alexa Fluor

® 594 conjugado durante 2 horas à temperatura ambiente (Thermo Scientific Catalog # 11012: a-, diluição 1: 200 em PBST). Após três lavagens em PBS, as células coradas foram colocadas em Vectashield HardSet Antifade Meio de Montagem com DAPI. imaging ICC:

As células foram coradas e processados ​​simultaneamente. As células foram fotografadas usando uma varredura a laser microscópio confocal FV1000 Olympus com uma objectiva de 20x no recurso compartilhado Microscopia URSMD Luz. regulações de laser e de tensão foram ajustados de tal modo que os níveis de intensidade de DAPI e Alexa 594 expressão estavam dentro da gama linear para as todas as imagens e as configurações permaneceu idêntica para todas as imagens. Ganhar e compensados ​​foram ajustados para a imagem controle inicial e, posteriormente, utilizado para todas as imagens. foram usados ​​uma proporção de 1024 x 1024 e uma média de 2 Kalman. Todas as configurações eram idênticas para todos os quatro grupos. Os padrões publicados neste manuscrito foram reproduzidas em duas experiências separadas e os dados representam o resultado reprodutível de tratamentos e coloração para estas proteínas.

Electron microscopia

5 ul da preparação exosome foi colocado em 200 malha grades de cobre revestido com formvar /carbono e incubados 1-2 minutos. As grades foram coradas com 20 ul de ácido fosfotúngstico 2,0% (pH 6,5) e deixou-se secar. A Hitachi 7650 Microscópio Eletrônico de Transmissão de 80 kV foi utilizada para visualizar amostras. eletromicrografias representativas foram captadas com uma Gatan Erlangshen câmera digital de 11 megapixels.

preparação de RNA

A urina foi coletada de pacientes HG na sala de operação após a indução da anestesia geral. A urina foi coletada de voluntários saudáveis ​​em ambulatórios. A urina foi processado imediatamente para a remoção de detritos celulares e grandes vesículas extracelulares por série de baixa velocidade e centrifugação de alta velocidade [40]. A urina foi então divididas em alíquotas para amostras de 40 ml e armazenada a -80 ° C até se determinar a patologia definitiva

.

Apenas amostras de pacientes que tinham patologia final do tumor cistectomia pT2-pT4 foram adicionalmente processadas para o ARN utilizando a ARN urina exossomo kit de isolamento de acordo com as instruções do fabricante (Norgen). RNA foi submetido imediatamente após o isolamento de RNA-sequenciação. O ARN restante foi armazenado a -80 ° C até que os dados de ARN-sequenciação foi disponibilizado e o ARN foi necessário para a confirmação dos resultados de sequenciação de ARN.

ARN exossomo linha celular foi preparada utilizando TRIzol (Thermo Fisher Scientific) quanto as recomendações do fabricante. ARN linha celular foi preparado usando o mini kit Rneasy mais (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. RNA de tecido foi isolado com o kit RNeasy FFPE (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. Em todos os casos, o ARN foi preparado e imediatamente utilizado para a produção de ADNc e subsequente qRT-PCR

.

cDNA foi gerado com o kit de síntese de ADNc iScript Bio-Rad. qRT-PCR foi realizada com Bio-Rad-SYBR verde e Bio-Rad CFX96 sistema em tempo real. Casa mantendo genes incluídos GAPDH e 18S, sendo que ambos são empacotados em exossomos [57]. O programa Normfinder foi usada para determinar o gene de manutenção apropriado para a normalização dos dados qRT-PCR. Com base na avaliação de beta-actina, GAPDH e 18S, a análise selecionada quer GAPDH ou 18S. O gene housekeeping selecionado está documentada em cada legenda da figura [58]. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1.

Resultados

linhas celulares UBC contêm mRNA associado ao tumor e lncRNA

A fim de identificar-alvo lncRNA para análise em UBC nós analisamos selecionadas lncRNAs e mRNAs implicada na progressão de tumores em outros tumores epiteliais. Nós escolhemos cinco lncRNAs (HOTAIR, HOXA-AS-2, lincRNA-ROR, MALAT1 e ANRIL) e três mRNA homeobox A13 (HOXA13), SRY-box 2 (SOX2) e classe POU 5 homeobox 1 (POU5F1 /OCT4) implicado em uma gama de cancros incluindo, UBC.

Por exemplo, HOXA-AS-2 foi demonstrada para reprimir a apoptose em células de leucemia promielocítica [59]. O lincRNA-RoR foi mostrado para induzir EMT na mama e cancro hepatocelular [60]. Notavelmente HOTAIR foi mostrado para ser empacotado em exossomas e, assim, afectar a quimiossensibilidade e sobrevivência sob condições hipóxicas em células receptoras [16].

MALAT1 foi demonstrada ser um indicador de metástases num número de cancros, incluindo UBC [61 , 62]. ANRIL aumenta a proliferação celular e diminui a apoptose em células de UBC [63]. Enquanto HOXA13 aumenta a proliferação e invasão, bem como inibe a apoptose em células de glioblastoma multiforme [64]. Os factores de transcrição e SOX2 OCT4 normalmente conduzir o pluripotência das células estaminais embrionárias mas agora têm sido implicados na manutenção de células estaminais do cancro, que podem servir como células de iniciação do tumor para um grande número de tumores [65].

comparação com o nível de expressão destes seleccionado lncRNA e ARNm no controlo não-tumorigénico linha celular urotelial SV-40 imortalizadas SV-HUC, encontramos a expressão elevada de HOTAIR, HOXA-aS-2, ANRIL, e HOXA13 em células T24 UBC . Enquanto na linha de células SUP-TCC UBC encontramos HOTAIR, HOX-AS-2, Linc-RoR, ANRIL e HOXA13 foram elevados (Figura 1A e 1B, respectivamente).

qRT-PCR foi realizada em lisados ​​celulares a partir de uma variedade de linhas celulares de UBC e a linha celular de controlo urotelial SV-40 imortalizadas SV-HUC. O nível de expressão de ARNm e lncRNA foi primeiro normalizada para GAPDH e dobrá-alterações da expressão de genes em linhas celulares de UBC indivíduo foi comparada com a de células SV-HUC controlo. Os lisados ​​(A) de células T24 (B) Os lisados ​​celulares TCC-sup. (C) qRT-PCR de HOTAIR em linhas celulares de UBC normalizados para níveis de transcrição de linhas celulares SV-HUC. (n = 3 experiências). teste t de Student foram utilizados para todas as experiências para identificar significância estatística na expressão entre UBC e células de controlo (Fig 1A-1C) HUC SV-* p 0,05, ** p 0,001, *** p . 0,0001

Dada a importância do HOTAIR na progressão do tumor foi avaliada a sua expressão em número de linhas de células de UBC variando de Grau II Grau IV. Descobrimos que as linhas celulares UBC têm uma ampla gama de expressão HOTAIR com TCC-SUP (Grau IV) apresentam a maior e T24 (grau III) um nível intermediário de expressão (Fig 1C). Estes dados suportam recentemente publicado observações da ampla gama de expressão HOTAIR em linhas celulares UBC [66]. Dado que T24 expressa níveis intermediário e TCC-SUP expressa níveis relativamente elevados de HOTAIR comparação com outras linhas celulares UBC (Fig 1C), selecionamos estas duas linhas de células para avaliar os papéis funcionais de HOTAIR na UBC.

HOTAIR afeta a migração de células UBC e invasão

in vitro

HOTAIR foi mostrado para afetar a migração e invasão na mama, gástrico, de esôfago e colo-rectal [3,51,67,68]. A fim de demonstrar que HOTAIR tem papéis funcionais na UBC, primeiro gerado linhas de células knockdown HOTAIR com shRNA contra HOTAIR em T24 e células TCC-SUP. (S1A e S1B Fig, respectivamente). Knockdown de HOTAIR em linhas celulares UBC T24 e TCC-SUP levou à diminuição da migração em um ensaio de ferida-scratch padrão (Fig 2A e 2B, respectivamente).

Distância da migração foi medida com base em ensaios ferida-zero de lentiviral shRNA knockdown de HOTAIR vs. controlo shScramble (A) T24 e (b) linhas celulares TCC-SUP UBC. ensaio de invasão Trans-poço de shHOTAIR vs. controlo shScramble (C) T24 e (D). linhas TCC-SUP celulares (E) ensaio de invasão 3-D comparando controle shScramble células TCC-SUP às células shHOTAIR TCC-sup. As células são semeadas em microtissue

® géis rodízio gerados e permissão para formar esferóides. Depois de esferóides são formados, BME é suavemente em camadas sobre o gel caster. esferóides circulares escuros são mostrados e setas apontam para projeções de invadir as células na BME circundante. F. Após 7 dias de cultura, os comprimentos de projecção foram medidos a partir da superfície do esferóide para a ponta distal utilizando o ImageJ e o comprimento médio de projecção determinado para cada tipo de célula. O teste t de Student foi utilizado para determinar diferenças estatísticas em cada experimento apresentado (AF) * p 0,1, ** p 0,05, *** p . 0,01 (n = 3-6 experimentos /painel)

Invasion foi investigada por ambos os sistemas de ensaio trans-bem e 3-D (microtissues

®). Em 3-D cultura de células tumorais formam espontaneamente esferóides. Está bem estabelecido que as células cultivadas como esferóides 3-D maximizar as interacções célula-a-célula e o comportamento de tecidos mais de perto endógena mímico [55,56]. células knockdown HOTAIR eram menos invasiva, tanto trans-bem (Fig 2C e 2D) e ensaios de 3-D (Fig 2E e 2F).

HOTAIR afeta a expressão do gene de transição epitelial-a-mesênquima

EMT se pensa ser uma transição oncogénica essencial como células cancerosas dissociar a partir de folhas epiteliais e invadir os tecidos circundantes. HOTAIR foi mostrado para afetar tanto a ativação e repressão dos numerosos EMT genes-mediação da via em vários cancros epiteliais [3,69,70]. EMT genes têm sido demonstrados para regular a invasão do tumor em

in vitro

ensaios tais como o ensaio de trans-bem e

In vivo

durante a invasão tumoral em todos os tumores examinados [71,72].

antecipado que a migração e invasão reduzida que foi observada nas células knockdown UBC hOTAIR mostrados na Fig 2A-2F era devido aos efeitos de hOTAIR sobre a expressão do gene de EMT. HOTAIR tem sido demonstrado que tanto induzir e reprimir vários genes envolvidos na EMT incluindo SNAI1, LAMC2, LAMB3, ABL2, JAM2, PCDHB5, e PCDHB10 [3]. No entanto, HOTAIR não regula estes genes em cada tipo de tumor [48].

Para abordar a relação /via EMT HOTAIR na UBC, usamos qRT-PCR para avaliar os genes alvo HOTAIR previamente identificados, além de vários outros fatores EMT em células controle shScramble comparação com linhagens de células shHOTAIR UBC.

Figura 3A e 3B mostra que as linhas celulares tanto shHOTAIR T24 e shHOTAIR TCC-SUP tinha reduzido expressão de SNAI1, um regulador mestre da EMT, bem como EMT genes da via LAMB3 e mRNA LAMBC2 comparados aos controles shScramble. No entanto, não encontramos que HOTAIR knockdown expressão afetada de JAM2, ABL2, PCDHB5 ou PCDHB 10 (dados não mostrados). Portanto, vamos checar o nível basal de expressão destes objectivos HOTAIR conhecidos em T24 e células TCC-SUP (S2 Fig). Embora os objectivos anteriormente identificados de HOTAIR foram expressos tanto em T24 e TCC-SUP, a sua expressão não foi afectado pela perda de HOTAIR (dados não mostrados).

(A) qRT-PCR dos genes conhecidos alvo e HOTAIR EMT clássica factores de ARNm em shHOTAIR T24 em comparação com células T24 shScramble UBC. a expressão de ARNm (B) do gene alvo em células de EMT shHOTAIR TCC-Sup em comparação com células shScramble TCC-Sup (nos painéis A e B os níveis de ARNm de EMT foram normalizadas para GAPDH). (C) siARN dirigido contra HOTAIR ou GFP foi usado em células T24 e EMT factores de expressão de ARNm e ZEB1 SNAI1 avaliada por qRT-PCR (ARNm foi normalizada para 18s). (D) de imunotransferência de células T24 siGFP e siHOTAIR mostrando níveis reduzidos de proteína de ZEB1 e SNAI1. GAPDH é um controlo de carga. Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga. teste t de Student foi utilizado para determinar as diferenças estatísticas entre células knockdown HOTAIR controlo e nas experiências de qRT-PCR apresentados (AC) * p 0,1, ** p 0,05, *** p 0,01 (n = 3-6 experiências /painel).

É importante ressaltar que a expressão de dois outros marcadores clássicos EMT, zinc-finger obrigatório e-box homeobox 1 (ZEB1), e fator de transcrição bHLH família torção 1 (TWIST1) de foram reduzidos na shHOTAIR knockdown linhas celulares UBC (Fig 3A e 3B).

a expressão de e-caderina (CDH1) e vimentina (VIM) mRNA foi avaliada em linhas celulares shScramble e shHOTAIR T24 e TCC-SUP. Ambos CDH1 e VIM ARNm foram expressos em níveis extremamente baixos e permaneceram inalteradas entre as linhas de células e shScramble shHOTAIR HOTAIR indicando que provavelmente não mediar linha invasividade celular UBC através de alterações nestes dois jogadores EMT (dados não mostrados). Estes dados são consistentes com os relatórios previamente publicados que mostram que CDH1 e VIM são minimamente expressa em T24 e TCC-SUP [73,74].

Curiosamente, Matrix metalopeptidase 1 expressão do mRNA (MMP1) foi reduzida em shHOTAIR TCC- células SUP UBC (Fig 3B). cliva a MMP-1 de proteína colagénios intersticiais na matriz extracelular, facilitando assim a invasão tumoral [75]. Por outro lado, foi observado o aumento da expressão da proteína apertado junção 1 (TJP1 /ZO1) ARNm em células SUP-shHOTAIR TCC UBC em comparação com células de controlo shScramble (Fig 3B). ZO-1 proteína mantém junções apertadas intercelulares essenciais para a integridade folha epitelial [76]. A correlação de perda de HOTAIR com aumento da expressão de ZO1 sugere que as células SUP-shHOTAIR TCC são reverter para um fenótipo mais epitelial. Além disso, estes dados sugerem que HOTAIR pode desempenhar um papel na supressão de alguns genes relacionados com epiteliais em células SUP-TCC.

Para apoiar os resultados dos dados de knockdown shHOTAIR nós utilizados anteriormente publicada ARNsi dirigido contra HOTAIR para gerar siHOTAIR células T24 UBC knockdown [51] (S3 Fig). Uma vez que a expressão de SNAI1 e ARNm ZEB1 foram ambos afectados por HOTAIR knockdown em T24 e células TCC-SUP UBC (Figura 3A e 3B, respectivamente), avaliou-se a ARNm (Figura 3C) e os níveis de proteína (Figura 3D) de SNA1 e ZEB1 em células siGFP siHOTAIR e T24. Ambos os níveis de mRNA e proteína de SNA1 e ZEB1 foram reduzidas em células T24 siHOTAIR knockdown (Fig 3D). No geral, estes dados apoiam a correlação entre a perda de expressão HOTAIR com a migração e invasão reduzida e a expressão do factor de EMT em linhas celulares de UBC.

tumores HGMI (pT2-pT4) UBC são enriquecidos em lncRNA associado a um tumor e ARNm

Os tumores e DNT de doentes sem tratamento prévio de quimioterapia submetidos cystectomy para a doença HG (confirmado estágio patológico final, pT2-pT4) foram isolados com a aprovação do IRB. características clínicas dos pacientes são apresentados na Tabela S2.

Foi utilizado qRT-PCR para identificar lncRNA associado a um tumor e de ARNm em tumores em comparação com o epitélio do DNT a partir dos mesmos pacientes (Fig 4A). Descobrimos que HOTAIR, HOX-AS-2, MALAT1 e dois mRNA OCT4 e SOX2 têm níveis mais elevados de expressão de DNT (o nível de tumores individuais expressão foi reunido e em comparação com os níveis de expressão DNT em pool).

( a) qRT-PCR de ARNm e lncRNAs associados a tumor em tumores a partir de pacientes que foram submetidos a cistectomia para a doença HG (patologia definitiva pT2-pT4). Tumor e tecido normal ARNm distai (DNT) ou lncRNA foi normalizada para 18s e, em seguida, foi calculada a relação entre tumor para DNT. A significância estatística foi determinada utilizando o teste t de Student para comparar tumor para DNT expressão normalizada, * p 0,05. (n = 10 doentes). chemotherapy.

doi:10.1371/journal.pone.0147236.s006

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Acknowledgments

Functional