Sumário

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes, que regulam a expressão do gene pela repressão alvo de transcrição e tradução. Neste estudo mostramos que miRNA-23b (miR-23b) atua como um supressor de tumor no cancro da bexiga. A análise quantitativa por PCR em tempo real mostraram que o miR-23b é significativamente regulada negativamente em linhas celulares de cancro da bexiga e tecidos tumorais em comparação com células não-malignas e amostras de tecidos normais. Também demonstramos que a expressão de miR-23b tem um potencial para ser biomarcador de diagnóstico e prognóstico no câncer de bexiga. expressão de miR-23b alta é positivamente correlacionada com maior sobrevida global de pacientes com câncer de bexiga como revelado pela análise de Kaplan-Meier. análise ROC mostraram que a expressão de miR-23b pode distinguir entre tecidos normais e bexiga câncer. Além disso temos elucidado o significado biológico de miR-23b no cancro da bexiga. A sobre-expressão de miR-23b em células cancerosas da bexiga inibiu a proliferação celular e formação de colónias prejudicada. Fluorescência análise de separação de células activadas (FACS) revelou que a re-expressão de miR-23b em células cancerosas da bexiga induzida /G1 paragem do ciclo celular e apoptose enquanto G0 inibição da migração celular e invasão. Os ensaios de repórter de luciferase demonstrado que Zeb1, um regulador fundamental da epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), é um alvo directo de miR-23b no cancro da bexiga. Estes resultados mostram que a perda de miR-23b confere uma vantagem proliferativa e promove a migração de células de cancro da bexiga e invasão. Além disso, a re-expressão de miR-23b pode ser uma estratégia terapêutica benéfica para o tratamento de cancro da bexiga humano

citação:. Majid S, Dar AA, S Saini, Deng L, Chang I, K Greene, et ai. (2013) Funções MicroRNA-23b como um supressor tumoral regulando Zeb1 no cancro de bexiga. PLoS ONE 8 (7): e67686. doi: 10.1371 /journal.pone.0067686

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Março, 2013; Aceito: 20 de maio de 2013; Publicação: 02 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Majid et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa de Recursos dos Institutos Nacionais de Saúde através de números de subvenção RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, I01BX001123, VA Mérito Review and VA programa projeto. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o quarto tumor maligno mais comum nos Estados Unidos e uma das mais caro clinicamente gerenciar [1]. Mais de 90% dos tumores da bexiga são compostos de carcinoma de células transicionais (TCC) que surge a partir do epitélio de transição [2]. tumores da bexiga são classificados em duas categorias distintas: o músculo da bexiga invasivo do cancro não-muscular e [3], [4]. A maioria dos tumores (75-80%) apresentam-se como tumores de baixo grau papilares não invasivos que raramente, evoluir para se tornar letal, mas quase sempre se repetem. Este tipo de câncer é chamado de “superficial” câncer de bexiga e exige que a administração caro a longo prazo. O resto são tumores de alto grau musculares invasivos (-15%) que podem evoluir rapidamente para se tornar metastático e levar à morte [4]. fatores etiológicos envolvidos na carcinogênese da bexiga permanecem não identificados, e marcadores moleculares eficazes para a doença são limitadas.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes, que regulam a expressão do gene pela repressão alvo de transcrição e tradução. Vários estudos têm feito uma análise global de expressão miRNA em linhas de células humanas e encontraram tecidos e padrões de expressão de doenças específicas [5], [6]. Também há evidências crescentes de que os perfis de expressão de miRNA pode ser um indicativo do risco de doença e de carga. Assim, miARNs estão a ser avaliados como potenciais marcadores para auxiliar no diagnóstico e prognóstico de diferentes tipos de cancros [7], [8]. Vários miARNs humanos têm sido mostrados para ser desregulado no cancro da bexiga, incluindo o miR-1280, o miR-203, miR-125b e miR-133a [9], [10], [11], [12] e contribuir para o desenvolvimento e progressão da doença. Aqui nós relatamos que o miR-23b é significativamente regulada para baixo em tecidos câncer de bexiga e linhas celulares e que o nível de expressão elevado de miR-23b correlacionam-se positivamente com maior sobrevida global dos pacientes após a cirurgia. Além disso, nós examinamos o significado funcional de miR-23b e identificou Zeb1 como um alvo direto de miR-23b no cancro da bexiga. Pela primeira vez, este estudo mostra que miR-23b é um potencial biomarcador e supressor de tumor no cancro da bexiga que visam directamente oncogene Zeb1.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Cultura de Células

SV-HUC-1, células T24 e J82 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com protocolos de ATCC. Estas linhas de células de origem humana foram autenticadas pela DNA de curto em tandem repeat análise pela ATCC. Os experimentos com linhagens de células foram realizadas no prazo de 6 meses após a sua aquisição /reanimação. células SV-HUC-1 foram cultivadas em Meio F-12K (ATCC), com 10% de FBS. As células T24 foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com FBS a 10% e as células J82 foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com FBS a 10%. As células foram mantidas numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C.

Os plasmídeos, os precursores e transfecção

sondas TaqMan e precursores para HSA -miR-23b e controlo negativo pré-miR foram adquiridos a Applied Biosystems (Foster City, CA). PMIR-GLO luciferase dupla miARN alvo Vector de Expressão foi adquirido a Promega. microARN-23b, de controlo e ARNsi-microARN foram usadas na concentração de 50 nM e Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foi utilizado para todas as transfecções.

Extração de RNA

miARN e o ARN total foi extraído a partir de linhas celulares usando um miRNeasy Mini Kit e um Kit RNeasy Mini (Qiagen). miRNAs a partir de amostras clínicas foram extraídos através de técnicas de captura a laser microdissecção com um kit miRNeasy FFPE (Qiagen).

amostras clínicas Humanos

As amostras clínicas foram obtidos a partir dos Assuntos de Veteranos de São Francisco (VA) Centro Médico . consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos (Número de aprovação: H9058-35751-01).

Quantitative PCR em tempo real

miRNAs maduro foram ensaiadas utilizando TaqMan microARN Ensaios de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems). Todas as reações RT, incluindo controles não-modelo e RT menos controles, foram executados em um rápido Tempo real PCR System 7500 (Applied Biosystems). As concentrações de RNA foram determinadas com um NanoDrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). As amostras foram normalizadas para RNU48 (Applied Biosystems). Os níveis de expressão do gene foram quantificados usando o 7500 Rápido Tempo real Software sistema de detecção Sequence (Applied Biosystems). Comparativa PCR em tempo real foi realizada em triplicado, incluindo controles não-modelo. A expressão relativa foi calculada usando a Ct comparativa.

viabilidade celular e Clonability Ensaios

A viabilidade celular foi determinada em 24, 48 e 72 h, utilizando o CellTiter 96 Aqueous One Solution kit de Proliferação Celular Assay ( Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância foi medida a 490 nm utilizando SpectraMAX 190 (Molecular Devices). Os dados são apresentados como valor médio para ensaios em triplicado em comparação com o controlo negativo. Para o ensaio de formação de colónias, as células foram semeadas a baixa densidade (1000 células /prato) e deixou-se crescer até apareceram colónias visíveis. Em seguida, as células foram coradas com Giemsa e as colónias foram contadas.

migração e invasão Ensaios

Cytoselect 24 poços de migração celular e ensaio de invasão kits (Cell Biolabs, Inc) foram utilizados para a migração e invasão os ensaios de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células T24 e J82 transfectadas com miR-Pré precursor de miARN ou um controlo negativo foram colhidas 72 horas após a transfecção e re-suspensas em soro isento de Opti-MEM. As células (10 x 10

4 por 300 ul de meios sem soro) foram adicionadas à câmara superior e a câmara inferior foi preenchida com 500 ul de meio contendo 10% de FBS. As células foram incubadas durante 16 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. Após 16 horas, as células que não migraram /não-invasoras foram removidos a partir do lado superior do trans-inserções bem filtro de membrana utilizando um cotonete. Migraram /células invadidas no lado inferior foram

imunotransferência

A proteína foi isolada a partir de confluentes (70-80%) de placas coradas e a absorvância foi lida a 560 nm de acordo com o protocolo do fabricante. células cultivadas utilizando o M-PER de mamíferos Proteína Reagente de Extracção (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) seguindo as instruções do fabricante. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford. Quantidades iguais de proteína foram resolvidos em géis de poliacrilamida 4-20% de dodecil sulfato de sódio (SDS) e transferido para uma membrana de nitrocelulose por transferência do gradiente de voltagem. As manchas resultantes foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% e sondado com anticorpos específicos. As manchas foram então incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase apropriados e visualizada utilizando quimioluminescência aumentada (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

O esgotamento dos Zeb1 Usando pequeno RNA de interferência (siRNA)

câncer de bexiga T24 As células foram plaqueadas 24 horas antes da transfecção. Em 40 a 50% de confluência, as células foram transfectadas utilizando Lipofectamine-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com ARNsi duplexes específicos para Zeb1 humana (SR304746; Tecnologia Origene, Rockville, MD) ou controlo não-silenciamento (NS) ARNsi durante 72 horas . Inicialmente, dois conjuntos diferentes de ARNic em cadeia dupla foram testadas para avaliar a especificidade de alvo e eficiência knockdown. Um ARNic em cadeia dupla foi utilizado para experiências adicionais na concentração de 50 nM.

Luciferase Reporter Assay

Um pmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão foi usado para a 3′-UTR ensaios de luciferase (Promega, Madison , WI). O oncogene alvo de miRNA-23b foi selecionada com base em microRNA on-line https://www.microrna.org/microrna/home.do banco de dados alvo. As sequências dos iniciadores para o tipo selvagem 3’UTR foram: Atacante 5 ‘CGCGGCCGCTAGTATTATGTTTTTTAAAATGTGAGT 3’ e Reverse 5 ‘CTAGACTCACATTTTAAAAAACATAATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. Para o mutante 3’UTR, as sequências iniciadoras foram: para a frente 5 ‘CGCGGCCGCTAGTATCGTGCGCACTAAGGCTCACTT 3’ e inverso 5 ‘CTAGAAGTGAGCCTTAGTGCGCACGATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. Para o ensaio lucifease, células T24 e J82 foram cotransfectadas com HSA-miR-23b e pmirGLO Dual-Luciferase miRNA vetores de expressão de destino com o tipo selvagem ou uma sequência alvo mutante usando Lipofectamine 2000. actividades de luciferase de pirilampo foram medidos usando Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI), 18 h depois da transfecção e os resultados foram normalizados com a luciferase da Renilla. Cada plasmídeo repórter foi transfectado pelo menos três vezes (em dias diferentes) e cada amostra foi ensaiada em triplicado.

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism 5 e MedCalc versão 10.3.2 . Todos os dados quantificados representa uma média de amostras em triplicado, pelo menos, ou como indicado. As barras de erro representam o desvio padrão da média. Todos os testes foram realizados dois atados e

p

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. curvas de funcionamento do receptor (ROC) foram calculados para determinar o potencial de miR-23b para discriminar entre amostras malignas e não-malignas. Para análise de sobrevivência, de Kaplan-Meier (teste log-rank) análise foi realizada.

Resultados

miR-23b Expression é empobrecido em Bexiga tumores e câncer linhas celulares

Preliminar microARN dados de microarray revelou que o miR-23b foi altamente regulados negativamente em linhas celulares de cancro da bexiga em comparação com a linha celular de SV-HUC1 não-maligno. Nós validados os dados de microarray de miARN-quantitativa por RT-PCR (MIR qRT-PCR), análise e resultados confirmaram que o miR-23b foi regulada negativamente em linhas celulares de cancro da bexiga J82, T24 em relação à linha de células não-malignas SV-HUC1 (Figura 1A) . Para examinar a relevância biológica de miR-23b, a sua expressão foi analisada em laser de capturado microdissectados (LCM) tecidos tumorais de bexiga humana e em comparação com tecidos de controle pareados normais. A expressão de miR-23b foi encontrado para ser significativamente regulada para baixo em todas as amostras de tumor, em comparação com as suas amostras normais correspondentes (Figura 1A). Promover a expressão de miR-23b em tecidos normais correlacionados com a da linha de células não-malignas e que de tumor correlacionada com as linhas celulares de cancro (Figura 1A), indicando que estas linhas celulares de cancro representam um sistema modelo para analisar a função de miR-23b no cancro da bexiga. Estes resultados também sugerem um papel supressor tumoral putativo para miR-23b no cancro da bexiga.

a) Análise RT-PCR quantitativa de miR-23b em linhas celulares e em amostras de tecido microdissecados capturado por laser correspondentes. B) Proliferação de células J82 e T24 após transfecção de miR-23b foi significativamente reduzido em comparação com o miR-cont. C) miR-23b sobre-expressão inibe significativamente formando colónia capacidade das células de câncer de bexiga.

MicroRNA-23b Regulamenta o cancro de bexiga proliferação celular e Colony Formação

Para determinar o significado funcional miR-23b sobre a expressão no cancro da bexiga, nós transfectadas linhas celulares de cancro da bexiga J82 e T24 com precursores de miR-23b. A expressão ectópica de miR-23b diminuíram significativamente a proliferação celular em comparação com células que expressam o miR-cont (Figura 1B). As células transfectadas de miR-23b teve baixa capacidade de formação de colónias como o número de focos de células que expressam o miR-23b foi diminuída quando comparado com o miR-cont células (Figura 1C) transfectadas. Estes resultados indicam efeito anti-proliferativo de miR-23b no cancro da bexiga.

miR-23b Aciona paragem do ciclo celular e induz a apoptose em células de cancro da bexiga

análise

FACS (células ativadas por fluorescência) revelados que re-expressão de miR-23b conduziu a um aumento significativo no número de células na fase G0 /G1 do ciclo celular (59% para 67%), enquanto que a população de S-fase diminuiu de 18% para 9%, em J82 células (Figura 2A). Resultados semelhantes foram observados em células T24 com um aumento na população de células G0 /G1 (de 70% a 84%) e uma diminuição da população da fase S (15% a 5%) (Figura 2B). Assim, sugerindo que o miR-23b desencadeia prisão /G1 G0 em miR-23b células transfectadas em comparação com miR-cont. A análise FACS para a apoptose foi realizada utilizando Anexina-V-FITC-7-AAD corante. A percentagem de células apoptóticas totais (início apoptótica + apoptótica) foi significativamente aumentada (4% a 19%) em resposta a miR-23b sobre-expressão em comparação com CONT-miR com uma correspondente diminuição de 14% na população de células viáveis ​​em células J82 (Figura 2C). Em células T24, um aumento (4% a 9%) em células apoptóticas foi observada com miR-23b sobre-expressão em comparação com miR-cont (Figura 2D). Estes resultados indicam um papel supressor de tumor de miR-23b no cancro da bexiga.

imagens representativas de análise FACS que mostram miR-23b A-B) sobre-expressão induz a paragem do ciclo celular G0 /G1 na J82 e células T24 com um decréscimo correspondente nas células em fase S. C-D) miR-23b sobre-expressão induz a apoptose em células J82 e T24 com uma diminuição concomitante no número viável de células. Os dados são mostrados a partir de experiências em triplicado ± SD.

miR-23b Suprime migração celular do cancro de bexiga e Invasion

Over-expressão de miR-23b tinha efeitos anti-migratórias e anti-invasivos em linhas celulares de cancro da bexiga. Menos de absorvância foi observado a 560 nm com miR-23b transfectadas células cancerosas da bexiga em comparação com CONT-miR no ensaio de migração (Figura 3A) e miR-23b sobre-expressão também reduziu de forma significativa a capacidade de invasão de células cancerosas da bexiga (Figura 3B).

A) ensaios de migração de células J82 e T24 transfectadas com miR-23b. B) imagens representativas de ensaio de migração. C) ensaios de invasão mostram uma diminuição significativa no número de invadir células J82 e T24 transfectadas com miR-23b. D) imagens representativas de ensaio de invasão.

Oncogene Zeb1 é um alvo direto de miR-23b

Zeb1 foi relatado para ser uma importante molécula que dirige a motilidade celular câncer de bexiga. Utilizando um banco de dados on-line alvo microARN que encontramos Zeb1 oncogene ser um alvo potencial de miR-23b com um local de ligação 3 ‘UTR complementar para a sequência de semente de miR-23b (Figura 4A). Foi realizada análise de Western com as células transfectadas miR-23b e descobriram que o miR-23b atenuou a expressão da proteína em comparação com Zeb1 cont miR-em ambas as células de cancro da bexiga J82 e T24 (Figura 4B). Para verificar se uma interação direta está envolvido entre miR-23b e sua oncogene alvo Zeb1, foram realizados ensaios de repórter de luciferase. Descobrimos que a co-transfecção de miR-23b, juntamente com o tipo selvagem da 3’UTR Zeb1 causou um decréscimo significativo na actividade da luciferase comparado com os controlos (Figura 4C). Estes resultados sugerem que miR-23b atinge diretamente oncogene Zeb1. Sequências no Zeb1 3’UTR ligação

A) cortesia miR-23b. B) Análise de Western blot mostra que miR-23b reprime tradução de proteína Zeb1 em células de cancro da bexiga J82 e T24. ensaios C) luciferase que mostram diminuição da atividade repórter após co-transfecção, quer do tipo selvagem ou Zeb1-3’UTR mutante com miR-23b em células J82 e T24. Mut- Mutante Zeb1 3’UTR sequência.

O esgotamento dos Zeb1 por interferência de RNA imita Reconstituição miR-23b no cancro da bexiga

experimentos fenocópia também foram realizadas pela inibição siRNA de Zeb1 (Figura 5). Nós validado dois conjuntos de siARN (Si-Si-1 e 2), que resultou em significativa knockdown de Zeb1 ao nível da proteína (Figura 5A) em células cancerosas da bexiga T24 e utilizado um ARNic em cadeia dupla para outras experiências a concentração de 50 nM. Os nossos resultados mostraram que a inibição de siRNA Zeb1 causou uma redução da viabilidade celular (Figura 5B), a capacidade migratória e invasiva (Figura 5C-D) de células cancerosas T24. Observou-se também que a inibição de siRNA Zeb1 aumentou aproximadamente 7% da fracção de apoptose de células em células transfectadas Zeb1 siRNA em comparação com 1% no controlo não específico (Figura 5E). Estes resultados sugerem que a depleção de siRNA de imita Zeb1 o efeito do miR-23b sobre-expressão no cancro da bexiga.

A) níveis de proteína Zeb1 foram significativamente atenuada com 50 duplexes nM de siRNA (Si) em comparação com um não-silenciamento siRNA duplex (Con) em células T24. B) Efeito sobre a proliferação celular. C-D) Efeito sobre a migração e invasão das células cancerosas da bexiga T24. Ensaio E) A apoptose mostrando indução de apoptose após Zeb1 knockdown por siRNA em células T24. * P . 0,05

Diagnóstico e significado prognóstico de miR-23b no cancro da bexiga

Para determinar se a expressão de miR-23b pode discriminar entre tumores da bexiga e tecidos normais, e prever paciente sobrevivência, foi realizada a análise ROC e análise de Kaplan-Meier. Os dados demográficos clínicos da coorte de paciente estão resumidos na Figura 6A. A área sob a curva ROC (AUC) de 0,885 (P 0,0001; IC de 95% = 0,75-0,97) (Figura 6B) sugeriu que a expressão de miR-23b pode discriminar entre os tecidos malignos e não malignos e potencialmente ser utilizada como um diagnóstico marcador para o câncer de bexiga. Para determinar se miR-23b tem qualquer significado prognóstico, dividimos tecidos de pacientes em baixa (/N 1,2 vezes) e alta (expressão T /N 1,2 vezes) grupos de miR-23b e realizada análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. A análise de Kaplan-Meier mostrou que o grupo-23b miR alta tinham significativamente maior probabilidade de sobrevida global em comparação com o grupo de baixo miR-23b (Logrank teste p 0,03, hazard ratio (HR) = 4,3; IC95% = 2-14) ( A Figura 6C). Estes achados sugerem que miR-23b é potencialmente um marcador diagnóstico e prognóstico para câncer de bexiga que são necessários estudos sobre amostras adicionais para fortalecer esses resultados.

A) características clínico-patológicos do grupo de pacientes. B) A análise da curva ROC que mostra a capacidade de expressão de miR-23b para discriminar entre amostras de tecido maligno e não-malignas. análise C) de Kaplan-Meier para a sobrevida global com base na expressão de miR-23b.

Discussão

Os microRNAs podem ter efeitos de grande escala por regular a expressão de uma variedade de genes durante o desenvolvimento de mamíferos e carcinogênese. Como resultado, a compreensão dos mecanismos e da função dos miRNAs individuais tem gerado grande interesse. Apesar da evidência acumulada sobre o papel dos vários miRNAs em câncer, muito pouca informação está disponível sobre a função dos miRNAs no cancro da bexiga, e apenas alguns alvos miRNA foram identificados.

Aqui nós relatamos que o miR-23b para ser regulada para baixo em tecidos de cancro da bexiga em comparação com tecidos normais adjacentes e este foi também observada no cancro da bexiga e linhas de células não-malignas. Nossos dados sugerem um potencial papel diagnóstico /prognóstico para miR-23b na previsão de sobrevida global e discriminatória maligna de tecidos normais e indica que miR-23b é um supressor de tumor no cancro da bexiga.

Para determinar a relevância biológica de miR -23b no cancro da bexiga, realizamos ensaios funcionais. A expressão ectópica de miR-23b, resultou na inibição significativa da proliferação de células, a formação de colónias, a migração /invasão e a indução de paragem do ciclo celular e a apoptose em células cancerosas da bexiga. Expressão de miR-23b no cancro é um pouco controverso porque foi encontrada para ser regulada para cima e oncogénica em cancro do rim onde causou repressão de translação do gene supressor de PTEN tumor [13] ou sub-regulada e um supressor de tumor no cancro da próstata onde ele atinge diretamente Src quinase e oncogenes Akt [14], enquanto que nosso estudo indica que é um supressor de tumor no cancro da bexiga. Estudos anteriores demonstraram que microARNs são altamente específica do tecido e que pode actuar como supressor de tumores ou oncogenes [15], [16]. MicroRNAs possuem várias características que os tornam candidatos atraentes como novos biomarcadores de prognóstico e poderosas ferramentas para o diagnóstico precoce do câncer [17]. Neste estudo, descobrimos que miR-23b foi preditivo de sobrevida global de tal forma que os pacientes com maior expressão de miR-23b teve maior sobrevida global em comparação a pacientes com baixa expressão de miR-23b. expressão microRNA-23b também foi capaz de distinguir maligna de tecidos normais, indicando a importância de diagnóstico de miR-23b no cancro da bexiga, embora sejam necessários estudos adicionais com uma coorte maior de amostras de tecido.

Um obstáculo importante à compreensão da função miRNA tem sido a relativa escassez de alvos experimentalmente validadas. Para determinar os efetores de miR-23b, algoritmos in silico e análises funcionais identificados Zeb1 como seu alvo. Nós demonstramos que o miR-23b tem como alvo directamente o 3 ‘UTR de Zeb1, como a sua sobre-expressão foi associada à supressão da actividade da luciferase. Além disso, observou-se uma significativa diminuição da regulação do nível de proteína Zeb1 depois de miR-23b sobre-expressão, indicando regulação pós-transcricional de Zeb1 via visando a sua 3’UTR. ensaios funcionais realizados após a depleção Zeb1 por siRNA transfecção imitou os resultados obtidos com a sobre-expressão de miR-23b. Estes resultados indicam que os efeitos de miR-23b no cancro da bexiga são, em parte, por direccionamento directamente Zeb1, embora outros alvos também podem estar envolvidos uma vez que pode ter como alvo microARNs milhares de genes. Zeb1 é um dos reguladores cruciais da epitelial para mesenquimal transição (EMT) [18] e foi demonstrado desempenhar um papel importante na invasão e metástases de tumores epiteliais [19]. A relevância de proteínas zeb para a progressão do tumor tenha sido estudada em vários cancros humanos. Expressão de ZEB1 correlacionada com um fenótipo agressivo em vários tipos histológicos de carcinoma do endométrio e foi detectado no compartimento de sarcomatoso carcinossarcoma do endométrio [20]. No cancro do cólon, ZEB1 foi expressa na frente invasiva de tumores, em associação com a perda transitória de membranas basais [21]. expressão recíproco de ZEB1 e E-caderina foi também observada no carcinoma do pulmão de células não pequenas [22]. A correlação direta entre a imunorreatividade ZEB1 e grau Gleason tem sido relatada em tumores de próstata humanos [23] e no cancro da bexiga, ZEB1 tem sido relatada a ser sobre-expresso e responsável pela motilidade reforçada [18]. No presente estudo, verificou-se que a sobre-expressão de miR-23b resultou na supressão do oncogene Zeb1 nas células de cancro da bexiga, sugerindo que miR-23b pode mediar EMT, representando, assim, um possível mecanismo pelo qual ela afeta a migração câncer de bexiga e invasão.

em conclusão, este estudo mostra que miR-23b tem significado diagnóstico /prognóstico e directamente como alvo oncogênico Zeb1 no cancro da bexiga. miR-23b sobre-expressão resultou na supressão da proliferação cancro da bexiga e invasão celular, indução de apoptose e ciclo celular. Finalmente, este estudo indica que miR-23b sobre-expressão pode ser uma estratégia terapêutica útil para o tratamento de cancro da bexiga.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência com a preparação do manuscrito.