Abstract
O mecanismo por trás do controle espaço-temporal da dinâmica de células cancerígenas e sua possível associação com a proliferação de células não foi bem estabelecida. Ao explorar a técnica de imagiologia intravital, verificou-se que a motilidade de células de cancro e propriedades invasivas estavam intimamente associados com o ciclo celular.
In vivo
inoculação de células cancerígenas do cólon humano que carregam indicador de ciclo celular baseado em ubiquitination fluorescência (Fucci) demonstraram um fenômeno inesperado: S /G2 /M células eram mais móveis e invasiva do que as células G1. As análises microarray mostrou que
Arhgap11a
, uma proteína Rho GTPase-activating uncharacterized (RhoGAP), foi expressa em uma forma de células de ciclo dependente. Expressão de ARHGAP11A em células cancerosas suprimida mecanismos RhoA-dependentes, tais como a formação de fibras de stress e de adesão focal, o que fez as células mais propensas a migrar. Demonstramos ainda que a supressão induzida RhoA por ARHGAP11A aumento da actividade relativa Rac1, conduzindo a um aumento nas propriedades invasivas. inibição baseada em RNAi de Arhgap11a reduziu a invasão e
in vivo
expansão de cânceres. Além disso, a análise das amostras humanas mostrou a significativa aumento da regulação do
Arhgap11a
em cancros do cólon, que foi correlacionada com o estado invasão clínica. O presente estudo sugere que ARHGAP11A, um RhoGAP dependente do ciclo celular, é um regulador crítico da mobilidade de células cancerosas e é, portanto, um alvo terapêutico promissor em cancros invasivos
Citation:. Kagawa Y, Matsumoto S, Kamioka Y, Mimori K, Y Naito, Ishii T. et al. (2013) Cell Cycle-Dependent Rho GTPase Atividade dinamicamente Regula motilidade celular Câncer e Invasion
In Vivo
. PLoS ONE 8 (12): e83629. doi: 10.1371 /journal.pone.0083629
editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia
Recebido: 29 de agosto de 2013; Aceito: 05 de novembro de 2013; Publicação: 30 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Kagawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por subvenções-in-Aid para a Investigação científica em áreas inovadoras (22113007), por o primeiro programa do Ministério da Educação, Ciência, Esporte e Cultura do Japão, por doações do Human Frontier Science Program Internacional (RGY0077 /2011) ; e por doações da Takeda Science Foundation, o Cell Science Research Foundation, a Fundação Kanae para a Promoção da Ciência Médica, e da Fundação Nakajima. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
expansão ilimitada devido à progressão do ciclo celular desmarcada e aumento da penetração no ambiente normal vizinho é um aspecto formidável e com risco de vida das células cancerosas. Na verdade, regulação do ciclo celular tem sido um tópico de pesquisa importante no campo da biologia da célula cancerosa.
Além disso, o câncer tem propriedades altamente dinâmicos, incluindo a invasão de tecidos circundantes, a infiltração da circulação sistêmica, e pioneiro de um novo “nicho” para a colonização longe de sua origem [1], [2]. Embora os factores que determinam a mobilização de células de cancro, tais como as proteínas da família Rho G pequenas, têm sido extensivamente estudadas [3], a associação entre a regulação do ciclo celular e a mobilidade celular de células cancerosas permanece obscura. Para elucidar essa interação dinâmica seria útil para observar as propriedades espaço-temporais de regulação do ciclo celular e mobilidade celular simultaneamente
in vivo
.
Recentemente, microscopia multiphoton intravital foi utilizado para dissecar os fenómenos celulares intactas em vários sistemas biológicos, tais como a resposta imune [4], [5], reacções inflamatórias [6], e remodelação óssea [7]. Esta técnica avançada de imagem permitiu-nos compreender os comportamentos dinâmicos de células em tecidos e órgãos vivos. As células cancerosas também são altamente móveis e os seus comportamentos migratórios foram avaliadas usando essa técnica de imagem [8] -. [10], embora a sua correlação com a natureza proliferativa das células permanece indefinida
Aqui, conseguimos visualizar dinâmica eventos durante a invasão de células de câncer e metástase por meio de microscopia intravital multiphoton. Por meio do indicador de ciclo celular baseada ubiquitination fluorescente (Fucci), uma sonda de proteína fluorescente especial usado para o monitoramento do ciclo celular em células vivas, identificamos uma estreita associação entre o ciclo celular e as propriedades de mobilização de células cancerosas.
resultados
visualização dinâmica detecta a mobilização de células cancerosas associadas ao ciclo celular e invasão
in vivo
Nós utilizamos microscopia intravital multiphoton e tecnologia Fucci [11] para estudar a célula ciclo e migração em um sistema vivo. Neste sistema Fucci, geminin (GMNN), uma proteína nuclear enriquecidos no S /G2 /M fases, e CDT1, enriquecido na fase G1, foram, respectivamente, marcados com proteínas com efeito de estufa e vermelho fluorescente (Figura 1A,
superior
painel). Fucci-expressando células de cancro de cólon humano HCT-116 invasivos (Figura 1A,
inferior do painel) foram inoculados no ceco ou tecidos subcutâneos de um rato imunocomprometido NOD /SCID [12] – [14]. Quatro semanas após a implantação, os tumores foram observados intravitally. Nós preferencialmente detectada células Fucci-verdes S /G2 /M de fase ao longo das áreas marginais de cabeças de invasão do cancro depois inoculadas na parede do ceco (Figura 1B). Similar mudanças distributivas em células Fucci-verdes e -Red foram detectados quando as células cancerígenas foram inoculadas em mesentério ou cólon parede do (Figura S1). A distribuição preferencial de células cancerosas no S /G2 /M fases também foi observada em amostras de cancro do cólon humano cirurgicamente ressecados (Figura S2). As células cancerosas em cabeças de invasão foram preferencialmente coradas com anticorpos contra GMNN [15], [16] em comparação com aqueles em regiões não-tumorais ou os centros de tumor.
(A) Estabelecimento e análises de células cancerígenas do cólon HCT116 estavelmente expressando Fucci. (
Alta
) O sistema Fucci permite o monitoramento do ciclo celular em células vivas em tempo real. Os núcleos de células em G1 /G0, S precoce, e S /G2 /M fases são rotulados vermelho, amarelo e verde, respectivamente. (
Baixa
) Snapshots de células HCT116 Fucci expressam. barras de escala representam 20 mm. (B) imagem multifotônica intravital de células HCT116 Fucci-positivos inoculados em ratinhos NOD /SCID. (
esquerda) Uma imagem representativa de células HCT116 Fucci expressam implantados no ceco (verde: Fucci-verde (MAG), S /G2 /M; vermelho: Fucci-vermelho (mKO2), G1; azul : fibras de colágeno (geração de segundo harmônico (SHG) imaging)). As barras de escala representam 75 jiM. (
Right
) Quantificação do número de células HCT116 Fucci-verdes e -Red em diferentes áreas de tumores inoculados. zonas centro e marginais foram definidos como áreas mais longe ou mais perto do que 75 mm a partir da fronteira entre os tecidos tumorais e normais, respectivamente. (C) Imagem representativa na borda de uma massa tumoral HCT116 que expressam Fucci. Toda a área (
esquerdo
) e uma série de tempo (
direita) de imagens ampliadas (um por 400 s) de células cancerosas que invadem o interstício (verde: Fucci-verde (MAG), S /G2 /M; vermelho: Fucci-vermelho (mKO2), G1; azul:. fibras de colágeno (imagem SHG) (ver também filme S1) As imagens reais (
painéis
superiores) e trajetórias de células (
menor
painéis) são mostrados. barras de escala representam 100 mm (
esquerdo) e 10 mm (
direito
). (D) imagem representativa de extravasar células HeLa Fucci expressam. toda a área (
esquerdo
) e uma série de tempo (
direito
) de imagens ampliadas de células cancerosas extravasar dos vasos sanguíneos (um por 12 min) (verde: Fucci-verde (MAG) , S /G2 /M; vermelho: Fucci-vermelho (mKO2), G1; azul: as fibras de colágeno (imagem SHG) (ver também filme S2) As imagens reais (
painéis superiores) e trajetórias de células (
diminuir
painéis) são mostrados barras de escala representam 100 mm (
esquerdo
) e 10 mm (
direito
) (e) a motilidade celular em Fucci-estufa e. – células red-positivas foi medida por 4 h (ver também filme S3). (
Esquerda
) esferas verdes e vermelhas representam células Fucci-estufa e -red-positivos, respectivamente, e as linhas amarelas mostram as trajetórias associadas. As barras de escala representam 100 um. (
Right
) velocidades médias de rastreamento de células Fucci-estufa e -red-positivos. Dados (N = 379 para Fucci verde e n = 259 para Fucci vermelho) foram obtidos a partir de células individuais em três experiências independentes. As velocidades dos dois grupos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney
L
-test (p = 0,0191). As faixas medianas e interquartis para cada grupo são sobrepostas sobre os gráficos de pontos.
Em seguida, examinamos a natureza dinâmica do câncer de células
in vivo
. Fucci-expressando células cancerosas HCT116 foram altamente móvel após inoculação em tecidos subcutâneos, e algumas células cancerosas estavam invadindo ativamente, parecendo ‘mergulho’ para o interstício circundante durante a imagens em tempo-cursos (Figura 1C; Filme S1). Nomeadamente, quase todas as células de mergulho eram verdes (Figura 1C,
pontas de seta), sugerindo que a motilidade celular e a invasão do cancro pode ser dependente do ciclo celular. Além disso, poderíamos detectar seus movimentos migratórios durante o extravasamento para a metástase (Figura 1D; Filme S2). Algumas células foram encontrados a migrar para fora a partir de agregados de células de cancro preso dentro dos vasos sanguíneos, e estes também foram todos verde. Um certo período de observação (por até 2 h) de regiões centrais do tumor resultou na captura de comportamentos lento basais, assim como o movimento de streaming com o fluxo de sangue, de vários tipos de células de cancro, o que nos permitiu imagem um número suficiente de células para quantificação (Figura 1D; filme S3). análises estatísticas detalhadas de velocidade de rastreamento de celular claramente demonstrado que as células cancerosas verdes (no S /G2 /fase M) têm mobilidade significativamente maior do que as células G1 vermelhos (média de acompanhamento de velocidade de 1,39 ± 0,08 mm /min para Fucci-verde vs. 1,09 ± 0,06 ^ M /min para Fucci-vermelho; p = 0,00191) (Figura 1E). Constatou-se que um determinado período de imagens intravital (até 3 horas) não afecta a mobilidade de células de cancro (Figura S3). Ao rastrear células individuais ao longo de um período de tempo, excluímos a possibilidade de que tal mudança mobilidade nas S /G2 /M fases refletiu o movimento em relação citocinese. Estes resultados indicam que certas moléculas preferencialmente expresso no S G2 /M Fucci-verde /fases facilitar a migração e a invasão de células cancerosas.
Identificação de ARHGAP11A como uma célula dependente do ciclo de controlo de mobilidade molécula
Para elucidar a base molecular do controle da motilidade dependente do ciclo celular, realizamos análises de cDNA comparativa baseada em microarranjos entre as células Fucci-verdes e -Red cultivadas
in vivo
(Figura 2A). Na análise microarray, 2.032 sondas (1.656 genes) mostrou duas mudanças vezes na expressão de (Figura 2B; Tabela S1). Como antecipado, a maioria destes genes codificam proteínas associadas com a divisão celular e a mitose. Com base em categorias de ontologias gene, foram extraídas genes relacionados ao movimento celular a partir dos 1.656 candidatos e descobriram que uma proteína Rho GTPase-activating uncharacterized (RhoGAP),
Arhgap11a
, foi preferencialmente expresso em /G2 fase verde S /M células de cancro (Figura 2B, Quadro S1). Todas as três sondas para
gene Arhgap11a
foram altamente classificado (5º, 12º e 41º) entre os 2.023 sondas. Demonstrou-se que pequenas proteínas da família Rho G, tais como Rho, Rac e Cdc42, e suas moléculas reguladoras, tais como RhoGAP, cooperativamente controlar a motilidade celular em ambas as células normais e cancerosas [17] – [21]. A expressão preferencial de
Arhgap11a
em células Fucci-verde foi confirmada em ambos os ARNm (Figura 2C) e os níveis de proteína (Figura 2D). Além disso, foi demonstrado um aumento gradual, dependente do tempo em
expressão Arhgap11a
durante a progressão através do ciclo celular de G1 para S /G2 /M (Figura 2E; Figura S4), fortalecendo o conceito de que
Arhgap11a
expressão é controlada de uma maneira dependente da progressão do ciclo celular. expressão pelo ciclo celular dependente de Arhgap11a também foi detectada em outras linhas de células de cancro do cólon além HCT116, tais como DLD1, HT29 e KM125M (Figura 2F), e HeLa (Figura S5), bem como em linhas de células não-cancerosas, tais como células HEK293 ( Figura S6), sugerindo a presença de um mecanismo geral para esta regulação da expressão característica do
Arhgap11a
em muitos tipos de células. Para elucidar o mecanismo subjacente a expressão dependente do ciclo celular de Arhgap11a, examinámos ainda mais o controlo transcricional deste gene. factores de transcrição da família E2F foram documentadas para funcionar de um modo dependente do ciclo celular [1]. Percebemos que uma sequência putativa E2F de ligação (TTTCGCGC) [23] foi localizado a -27 a -20 pares de bases do local de iniciação da transcrição de Arhgap11a. imunoprecipitação da cromatina (ChIP) experiências demonstraram a associação directa de E2F1 com que a região (Figura 2G), que podem estar envolvidos no ciclo celular dependentes da activação da transcrição de neste locus. Um ensaio de repórter de luciferase mostrou activação da transcrição dependente de E2F1 do promotor Arhgap11a, que foi bloqueada por associação com a proteína Rb (Figura 2H), sugerindo um possível papel de E2F /vias Rb na regulação da transcrição de Arhgap11a. Nós realizar plenamente o envolvimento de outros fatores de transcrição desde Arhgap11a foi substancialmente expressa também na fase G1 (Figura 2D), embora possamos assumir Rb /via E2F seria, pelo menos, responsável pelo aumento na expressão Arhgap11a na fase S.
análises microarray baseado no sinal de (A) Fucci. células HCT116 Fucci-positivos foram separados em Fucci-verde (MAG) – e Fucci-vermelho (mKO2) – células positivas por FACS. mRNA foi extraído a partir destas células e comparados por análise de microarray (dois experimentos dye-swap, oferecendo quatro microarray análises independentes). (B) No total, 2.023 1.656 sondas (genes) mostrou alterações na expressão de duas vezes (Tabela S1) (P 0,05). Destes,
Arhgap11a
foi altamente classificado, e todas as três sondas para
Arhgap11a
estavam entre as sondas topo do ranking para RhoGAPs. As três sondas foram específicos para as poções indicados do
Arhgap11a
mRNA (
esquerdo
). Os três pontos marcados (# 1, # 2, # 3) nos gráficos de dispersão representam dobre mudanças (
direito
). (C) celular expressão dependente do ciclo de
Arhgap11a
mRNA foi confirmada por qPCR. Os dados foram normalizados para expressão
GAPDH (n = 3). (D) a expressão dependente do ciclo celular de proteínas
Arhgap11a
. (
Right
) por citometria de fluxo análises de células HCT116 Fucci expressam. perfis do ciclo celular foram codificados por cores: G1, vermelho; início S, amarelo; e S /G2 /M, verde (
canto superior direito
). conteúdo de DNA foram medidos por Hoechst33342 fluorescência de (
menor
direita), confirmando que os sinais Fucci representar com precisão os níveis do ciclo celular (n = 3). (
Esquerda
) celular expressão dependente do ciclo de ARHGAP11A do ciclo celular e marcadores, conforme determinado por Western blot (n = 3). (E) Expressão dependente do tempo de
Arhgap11a
durante a progressão do ciclo celular de G1 para S /G2 /M. Fucci-vermelho (mKO2) células HCT116 -positivas foram classificados usando um classificador de células FACSAria e foram cultivadas durante os períodos de tempo indicados. Citometria de fluxo análises (
superior
) e proporções de cores Fucci (
esquerdo
) são mostrados para cada ponto de tempo. (
Right
) A expressão relativa de
Arhgap11a
foi examinado por qPCR (n = 6). Os dados foram analisados por ANOVA de uma via (
p
= 0,0001) e teste de comparação múltipla de Bonferroni (***
p Art 0,01). (F) ciclo celular dependente de
expressão Arhgap11a
em várias linhas celulares de cancro do cólon humano. Fucci foi introduzido em diferentes linhas celulares de cancro de cólon humano (HCT116, DLD1, HT29, e KM12SM). Em todas as linhas de células,
Arhgap11a
expressão foi significativamente maior no S /G2 /M (
verde
) do que em células G1 (
vermelho). (G) Um imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio com um anticorpo anti-E2F1 mostrou que E2F1 ligado ao putativo local de ligação a E2F-no
Arhgap11a
promotor (n = 3). ensaio de repórter de (H) da luciferase do
Arhgap11a
região promotora (-500 pb), incluindo o local de ligação a E2F-(GTTTCGCGC) a -20 pb a partir do ponto de partida da transcrição. A co-transfecção com E2F1 reforçada a actividade de transcrição, enquanto que a expressão simultânea de Rb bloqueou. Os valores para a actividade da luciferase foram normalizados ao longo de cada experiência e, para controlar as diferenças na eficiência de transfecção, a p-galactosidase.
ARHGAP11A é uma proteína de GTPase para acelerar Rho, mas não para Rac ou Cdc42, e inibe os fenómenos celulares Rho-dependentes
ARHGAP11A já tinha sido clonado e listado em um banco de dados NCBI, mas sua função molecular ainda não tinham sido caracterizados. Notavelmente, não ficou claro se seu domínio GAP putativa, de fato exerce um efeito de aceleração de GTPase. Para determinar a sua função, que isolado ARHGAP11A halo-etiquetado (ou halo-tag só como um controlo) expressos em células HEK293 (Figura 3A) e incubou-se que
In vitro
com várias proteínas da família Rho, tais como RhoA , Rac1, e Cdc42 (Figura 3B). Neste ensaio, foi medida a actividade do GAP por meio da detecção de fosfato inorgânico libertado devido à hidrólise de GTP Rho de proteínas [24]. Este ensaio in vitro isento de células mostraram que ARHGAP11A acelerou grandemente GTP hidrólise de RhoA, mas não a de Rac1 ou Cdc42 (Figura 3B). As quantidades de formas activas de proteínas da família Rho também foram avaliadas pelo ensaio de pull-down com GST-Rhotekin (para Rho) ou GST-CRIB (por Rac e Cdc42) em células HEK293 [25]. A transfecção de ARHGAP11A reduziu as quantidades de RhoA activa, RhoB, e RhoC, mas não da Rac1 ou Cdc42 (Figura 3C). Nós também confirmou que esta atividade RhoGAP foi essencialmente abolida quando seu domínio GAP putativo foi eliminado (Figura 3D). Estes resultados confirmam claramente que ARHGAP11A é uma lacuna específica sobre Rho, mas não para Rac ou Cdc42, cujo efeito é mediado pelo seu domínio GAP previsto.
proteínas (A) halo-Tagged ARHGAP11A e Halo-Tag e expressa purificado a partir de células HEK293. (B) Detecção de actividade de GTPase por quantificação de fosfato inorgânico libertado pela hidrólise de GTP por proteínas da família Rho. ARHGAP11A aumentou a actividade de GTPase RhoA de, mas não da Rac1 ou Cdc42. (C) Detecção de formas activas e totais de várias proteínas Rho-família (RhoA, RHOB, RhoC, Rac1 e Cdc42) em células HEK293 transfectadas com Halo-ARHGAP11A ou seu controle. Expressão de ARHGAP11A reduziu os montantes das formas activas de RhoA, RhoB e RhoC. (D) Avaliação da ARHGAP11A mutante sem o domínio GAP putativa (ΔGAP).
Activo RhoA foi mostrado para estimular a adesão focal e formação de fibras de estresse pela ativação da proteína cinase Rho-associado (ROCHA) e /ou MDIA (Figura 4A) [26]. Concordantemente, expressão exógena da RhoA constitutivamente activa (RhoA-Q63L) [27] em células HCT116 induziu aumentos anormais em fibras de stress de actina F e de formação de adesão focal, visualizadas por meio de agregados de paxilina (Figura 4B). Em contraste, a supressão da actividade de Rho por CT04 (1 ug /ml), um inibidor potente de Rho [28], reduziu a formação de fibras de stress e adesões focais (Figura 4C). Sob estas condições experimentais, a expressão adicional de ARHGAP11A inibiu significativamente a formação de ambas as fibras de stress de actina F (Figura 4D,
meio
painel, e 4E) e adesões focais (Figura 4D,
direita painel, e 4F). Expressão de ARHGAP11A também reduziu o nível de fosforiladas cadeia leve da miosina (pMLC) (Figura S7). Em resumo, ARHGAP11A, como um RhoGAP, suprimida fenómenos Rho-dependentes, tais como a adesão focal e formação de fibras de stress, em células cancerosas HCT116. Também confirmámos a função de ARHGAP11A em células HeLa (Figura 4G-I).
(A) Representação esquemática das reacções celulares RhoA-mediadas. (B) Efeito de sobreexpressão de tipo selvagem (WT) ou constitutivamente activa (Q63L) RhoA na formação de fibras de stress de actina F (visualizado usando Alexa 568-faloidina) e adesões focais (corados com anti-paxilina). GFP foi co-transfectado para identificar as células transfectadas. barras de escala representam 15 um. (C) Efeito de CT04, um inibidor potente de RhoA, sobre a formação de fibras de stress de actina-F (visualizado usando rodamina-faloidina) e adesões focais (corados com anti-paxilina). Os núcleos foram corados com DAPI. barras de escala representam 15 um. (D) Efeito de sobreexpressão de Halo-Tagged ARHGAP11A ou do seu controlo sobre a formação de fibras de stress de actina-F (visualizado usando Alexa 568-faloidina) e adesões focais (corados com anti-paxilina) em células HCT116. Pontas de seta identificar halo-expressando-Tag células (marcadas com Oregon verde conjugado ligando Halo-Tag). As barras de escala representam 10 um. (E) Quantificação de intensidades médias de F-actina em halo-controle (n = 80) e halo-ARHGAP11A-expressando células HCT116 (n = 80). Os dados foram compilados a partir de três experimentos independentes. (F) Quantificação de adesões focais em Halo-controle (n = 80) e halo-ARHGAP11A-expressando células HCT116 (n = 80). Os dados foram compilados a partir de três experimentos independentes. (L) Efeito de sobreexpressão de Halo-Tagged ARHGAP11A ou do seu controlo sobre a formação de fibras de stress de actina F (visualizado usando Alexa 568-faloidina) e adesões focais (corados com anti-paxilina) em células HeLa. Pontas de seta identificar halo-expressando-Tag células (marcadas com Oregon verde conjugado ligando Halo-Tag). As barras de escala representam 10 um. (H) A quantificação de intensidades médias de F-actina em Halo-controle (n = 80) e halo-ARHGAP11A-expressando células (n = 80) HeLa. Os dados foram compilados a partir de três experimentos independentes. (I) A quantificação do número de adesões focais em Halo-controle (n = 40) e halo-ARHGAP11A-expressando células (n = 46) HeLa. Os dados foram compilados a partir de três experimentos independentes.
ARHGAP11A estimula a motilidade de células de câncer, aumentando a atividade de Rac
motilidade celular é conhecido por estar mutuamente regulada por diversas proteínas da família Rho G pequenas [29] . Considerando RhoA activa (ou Rho ou RhoC) estabiliza citoesqueletos através do reforço de fibras de stress e a formação de adesão focal, activação de Rac1 (ou Cdc42) faz com que as células flexível e móvel, levando à formação de filopodia lamelip�ios ou [29]. As actividades das proteínas que contrariam RhoA e Rac1 são mutuamente controlada [30], e a inibição de um resulta no aumento relativo da outra (Figura 5A). Aqui, usando Raichu-Rac1, um biossensor baseado em FRET de actividade Rac1 ao nível de uma única célula [31], [32], examinámos a actividade Rac1 em células HCT116. Rac1 actividade foi significativamente mais elevada nas células que expressam ARHGAP11A comparação com transfectadas por simulação (transfectadas apenas com Halo-Tag) ou células não-transfectadas (Figura 5 B e C), sugerindo que o mecanismo pelo qual a supressão da actividade de Rho leva a contra- ativação de Rac1 no nível de uma única célula. Semelhante a activação mediada por ARHGAP11A de Rac1 foi também observada em células HeLa (Figura S8).
(A) Esquema que representa o equilíbrio entre a RhoA e Rac1 para a migração celular. (B) Análise de actividade Rac1 no nível de uma única célula em células HCT116 expressar Halo-ARHGAP11A ou seu controle Halo. Imagens representativas de células HCT116 Raichu-Rac1 expressam sob Halo-controle (
esquerda) ou transfecção Halo-ARHGAP11A (
direita) condições. Rac1 actividade foi monitorizada por razões de PCP /YFP FRET derivados de Raichu-Rac1. Expressão de Halo-Tag foi identificado com ligando Halo-Tag TMR-conjugado. A barra de escala representa 5 um. (C) Quantificação dos rácios de FRET em Halo-controle (n = 30) e halo-ARHGAP11A-expressando células HCT116 (n = 30). (D) a cultura tridimensional de HCT116 transfectada com halo-controlo ou ARHGAP11A halo-tagged, suplementado com Y27632 (para Halo-controlo apenas). A barra de escala representa 50 um. (E) Proporções de-tipo redondo HCT116 na cultura 3D transfectadas com Halo-ARHGAP11A ou Halo-controle. células do tipo redondo foram contadas três campos visuais para cada uma das três experiências independentes. As colunas representam a média ± S.E.M. (F)
In vitro
ensaio de invasão usando placa 3D Matrigel. As células migraram foram visualizados por coloração da membrana cultura com mancha Diff Quik (Dade Behring). HCT116 transfectada com halo ou halo-ARHGAP11A-controlo, e de tipo selvagem tratados com Y27632 HCT116 foram usadas no ensaio. (G) A quantificação dos índices de invasão de ensaios de placa 3D Matrigel. Invasão índices foram calculados de acordo com a equação apresentada na secção de métodos. As colunas representam as médias ± S.E.M.
Em seguida, examinou-se o efeito de inibição de Rho por ARHGAP11A no controle da morfologia das células do cancro e mobilidade. Para analisar as propriedades morfológicas de células cancerosas, que um sistema de cultura utilizada tridimensional (3D) de Matrigel (Figura 5 D e E) [33]. Em resultados, a sobre-expressão de ARHGAP11A levou a formas fusiformes de células HCT116, representando um fenótipo invasão propensas. mudanças morfogénicas similares também pode ser observada quando a sinalização mediada por Rho-foi inibida por Y27632, um inibidor potente ROCHA [34]. Nós ainda mediu a
in vitro
propriedades migratórias de células HCT116 em placas 3D Matrigel (Figura 5 F e G) [35], e concordante, superexpressão de ARHGAP11A ou Y27632 tratamento reforçada migração de HCT116
in vitro
. Por outro lado, uma forte inibição da actividade de Rho por alta concentração de Y72632 bloqueou a migração (dados não mostrados). Estes resultados sugerem claramente que nível adequado de inibição de RhoA, como alcançado pela superexpressão de ARHGAP11A reforçada atividade migratória das células cancerosas HCT116.
impacto funcional de ARHGAP11A na mobilização de células cancerígenas do cólon humano HCT-116
In vivo
e possibilidade de ARHGAP11A como um alvo terapêutico em cancros invasivos
Para analisar a função de ARHGAP11A, geramos linhas de células HCT116 em que a expressão ARHGAP11A foi estavelmente reduzidos em shRNA (SH). expressão reduzida de ARHGAP11A foi confirmada em ambos os ARNm (Figura 6A) e os níveis de proteína (Figura 6B). Um ensaio de proliferação BrdU não mostraram diferenças entre as células de controle e SH, sugerindo que ARHGAP11A não influencia a proliferação de células-intrínseca
in vitro
(Figura 6C). Por outro lado, um
In vitro
ensaio de invasão de células com uma placa de Matrigel mostraram que a capacidade de invasão foi significativamente reduzida em células SH (Figura 6D). Em seguida examinamos o papel da ARHGAP11A em
in vivo
motilidade das células cancerosas inoculados. Ao utilizar técnicas de imagiologia multifotônica intravital, que mostrou que as células SH foram menos móveis do que as células de controlo em tumores inoculados subcutaneamente, demonstrando claramente que ARHGAP11A regula a motilidade das células cancerosas HCT116 in vivo (Figura 6E, filme S4). Nós também descobrimos que as células SH foram menos capazes de migrar para fora dos vasos sanguíneos que eram células de controlo durante o extravasamento de células de câncer de sangue residente (Figura 6F). Finalmente, nós investigamos o papel de ARHGAP11A em expansão tumor
in vivo
(Figura 6G). SH ARHGAP11A-knockdown exibiu menor progressão no dia 28 em comparação com as células de tipo selvagem (sh # 1, 6,47 ± 0,33 mm; SH # 2, 6,66 ± 0,32 mm, de tipo selvagem, 9,76 ± 0,82 milímetros; e SH controle, 9,38 ± 0,97 mm).
(A) Estabelecimento de linhas de células HCT116 ARHGAP11A-knockdown (SH # 1, # 2). Diminuição da expressão de ARNm de ARHGAP11A foi confirmada por qPCR. a expressão da proteína (B) em células HCT116 ARHGAP11A knockdown-SH e de controlo foi avaliada por Western blotting. Ensaio de proliferação (C) BrdU destas linhas celulares HCT116. As colunas representam as médias ± S.E.M. (D)
In vitro
ensaio de invasão usando placas de cultura 3D Matrigel. As colunas representam as médias ± S.E.M. (E)
In vivo
análises funcionais de células HCT116 knockdown-ARHGAP11A. Imagens representativas de controle (
verde
) e ARHGAP-knockdown (
vermelho e) células HCT116 inoculados subcutaneamente em NOD /SCID (
superior
). A raw ‘fundiu’ imagem e imagens extraídas dos canais verde e vermelho são mostrados. motilidade celular foi medida durante 7 h. círculos verdes e vermelhos representam células SH nº 1 HCT116 controlo e ARHGAP11A-knockdown, respectivamente, e as linhas amarelas mostram suas trajetórias (ver também filme S4). A barra de escala representa 50 um. (
Baixa
) velocidades médias de rastreamento de células de controlo e SH. Dados (N = 440 para o controlo e n = 215 para um SH #) foram obtidos a partir de células individuais em duas experiências independentes. As velocidades dos dois grupos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney
L
-test (p = 0,0034). As faixas medianas e interquartis para cada grupo são sobrepostas sobre os gráficos de pontos. (F) extravasamento de controle (
verde) e SH # 1 (
vermelho e) células HCT116. (
Esquerda
) células verdes foram preferencialmente detectada em espaços extravasculares, sugerindo uma alta potência para o extravasamento. (
Right
) número médio de células extravasados por campo visual. Os dados foram extraídos a partir de 10 campos visuais. (G) em expansão de células de tumor in vivo HCT-116. Wild-type células controle HCT116 (
círculos pretos) e as células HCT116 tratados com controle mexidos shRNA (
quadrados pretos), SH # 1 (
círculos vermelhos), e SH # 2 (
quadrados vermelhos) são mostrados. As células cancerosas (1,0 × 10
6/100 ul de PBS) foram inoculados principalmente no tecido subcutâneo. Os tamanhos dos tumores foram medidos cada semana durante 4 semanas após a inoculação. Os dados representam as médias ± S.E.M. de cinco experiências independentes. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias (
p
= 0,0037). (H) A diminuição da expressão de ARHGAP11A em células HCT116 tratadas com siRNAs segmentação ARHGAP11A (avaliada por qPCR). (I)
In vivo
siRNA tratamento de tumores HCT116. células HCT116 Controle (5,0 × 10
6) foram implantadas em ratinhos NOD /SCID, e uma semana mais tarde foram tratados com PBS (
preto cheio
círculos), atelocolagénio (
preto cheio
triângulos), ovos mexidos siRNA controle mais atelocolagénio (
preto cheio
quadrados), ou dois siRNAs (# 1 e # 2) contra ARHGAP11A mais atelocolagénio (
abertos vermelho círculos e quadrados, respectivamente). Os tamanhos dos tumores foram medidos semanalmente. Os dados representam as médias ± S.E.M. de cinco experiências independentes. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias (
p
= 0,0001). (J) Imagens de tumores extirpados no dia 35 (
esquerda). A barra de escala representa 10 mm. (
Right
) A imagens representativas de ratinhos SCID que possuem células cancerígenas do cólon humano HCT116, 35 dias após o tratamento com um siRNA (siRNA 1 #) ou com um RNA duplex mexidos (controle), em conjunto com atelocolagénio. A barra de escala representa 10 mm.
Em seguida, avaliamos o potencial de ARHGAP11A como um novo alvo terapêutico para a inibição da progressão do câncer. barra de escala, 100 mm. barra de escala, 100 mm. barra de escala, 100 mm.