Abstract

LIN28B está envolvido em “stemness” e tumorigénese, regulando negativamente a maturação do

let-7

membros da família de microRNA. Neste estudo, nós mostramos que a expressão LIN28B promove migração e recorrência de câncer de cólon. reação em cadeia da polimerase imunohistoquímica e transcrição reversa foram realizadas para detectar a expressão LIN28B em microarrays de tecido de cancro do cólon, tecidos cirúrgicos ressecados embebidos em parafina e células cancerosas. Perda de função, análises migração e proliferação foram realizados para delinear os potenciais papéis de LIN28B no câncer de cólon. LIN28B foi regulada no tecido do cancro do cólon em relação a mucosa normal, e sua sobre-expressão correlacionada com a redução da sobrevida do paciente e aumento da recorrência do tumor. supressão LIN28B inibiu a migração de células de cancro do cólon SW480 e facilitou a citotoxicidade induzida por oxaliplatina em SW480 e células cancerígenas do cólon HCT116. Em conclusão, LIN28B superexpressão contribui para a tumorigénese cólon e LIN28B pode servir como uma ferramenta de diagnóstico e alvo terapêutico para o câncer de cólon

Citation:. Pang M, Wu G, Hou X, Hou N, Liang L, Jia G , et ai. (2014) LIN28B Promove migração cancro do cólon e recorrência. PLoS ONE 9 (10): e109169. doi: 10.1371 /journal.pone.0109169

editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

Recebido: 06 de julho de 2014; Aceito: 28 de agosto de 2014; Publicação: 31 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Saúde Pública da província de Sichuan (110167). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

LIN28

foi inicialmente identificado em

C. elegans

e mostrou ser responsável pela temporização de desenvolvimento [1]. LIN28 induz pluripotência quando expressos em fibroblastos somáticas juntamente com

OCT4

,

SOX2

e

KLF4

.

LIN28B

, como um homólogo de

LIN28

, foi clonado a partir de primeiro e mostrado para ser sobre-expressos em células de carcinoma hepatocelular humanos e amostras clínicas em 2006 [2]. LIN28B é uma proteína de ligação a ARN regulada pelo desenvolvimento que promove a tumorigénese através do bloqueio do processamento pós-transcrição do tumor-supressor pri- /pré-

let-7

microARN [3], [4]. A capacidade de LIN28B para regular

let-7

, um

bona fide

supressor de tumor, é consistente com o seu papel de desenvolvimento na regulação da proliferação e diferenciação celular. Curiosamente, vários estudos revelaram que

LIN28B

em si é também uma meta de

let-7

membros da família, incluindo miR-125b [5]. Além

let-7

, LIN28B também pode ligar o mRNA de marcadores de células-tronco intestinais, tais como

LGR5

e

PROM1

[6]. Em resumo, LIN28B promove transformação basicamente pela supressão

let-7

. A concorrência entre LIN28B e

let-7

pode ser fundamental para a biologia celular normal e pode acelerar o desenvolvimento do tumor uma vez que este equilíbrio é perturbado.

LIN28B

é hipermetilado em tecidos somáticos [ ,,,0],7], e a sua reactivação aberrante pode promover a tumorigénese [8]. LIN28B é frequentemente sobre-expressa em vários tipos de cancro, especialmente tipos avançadas, tais como carcinoma hepatocelular progressiva [2], [9], do cancro do ovário epitelial [10], tumores de células de tumor e germe de Wilm [9]. Além de serem alvo de microARNs antecedentes, LIN28B é activada por várias vias oncogénicos. C- /N-Myc induzir a expressão LIN28B em vários modelos de tumor de rato humanos e, resultando em

let-7

repressão e proliferação celular [11], [12].

MYCN

amplificação também resulta em sobre-expressão LIN28B [10], e foi relatado que c-Myc está relacionada com o cancro do intestino grande esporádica e familiar polipose coli [13], o que implica um papel para LIN28B no cancro do cólon.

Apesar das grandes realizações da cirurgia, quimioterapia e o desenvolvimento de novos medicamentos moleculares-alvo, tais como bevacizumab (Avastin), a incidência de câncer de cólon continua a aumentar [14]. A cada ano, tumores do cólon são responsáveis ​​por 655, 000 mortes a nível mundial. Porque

Deixe-7

funções como um potencial supressor do crescimento em células cancerígenas do cólon humano [15], examinamos a expressão LIN28B em tecidos de câncer de cólon para determinar o equilíbrio entre LIN28B e

let-7

expressão . Nós examinamos a expressão LIN28B em tumores cancerígenas do cólon humano através de microsséries de tecido e descobriu que LIN28B foi significativamente regulada positivamente no tecido tumoral em comparação com mucosa do cólon normal. Para analisar ainda mais a sobrevida de pacientes com câncer de cólon, foi selecionado um conjunto adicional de pacientes no pós-operatório com registros de patologia detalhadas e dados de acompanhamento de 2004 a 2009. Como previsto, LIN28B superexpressão correlacionada com a sobrevivência reduzida paciente e uma maior probabilidade de recorrência do tumor . Além disso, descobrimos que silenciando LIN28B inibiu a migração de células SW480 e SW480 sensibilizados e células cancerígenas do cólon HCT116 a citotoxicidade induzida por oxaliplatina.

Pacientes e Métodos

análise de tecido do tumor

As amostras de carcinomas do cólon humano e dois pontos normais foram obtidas a partir de uma matriz de tecido de carcinoma de cólon humano (CO2161; US ​​Biomax), que continha 204 adenocarcinomas, 4 cancros das células em anel de sinete e 8 amostras normais de cólon mucosa. informação clínica detalhada, incluindo o estado de diferenciação e TNM de classificação, também foram fornecidos para cada amostra. Um conjunto adicional de 149 amostras de carcinoma de cólon foram coletados a partir de amostras que tinham sido cirurgicamente ressecados em 2004 a partir consentindo pacientes em Nanfang Hospital (Southern Medical University, Guangzhou, China), de acordo com um protocolo Institutional Review Board-aprovado. Cada um desses casos foi seguido, em detalhe, através de Junho de 2009. Foi confirmada a série TNM para amostras de ambos os grupos. No total, 357 tumores de cancro do cólon e 8 amostras de cólon normais foram usados ​​para a análise de IHC. As informações detalhadas de todos os tumores e pacientes é apresentado na Tabela 1. O protocolo do estudo foi aprovado pelo conselho de ética revisão de Nanfang Hospital. Temos obtido o consentimento informado por escrito de todos os participantes do estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsínquia e políticas relevantes na China

Dois patologistas marcados a intensidade da coloração LIN28B de acordo com a seguinte escala:. Uma pontuação de 0/1 foi usado para significar fraca intensidade baixa /LIN28B (taxa positiva 0-25%); uma pontuação de 2 representada intensidade intermediária (taxa positiva de 25-50%); e uma pontuação de 3 foi usada para coloração de alta intensidade ( taxa positiva de 50%). Tumores de graus 1, 2 e 3 são equivalentes aos tumores classificados como bem diferenciados, moderadamente diferenciados ou pouco diferenciados, respectivamente, utilizando microscopia.

Os testes de log rank (Mantel-Cox e Breslow) foram realizadas para comparar a sobrevivência e distribuições de recorrência dos diferentes grupos de intensidade (0-2 vs 3). A correlação entre a intensidade da coloração e sobrevivência ou de reincidência foi determinada usando uma análise de qui-quadrado, e um intervalo de confiança de 95% foi calculado para determinar a significância estatística.

cultura celular

O SW480, Caco2 e linhas celulares de cancro do cólon HCT116 foram adquiridos a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) e foram cultivados em modificação do meio de Eagle da Dulbecco (DMEM; Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS; Hyclone, Sul Logan, UT, EUA). Todas as linhas celulares foram mantidas em 5% de CO

2, atmosfera humidificada.

Oligorribonucleotídeos

Um ARNsi específicos de LIN28B e um pequeno ARN de controlo negativo (CN) foram construídos por Genepharma ( Xangai, China). iniciadores específicos e LIN28B–GAPDH foram sintetizados pela Takara (Takara Biotecnologia, Dalian, China).

transfecção celular

oligorribonucleótidos de RNA foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante . Entre 50 e 100 nM dos oligorribonucleótidos de ARN foram utilizados para cada transfecção.

semi-quantitativa de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) e a transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-PCR)

O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen) e foi então tratado com DNase I (Tiangen Biotech, Pequim, China). O cDNA para a qRT-PCR foi sintetizada com o kit de reagente PrimeScript RT e o ADNg Borracha (Takara). O procedimento de amplificação por PCR para GAPDH foi o seguinte: 94 ° C durante 3 min; 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s; e um terminal de alongamento a 72 ° C durante 5 min. A amplificação de LIN28B foi realizada como se segue: 95 ° C durante 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s; e uma etapa final a 72 ° C durante 5 min. Os ensaios de qRT-PCR foram realizadas utilizando o kit de SYBR PrimeScript RT-PCR (Takara) para GAPDH e LIN28B.

Imunotransferência

fracções de proteína citosólica foram preparados usando tampão RIPA (Beyotime Biotecnologia, Haimen, China). Os anticorpos utilizados para os imunoblots foram específicos para LIN28B (01:10, ab71415; Abcam, Cambridge, MA, EUA) e GAPDH (G9295, Sigma-Aldrich, EUA). As transferências de Western foram realizadas IHC e de acordo com procedimentos padrão.

análise de migração

células SW480 (1 × 10

4 células em 100 ul de meio isento de soro), que tinham sido transfectadas com NC ou Si-LIN28B, foram colocados na câmara de topo de placas de cultura Transwell (8 m; BD Biosciences, San Jose, CA). A câmara inferior foi preenchida com 600 ul de meio condicionado. Após 24 horas, as células que não migraram para a câmara inferior foram removidos a partir da superfície superior da membrana Transwell com um cotonete. As células migraram na superfície da membrana inferior foram fixadas, coradas com 0,1% de violeta de cristal e fotografada.

A viabilidade celular análise

SW480 ou HCT116 células, que haviam sido transfectadas tanto com o NC ou si- LIN28B, foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços a uma concentração de 1 × 10

4 células por poço. Depois de as células terem aderido às placas, que foram incubadas com diferentes concentrações de oxaliplatina (por exemplo, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 ug /mL; Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Jiangsu, China) para quatro horas e foram então transferidas para meio completo durante um período adicional de 20 horas. No ponto de tempo indicado, 10 mL de solução de CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) foram adicionados a cada poço, e as células foram incubadas durante 3 h a 37 ° C. A absorvância (A) foi registada a 450 nm utilizando um leitor de placas. A experiência foi realizada em triplicado, e a razão de inibição de células foi determinada utilizando a seguinte equação: (1 – grupo de teste do grupo A /controlo A) × 100%. O IC

50 (50% da concentração inibidora) valor foi calculado usando software (método LOGIT) específico.

A análise estatística

Um teste de log rank foi realizada para comparar as distribuições de sobrevivência e recorrência para os vários grupos de intensidade (0-2 vs. 3). A correlação entre a intensidade de coloração e a sobrevivência ou reincidência foi determinada de acordo com uma análise de qui-quadrado, onde os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Um intervalo de confiança de 95% foi calculado para confirmação da significância estatística.

Resultados

LIN28B foi regulada em carcinomas do cólon

Para examinar os papéis potenciais para LIN28B no câncer de cólon, nós primeira em comparação a expressão da proteína LIN28B entre 208 amostras de tumor e 8 amostras de mucosa normal não correspondido de um tissue microarray utilizando IHC. A intensidade da coloração de LIN28B foi marcado por dois patologistas que foram cegados à informação clínica. Consistente com relatórios anteriores [6], [16], LIN28B foi significativamente sobre-expressos em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais (Figura 1, p. 0,001).

IHC demonstraram que LIN28B foi marcadamente regulado positivamente em tecidos de tumor comparado com a mucosa normal, que demonstrou muito pouca expressão LIN28B. gráficos representativos são apresentados.

LIN28B superexpressão correlacionada com reduzida sobrevida do paciente e um alto risco de recorrência

Os dados de pacientes submetidos à cirurgia (TNM I-III, cirúrgica parafinado ressecado tecidos) foram ainda analisados ​​via testes de log rank para investigar a influência de LIN28B superexpressão na sobrevida dos pacientes e recorrência. Esta análise revelou uma correlação entre LIN28B coloração de baixa intensidade a partir de amostras de grau TNM I e tumores II e aumento da sobrevida do paciente (Mantel-Cox p 0,01; Breslow, p 0,01) e uma menor probabilidade de recorrência do tumor (Mantel-Cox p 0,01; Breslow p .. 0,01) (Figura 2)

(A) superior LIN28B intensidade de coloração da fase I, II e III cancros do cólon correlacionados com a sobrevivência reduzida paciente. (B) a expressão alta LIN28B estava relacionado com uma maior probabilidade de recorrência do tumor (p 0,01; teste logarítmico).

Em conjunto, nossos resultados revelam que a expressão LIN28B está intimamente relacionado com a sobrevida global paciente e recorrência de câncer de cólon.

LIN28B perda de função sensibilizados SW480 e HCT116 células a citotoxicidade mediada por oxaliplatina

let-7 membros da família supressor microRNA

tumor são conhecida por regular a quimio-sensibilidade [17], enquanto LIN28B promove malignidade, principalmente através da inibição

let-7

biogênese. Assim, buscou-se determinar se LIN28B poderia influenciar quimio-sensibilidade a oxaliplatina. Foi examinada a expressão LIN28B em três linhas de células de cancro de cólon por meio de RT-PCR e Western blot (Fig. 3A). células HCT116 e SW480 foram seleccionados para utilização nestas experiências, devido ao seu baixo nível de expressão elevado e Lin28, respectivamente. Oxaliplatina induziu citotoxicidade dependente da concentração nestas células (Fig. 3B). A IC

50 valor de oxaliplatina foi 6,23 ± 0,75 ug /ml para as células HCT-116, e esta foi aumentada em 30% para 10,7 ± 2,26 ng /mL nas células SW480. Esse achado sugere que as diferenças na expressão LIN28B podem servir para modular quimio-sensibilidade nas células do câncer de cólon. Para verificar esta hipótese, construída LIN28B específica siRNA e controlar RNA pequeno. A eficiência do Si-LIN28B foi determinada em ambas as linhas celulares (Fig. 4A-D), e, em seguida, uma análise de CCK-8 foi realizado a explorar as interacções entre o Si-LIN28B e oxaliplatina em células HCT116 e SW480. Os resultados indicaram um efeito sinérgico entre si-LIN28B e oxaliplatina (Fig. 3C-D), o que sugere que a segmentação de LIN28B podem ser capazes de sensibilizar células de cancro do cólon para a terapia de oxaliplatina.

(A) RT- PCR e análises de Western blot níveis de expressão LIN28B avaliadas em Caco2, SW480 e células HCT-116. células SW480 e HCT116 (B) foram plaqueadas em placas de 96 poços e foram incubadas com as concentrações indicadas de oxaliplatina. A viabilidade celular foi avaliada utilizando um kit de ensaio CCK-8 após 72 h de exposição para o controle de drogas ou diluente. IC

50 valores foram calculados após ajuste de curva utilizando o software XLfit. células (C-D) HCT116 e SW480 foram transfectadas com NC ou Si-LIN28B 24 h antes do tratamento oxaliplatina (IC

50 valor). A taxa inibidora, normalizados para NC, foi calculada usando a CCK-8 absorvância a pontos de tempo indicados. Os dados são representados como a variação média ± SE vezes (n = 3; teste t de Student).

(A-B) RT-PCR e análises de Western blot confirmou a eficiência de SH-LIN28B knockdown em células HCT116 e SW480. (C-D) Uma análise de qRT-PCR confirmou também a infra-regulação de ARNm LIN28B nestas células. Os dados são representados como a média ± SE. (N = 3; Estudante de

t

-teste)

regulação negativa do LIN28B reprimido a migração de células SW480

como LIN28B superexpressão foi correlacionada com a recorrência do tumor e sobrevida do paciente, o próximo procurou explorar se a expressão LIN28B influencia a migração de células de cancro do cólon. Nós derrubado expressão LIN28B utilizando siRNA, e a análise indicou que a supressão Transwell de LIN28B inibiu significativamente a migração de células SW480 (Fig. 5).

As células foram transfectadas com 50 nM de NC ou Si-LIN28B e eram deixadas migrar através de uma câmara de Transwell. gráficos representativos são apresentados.

Discussão

Vários genes stemness-relacionados, que são referidos genes como oncofoetal, são pensados ​​para promover a tumorigénese com a re-expressão em células somáticas. A presença de CD133

+ células-tronco cancerosas ou células iniciadoras de câncer pode explicar a metástase, recorrência e quimio-resistência do cancro do cólon [18], [19].

Deixe-7

está envolvido na regulação da renovação auto e tumorigenicidade de células iniciadoras de câncer de mama [20] e também é reprimida em células cancerígenas do cólon [15]. LIN28B superexpressão é conhecido por contribuir para a carcinogênese, bloqueando a biogênese de

let-7

, o que nos levou a avaliar se o equilíbrio entre LIN28B e tumor-supressora de promoção do tumor

let-7

foi alterada no cancro do cólon [21]. Descobrimos que a expressão LIN28B foi regulada em tecidos tumorais de cólon, e esta expressão correlacionada com a sobrevivência reduzida paciente e uma maior probabilidade de recorrência. Além disso, o silenciamento de LIN28B sensibilizados células cancerígenas do cólon a citotoxicidade induzida por oxaliplatina e inibiu a migração

in vitro

.

Lin28

é expressa em várias populações de células-tronco, embora a sua expressão em tecidos somáticos terminalmente diferenciadas é escassa. Recentemente, quando expressos em combinação com

OCT4

,

NANOG

e

SOX2, Lin28

foi mostrado para agir como um substituto para

c-Myc

para reprogramar fibroblastos somáticas humanas de pluripotência [22]. Como um homólogo de Lin28,

LIN28B

tem principalmente sido clonado a partir de carcinomas hepatocelulares, e a sua sobre-expressão foi mostrada para promover a proliferação de células cancerosas [2]. A ativação dos resultados LIN28B na redução da repressão da

let-7

alvos, tais como

HMGA2

,

Dicer1

[10],

KRAS

[23 ] e

c-Myc

, e a activação de vias de sinalização correspondente oncogénicos. Curiosamente,

LIN28B Comprar e seu regulador a montante

c-Myc

[12] também são alvos de

let-7

; consequentemente, uma

c-Myc-LIN28B-let-7

eixo, ou loop de feedback, que podem servir para reprimir o crescimento do tumor, podem existir. Assim, a perda de controle sobre este eixo pode acelerar o crescimento do tumor

Como mencionado anteriormente,

LIN28B

é regulada por vários fatores oncogênicos.; membros da

MYC

família, incluindo

C-Myc

,

N-Myc

e

MYCN

, pode ativar LIN28B, o que sugere que

LIN28B

é um importante alvo de

MYC

e pode explicar porque

LIN28B

pode substituir

c-Myc

para a reprogramação de células somáticas em pluripotência. O

c-Myc

fator de transcrição pode ser ativado pelo

Wnt /APC

via, que é desregulamentado no cancro do cólon [24].

APC

alterações genéticas, se não for herdada, representam as alterações moleculares mais adiantados durante o desenvolvimento do cancro colorectal, enquanto que as alterações estruturais da

myc, ras, p53

,

MCC

e

DCC

genes são considerados para representar eventos tardios [25]. Em resumo, os nossos resultados revelam a existência de uma preliminar

Wnt /APC Restaurant –

Myc Restaurant –

LIN28B Restaurant –

let-7

via na carcinogênese do cólon . Nós hipótese de que

Wnt /APC Restaurant –

Myc

ativação da via é o evento inicial e que o

LIN28B-let-7-c-Myc /LIN28B

ciclo de feedback acelera cólon carcinogênese. No entanto, mais estudos são necessários para verificar o papel deste ciclo de feedback na carcinogênese.

A metástase e recorrência são as principais razões para a diminuição na sobrevida global em pacientes com tumores malignos. Assim, é de grande interesse para ser capaz de prever a metástase do tumor e a recorrência numa fase precoce. Além disso, a previsão de recorrência do tumor na fase II /III pacientes podem orientar a quimioterapia adjuvante. Métodos melhorados para a identificação de pacientes fase II em um alto risco de recorrência [26], que se baseiam nas características únicas de cada tumor individual, pode resultar em milhares de vidas salvas cada ano. Além disso, as técnicas para a identificação de fase III, os doentes que estão em risco baixo para a recorrência da doença após a cirurgia pode poupar estes indivíduos do custo, o tempo e a toxicidade associada com quimioterapia [27]. Em nosso estudo, LIN28B intensidade de coloração ( 50%) correlacionado com a sobrevivência reduzida paciente. Importante, expressão LIN28B poderia prever a recorrência de TNM grau II /III tumores após a ressecção cirúrgica.

Enquanto este manuscrito estava em preparação, um estudo de King et al. informou que LIN28B promove a progressão e metástase do cancro do cólon, tanto

in vivo

[16] e

in vitro

através de

let-7

dependente e mecanismos independentes de [6]. Nossos dados são consistentes com estes resultados, e nós também sugerem que a detecção da expressão de LIN28B pode ajudar na determinação do regime adequado da quimioterapia adjuvante em pacientes com TNM grau II e III carcinomas do cólon.

Em conclusão, nossos dados sugerem um papel importante para

LIN28B

na carcinogênese do cólon. expressão LIN28B foi mostrado para prever a sobrevida do paciente, o que implica que

LIN28B

pode ser um alvo útil para novas terapias moleculares.