Abstract
A angiogênese ocorre durante o crescimento do tecido, desenvolvimento e cicatrização de feridas. Também é necessário para a progressão do tumor e representa um alvo para intervenção terapêutica racional. NBM-t-BMX-OS01 (BMX), derivado a partir do semi-síntese de osthole, um ingrediente activo isolado a partir de erva chinesa
Cnidium monnieri
(L.) Cuss., Foi recentemente mostrado para melhorar a aprendizagem e memória em ratos . Neste estudo, foram caracterizadas as atividades anti-angiogénicos da NBM-T-BMX-OS01 (BMX), em um esforço para desenvolver novos inibidores para suprimir o crescimento angiogênese e tumor. BMX inibida factor de crescimento endotelial (VEGF) proliferação induzida vascular, migração e formação do tubo endotelial em células endoteliais umbilicais humanas (HUVEC). BMX microvascular induzida por VEGF também atenuada brotando anéis de aorta
angiogênese induzida por células ex vivo câncer reduzida HCT116 colorectal Comprar e
in vivo
. Além disso, BMX inibiram a fosforilação de VEGFR2, FAK, Akt e ERK em células HUVEC expostos a VEGF. BMX também foi demonstrado inibir a proliferação de células HCT116 e para suprimir o crescimento de xenoenxertos subcutâneos de células HCT116
in vivo
. Tomados em conjunto, este estudo fornece provas de que modula BMX remodelação de células endoteliais vasculares e leva à inibição de angiogénese tumoral. Estes resultados também suportam o papel de BMX como um potencial candidato a medicamento e garante o desenvolvimento clínico para o tratamento de câncer
Citation:. Yang HY, Hsu YF, Chiu PT, Ho SJ, Wang CH, Chi CC, et ai. (2013) Anti-Cancer Atividade de um derivado Osthole, NBM-T-BMX-OS01: Segmentação de Crescimento Endotelial Vascular Receptor do Factor de Sinalização e angiogênese. PLoS ONE 8 (11): e81592. doi: 10.1371 /journal.pone.0081592
editor: Masuko Ushio-Fukai, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de junho de 2013; Aceito: 15 de outubro de 2013; Publicação: 27 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela bolsa do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan [NSC98-2320-B-038-007]; conceder [99TMU-WFH-04/02] a partir do fang Hospital Taipei Medical University-Wan, Taipei, Taiwan; e conceder [LSH-2012-04] no Hospital Landseed, Taoyuan, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. NatureWise Biotech Medicals Corporation é desenvolvedora e detentora da patente em BMX e seus derivados em vários países. Nome patente: combinações e derivados dos mesmos para a inibição da histona deacetilase cinâmico. Número de patente: US7994357. Shiau-Jing Ho, Chi-Han Wang, Chih-Chin Chi, Cheng-Feng Lee e Ying-Shiuan Li são empregados por NatureWise Biotech Medicals Corporation. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
A angiogênese é um processo complexo pelo qual nova vasos são formados a partir de vasculatura preexistente. Ele não só contribui para diversos processos fisiológicos, mas também desempenha um papel importante na progressão tumoral e a disseminação metastática de tumores [1] – [3]. vascularização do tumor geralmente é correlacionada com mau resultado. angiogénese iniciada pelo tumor tem sido, assim, um alvo atraente para o desenvolvimento de terapias [4] anti-cancro. Durante o crescimento inicial do tumor avascular, as células tumorais superar a limitação da distância de difusão de vasos sanguíneos nas proximidades e hipóxico tornou. O equilíbrio entre a sinalização angiogênica e anti-angiogênico se desloca para formação de vasos sanguíneos [5]. Este interruptor angiogênico então ativa uma série de transcrições de genes e inicia a angiogênese [6]. Numerosos factores angiogénicos, incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [7], factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) [8], [9], o factor de crescimento epidérmico (EGF) e angiopoietina [10] tem sido implicada na angiogénese tumoral. Entre estes reguladores angiogénicos, VEGF-A, um membro da família do VEGF, é o mediador mais crítico e específico que promove a angiogénese [11], [12]. O VEGF-A é necessária para a quimiotaxia e diferenciação de células endoteliais, proliferação de células precursoras endoteliais, a vasculogénese e a remodelação angiogénica [13]. As respostas celulares ao VEGF-A são mediados pela tirosina cinase do receptor VEGFR2 (também conhecido como KDR ou Flk-1) na superfície de células endoteliais [14]. A activação de VEGFR2 gira sobre as cascatas de sinalização, incluindo cinase regulada por sinal extracelular (ERK), Akt (também conhecida como proteína-quinase B), quinase de adesão focal (FAK) e as cinases da família Src [15]. A via de sinalização de Akt regula a migração de células endoteliais, proliferação e apoptose [16]. via ERK activada por VEGF tem sido implicada em diversas actividades celulares incluindo a proliferação, a diferenciação, a motilidade celular e sobrevivência [17]. FAK também contribui para a malignidade de tumores [18]. Por estas razões, o VEGF e VEGFR2 são reconhecidas como alvos atraentes para uma intervenção terapêutica do cancro [19]. Muitas estratégias para inibir a sinalização de VEGF estão actualmente a ser avaliado em ensaios clínicos. Estes incluem receptores solúveis VEGF que sequestram [20], anticorpos dirigidos contra VEGF ou VEGFR [21], e inibidores de moléculas pequenas de VEGFR2 [22]. Além disso, alguns inibidores de pequenas moléculas tais como sorafenib e sunitinib já foram aprovados pelos Estados Unidos Food and Drug Administration para o tratamento de tipos específicos de câncer [23].
Cnidium monnieri
(L. ) Cuss. tem sido amplamente utilizada na medicina oriental para melhorar a imunidade e para aliviar a hepatite. Osthole, um componente bioactivo extraído das sementes de
Cnidium monnieri
(L.) Cuss., É, assim, espera-se que possuem actividades imunomoduladoras. Estudos recentes também demonstraram que osthole possui neuroprotectores [24], [25] hepatoprotector, anti-diabéticos [26], e anti-cancro actividades [27], [28]. amplo espectro de osthole Dado de actividades biológicas, que parece ser um composto de chumbo promissor para a descoberta de medicamentos. Recentemente, NBM-t-BMX-OS01 (BMX) (Fig. 1), um derivado de semisynthesized osthole, foi identificado como um inibidor da histona desacetilase potente e foi mostrada para aumentar a aprendizagem e memória em ratos [29]. Num esforço para descobrir inibidores de angiogénese de tumor, que assim avaliadas as propriedades anti-angiogénicas de BMX. Neste estudo, foi demonstrado que BMX inibiu a proliferação induzida por VEGF de células, migração, e a formação do tubo em células endoteliais umbilicais humanas (HUVEC). fosforilação induzida por VEGF de VEGFR2, Src, ERK, Akt e FAK também foram suprimidos em HUVEC expostos a BMX. Por utilização de células de cancro colo-rectal HCT116 modelo de xenoenxerto de angiogénese, BMX Foi ainda demonstrado para suprimir a angiogénese associada ao tumor. Além disso, BMX inibiu significativamente a proliferação de células de cancro colo-rectal HCT116 e suprimiu o crescimento tumoral num modelo de tumor de xenoenxerto. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem o potencial de BMX como um agente terapêutico com dupla atividade contra ambos proliferação do tumor e angiogênese.
Materiais e Métodos
Reagentes
3 – [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), azul de toluidina O, e forma McCoy5A eram da Sigma (St. Louis, MO). Meio 199 (M199), soro fetal de bovino (FBS), e todos os reagentes de cultura celular foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Os anticorpos contra CDK4, VEGFR2, VEGFR2 fosforilada em tirosina 1175 (Y1175), VEGFR2 fosforilada em tirosina 1214 (Y1214), ERK1 /2, ERK1 /2 fosforilada na treonina 202 /tirosina 204 (T202 /Y204), Akt, Akt fosforilada na serina 473 (S473), e FAK FAK fosforilada na tirosina 397 (Y397), Src Src e fosforilado em tirosina 416 (Y416) foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA). Os anticorpos específicos para a p21 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra o GAPDH, α-tubulina, survivina e cyclinD1 e anti-rato IgG e de anticorpos conjugados com peroxidase anti-coelho foram adquiridos a GeneTex Inc. (Irvine, CA). O kit de detecção de quimioluminescência aumentada era de GE Healthcare (Little Chalfont, Reino Unido). Proliferação de Células kit de ensaio de ELISA, BrdU foi adquirida a partir de Roche (Indianapolis, IN). Todos os materiais para imunotransferência foram adquiridos a partir de GE Healthcare (Little Chalfont, Reino Unido). Todos os outros produtos químicos foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO).
NBM-T-BMX-OS01 (BMX)
BMX, (
E
) -2 – (4-Metoxibenziloxi) -3-prenil-4-metoxi-
N
-hydroxycinamide, foi fornecida por NatureWise Biotech Medicals Corporation (Taipei, Taiwan), e as suas purezas ( 99%) foram confirmados por
análise de RMN-1H e HPLC.
1H RMN foram registados num espectrómetro Bruker Avance DRX-500 MHz com transformada de Fourier à temperatura ambiente.
RMN de 1H (DMSO
d
6
, 500 MHz) δ: 7,70 (1H, d,
J
= 16,0 Hz), 7,46 (1H, d,
J
= 8,5 Hz), 7,40 (2H, d,
J
= 8,5 Hz), 6,97 (2H, d,
J
= 8,5 Hz), 6,87 (1H , d,
J
= 8,5 Hz), 6,38 (1H, d,
J
= 16,0 Hz), 5,11-5,05 (1H, m), 4,65 (2H, s), 3,82 (3H, s), 3,78 (3H, s), 3,28 (2H, d,
J
= 7,0 Hz), 1,64 (3H, s), 1,60 (3H, s). Anal. HPLC
t
R = 9,57 min (pureza 99,3%). Pureza por HPLC analítica UV foi avaliada usando um sistema LC-JASCO 2000Plus e o método que se segue. Para o método a 210 nm, uma coluna Phenomenex Luna 5 m, de 250 mm × 4,60 milímetros C18 (2) coluna foi usado com uma taxa de fluxo de 1,0 mL /min e uma fase móvel de metanol /água (v /v = 80:20 ) ao longo de 30 min.
Ética declaração
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. Os protocolos a seguir descritos foram aprovados pelo Taipei University Medical Care Laboratory Animal e Comitê de Uso (Permit Number: LAC-100-0097). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
cultura celular
células vasculares umbilicais Humanos endoteliais (HUVECs) foram obtidos a partir da Colecção Bioresource e Centro de Pesquisa ( Hsinchu, Taiwan). As células foram mantidas em meio M199 contendo suplemento vascular crescimento de células endoteliais (ECGS) (Millipore), 10% de FBS, 5 U /ml de heparina, 20 mM de HEPES, 100 U /ml de penicilina G, e 100 ug /ml de estreptomicina numa atmosfera humidificada 37 ° C incubadora. A linha celular de cancro colo-rectal HCT116 foi obtida a partir da Colecção Bioresource e Research Center (Hsinchu, Taiwan). As células foram mantidas em McCoy5A contendo 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina G, e estreptomicina 100 ug /ml numa incubadora humidificada a 37 ° C.
A viabilidade celular ensaio
A viabilidade celular foi medido pelo ensaio colorimétrico de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) como descrito anteriormente [30]
Lactato desidrogenase (LDH) ensaio de libertação.
fuga de LDH foi medida para quantificar a citotoxicidade com um kit de ensaio de citotoxicidade CytoTox96 não radioactivo (Promega). Os sobrenadantes da cultura foram analisadas com base em orientações do fabricante. A absorvância foi medida a 490 nm num leitor de microplacas. O tampão de lise adicionado durante 10 min foi usada como um controlo positivo para a necrose de células completas. Os dados foram então calculada como a percentagem de grupo tratado com tampão de lise.
ensaio de proliferação celular (ensaio de incorporação de BrdU)
HUVECs (2 × 10
4 por poço) foram semeadas em placas de 96 Bem placas de cultura de tecido e incubou-se durante 24 h. As células foram então fome em meio M199 contendo 2% de FBS na ausência de suplementos de crescimento de células endoteliais durante mais 16 h. Depois de fome, as células foram pré-tratadas durante 30 min com várias concentrações de BMX, seguido de estimulação com VEGF (20 ng /ml) durante mais 24 h. A proliferação celular foi então determinada usando um ELISA de Proliferação Celular, BrdU (colorimétrica) Kit (Roche) com base na detecção colorimétrica da incorporação de BrdU, de acordo com as instruções do fabricante.
análise de citometria de fluxo
as HUVECs foram deixados em jejum com 2% de FBS M199 na ausência de suplementos de crescimento de células endoteliais durante 16 h. As células foram então incubadas com BMX nas concentrações indicadas, durante 30 minutos, seguido pelo tratamento com VEGF (20 ng /mL) durante mais 24 h. No final das experiências, as células apoptóticas foram detectadas por iodeto de propídio (PI) e anexina V rotulagem-FITC, como descrito anteriormente [31]. A dupla marcação foi realizada a 37 ° C, por tratamento de células com IP (50 ug /ml) e anexina V-FITC (2 ug /ml) durante 15 min no escuro.
ensaio de migração zero Ferida
Depois de fome em meio M199 contendo 2% de FBS durante 16 horas, HUVECs monocamada foram feridos por coçar com pontas de pipeta e lavadas com PBS. As células foram então tratadas com várias concentrações de BMX na ausência ou na presença de VEGF (20 ng /mL) durante mais 16 h. As células foram fotografadas usando microscópio de contraste de fase com câmera digital em 0 h e 16 h após o tratamento VEGF. A taxa de migração celular foi determinada por contagem do número de células que migraram sob um microscópio de contraste de fase invertida (Nikon, Japão).
Migração ensaio Transwell ensaio de invasão
foi feito como [32 descrito anteriormente ]. Resumidamente, a face inferior do filtro na placa de Transwell (Corning, NY, EUA) foi revestido com 0,2% de gelatina. As câmaras inferiores foram cheias com meio M199 contendo FBS a 2% na presença de VEGF (20 ng /ml) e células HUVEC (10
4 células por poço) em 200 meio uL M199 (sem factores de crescimento) foram semeadas no topo Chambers. A câmara superior continha veículo ou várias concentrações de BMX. As células foram deixadas migrar durante 16 h. As células que não migraram (sobre o lado superior do filtro) foram raspados com um cotonete de algodão, e as células migradas foram fixadas e coradas com 0,5% azul em paraformaldeído a 4% de toluidina. As células foram fotografadas e quantificadas por contagem do número de células coradas num microscópio de contraste de fase invertida (Nikon, Japão).
Matrigel formação do tubo de ensaio
O ensaio de formação do tubo foi efectuada como descrito anteriormente [32]. Matrigel, uma matriz de membrana basal (Becton Dickinson, Mountain View, CA), foi polimerizado a 37 ° C durante 30 min. HUVEC suspensas em meio M199 contendo 2% de FBS na presença ou na ausência de VEGF (20 ng /ml) foram semeadas em Matrigel. Eles foram, em seguida, tratados com veículo ou BMX nas concentrações indicadas. Após 16 h, as células foram fotografadas utilizando microscopia de contraste de fase.
A análise de imunotransferência
análises de imunotransf erência foram realizadas como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, as células foram lisadas num tampão de extracção contendo Tris 10 mM (pH 7,0), NaCl 140 mM, PMSF 2 mM, DTT 5 mM, leupeptina a 0,5% de NP-40, 0,05 mM de pepstatina A, e 0,2 mM. Amostras de quantidades iguais de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de NC a qual foi então incubado num tampão de TBST contendo leite magro a 5%. As proteínas foram visualizadas por incubação com os anticorpos primários específicos, seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. A imunorreactividade foi detectada com base na quimioluminescência aumentada de acordo com as instruções do fabricante. Os dados quantitativos foram obtidos utilizando um densitómetro de computação com um sistema de imagiologia científicos (Biospectrum Sistema CA, UVP).
anel aórtico ensaio sprouting
O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [32]. arco aórtico foi dissecado de 8 a 10 semanas de idade, os ratos Sprague-Dawley. Após remoção dos tecidos adiposo fibro-rodeiam completamente e lavagem com meio de cultura M199, as aortas foram cortados em segmentos de 1 mm do anel. Os anéis da aorta foram imersos em Matrigel nas cavidades da placa de 48 poços. VEGF (20 ng /ml) com ou sem BMX foi então adicionada aos poços. Os anéis da aorta foram cultivadas em 37 ° C com 5% de CO
2 e o meio de cultura foi trocado a cada 3 dias. Crescer brotos de células endoteliais foram observadas e fotografadas no dia 8. As imagens foram fotografadas ao microscópio, e área de brotação foi determinada nas imagens de computador digitalizada com o software Imagem-Pro Plus (Media Cybernetics). A análise da área de brotação foi feito por um observador que desconhecia o grupo de tratamento. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Laboratory e usar o Taipei Medical University.
angiogênese induzida por células tumorais Matrigel ensaio plugue
3-5 semanas de idade nus
nu /nu foram obtido a partir BioLasco (Taipei, Taiwan) e alojados em (SPF) quartos limpos de patógenos específicos. As células HCT116 foram colhidas e ressuspensas em PBS. As células (5 × 10
6 células) num volume de 150 uL na presença de heparina (20 L) foram misturadas com Matrigel (150 uL) e depois injectados subcutaneamente no flanco direito de cada ratinho. Após a implantação, os animais foram divididos aleatoriamente em grupo de controlo e os grupos de tratamento, que receberam BMX 20 mg /kg /dia. O tratamento foi administrado por via intraperitoneal uma vez por dia durante 10 dias. No final do tratamento, os animais foram sacrificados, tampões de Matrigel foram removidos e os tecidos circundantes aparado. Os níveis de hemoglobina dos tampões de Matrigel foram avaliadas com o kit de reagente de Drabkin (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração da hemoglobina foi calculado com base em um conjunto de padrões de hemoglobina. Além disso, secções embebidas em parafina foram coradas com um anticorpo específico para CD31 (Santa Cruz) para detectar a densidade de vasos em Matrigel ligar, tal como descrito anteriormente [33]. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Laboratory e usar o Taipei Medical University.
Mouse modelo de xenotransplante
3-5 semanas de idade nus
nu /nu foram obtidos a partir BioLasco (Taipei , Taiwan) e alojados em livre SPF quartos limpos de patógenos específicos (). As células HCT116 foram colhidas e ressuspensas em PBS, e 5 × 10
6 células num volume de 0,3 mL foram injectadas por via subcutânea no flanco direito de cada ratinho. Uma vez que o tumor atingiu aproximadamente 150 milímetros
3, os animais foram divididos aleatoriamente em grupo controle e no grupo de tratamento recebendo BMX de 20 mg /kg /dia. O tratamento foi administrado por via intraperitoneal uma vez por dia durante 22 dias. Os tumores foram medidos a cada dia por um paquímetro digital. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula
V
(mm
3) = [
ab
2] × 0,52, onde
a
é o comprimento e
b
é a largura do tumor [34]. No final do tratamento, os animais foram sacrificados e os tumores foram removidos e pesados. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Laboratory e usar o Taipei Medical University.
A análise estatística
Os resultados são apresentados como a média ± S.E. a partir de pelo menos três experiências independentes. Uma análise de variância (ANOVA) foi seguido pelo teste de Newman-Keuls, quando apropriado, para determinar a significância estatística da diferença entre as médias. A
p valor
de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
BMX inibe a proliferação celular induzida por VEGF em HUVECs
proliferação celular endotelial é. um passo essencial para o progresso da angiogénese. Para avaliar a actividade anti-angiogénica de BMX (Fig. 1), que numa primeira fase, os seus efeitos inibitórios sobre a proliferação celular em células HUVEC estimulada por VEGF. As células foram privadas com 2% de FBS contendo meio, durante 16 h e, em seguida, estimulada por VEGF (20 ng /ml) na presença ou ausência de BMX durante mais 24 h. Como mostrado na Fig. 2A, o tratamento de células com BMX concentração diminuiu de forma dependente a viabilidade celular em HUVEC estimuladas com VEGF tal como determinado pelo ensaio de MTT. análise de marcação com BrdU foi, então, empregue para confirmar se decremento induzida BMX na viabilidade celular era atribuível à inibição da proliferação celular. FIG. 2B mostra que a percentagem de células marcadas com BrdU aumentou significativamente depois de um tratamento com VEGF 24 h, quando comparados com o grupo tratado com veículo. BMX inibiu significativamente a proliferação celular induzida por VEGF de forma dependente da concentração. Para determinar se BMX exerceu qualquer efeito citotóxico em células HUVEC expostos a VEGF, foi utilizado um ensaio de LDH. Como mostrado na Fig. 2C, o tratamento de células com BMX a 10 uM, durante 24 h não aumentar significativamente a libertação de LDH. Nós também utilizada a análise de citometria de fluxo com iodeto de propídio (PI) e anexina V-FITC rotulagem para detectar a apoptose em células estimuladas com VEGF na presença de BMX. Como mostrado na Fig. 2D, BMX não alterou significativamente a percentagem de anexina V
+ PI
– células (quadrante inferior direito, células início apoptóticos) e da anexina V
+ PI
+ células (quadrante superior direito , avançada células apoptóticas e /ou de células necróticas). Estes resultados sugerem que as bicicletas podem exercer actividade anti-proliferativa, sem causar efeito citolítico ou apoptótica em células HUVEC expostos a VEGF.
HUVECs (A) foram deixados em jejum em FBS a 2% contendo meio sem ECGS durante 16 h. Depois de fome, as células foram pré-tratadas com as concentrações indicadas de BMX, seguido de estimulação com VEGF (20 ng /ml) durante mais 24 h. A viabilidade das células foi então determinada por ensaio MTT. Cada coluna representa a média ± S.E.M. de cinco experiências independentes realizadas em duplicado *
P
0,05, comparado com o grupo tratado apenas com VEGF. (B) HUVEC foram tratadas como em (A), e proliferação de células foi determinada como descrito na secção “
Materiais e Métodos
” secção. Cada coluna representa a média ± SEM de cinco experiências independentes realizadas em duplicado. *
P
0,05, comparado com o grupo tratado apenas com VEGF. (C) As HUVECs foram tratadas como em (A), e citotoxicidade de BMX foi determinada por ensaio de LDH. As células também foram tratadas com tampão de lise celular (lise total) para servir como controlo positivo. (D) As HUVECs foram tratadas como em (a), a percentagem de células apoptóticas foi então analisada por análise de citometria de fluxo como descrito na secção “
Materiais e Métodos
” secção. O quadrante inferior esquerdo de cada painel (anexina V
-PI
-) mostra as células viáveis, que excluem PI e são negativas para a ligação de anexina V. O quadrante inferior direito (anexina V
+ PI
-) representa as células em apoptose precoce, anexina V positiva e negativa PI, demonstrando a integridade da membrana citoplasmática. O quadrante superior direito (anexina V
+ PI
+) contém células em apoptose avançadas e células necróticas, que são positivos para a ligação de anexina V e para a absorção de PI. Os resultados apresentados são representativos de quatro experiências independentes.
BMX inibe a migração induzida por VEGF e a estrutura capilar formação de HUVECs
migração de células endoteliais é um passo fundamental para a angiogénese [35]. O efeito do BMX em HUVEC motilidade foi determinada pela migração ferida zero e transpo� ensaios de invasão. Como mostrado na Fig. 3A, BMX inibiu significativamente a migração de HUVEC induzida por VEGF de forma dependente da concentração. BMX em 5 uM também reduziu significativamente o número de células que migraram através da barreira de membrana Transwell quando usando o VEGF como o quimioatractivo (Fig. 3B). A angiogénese é um processo complexo e formação tubular de células endoteliais é também um passo chave na angiogénese. Para avaliar o efeito de BMX na formação tubular de células endoteliais, células HUVEC semeados sobre a superfície de Matrigel na presença de VEGF foram tratados quer com BMX ou veículo como controlo. As células do grupo tratado com veículo tornou-se alongado e formado estrutura do tipo capilar dentro de 16 h. VEGF aumentou significativamente rede capilar semelhante. No entanto, o tratamento da concentração BMX-dependente suprimida a formação de rede capilar semelhante (Fig. 3C). A seguir, explorou os efeitos potenciais de BMX sobre a angiogênese induzida por VEGF utilizando um ensaio de germinação anel aórtico microvasos rato. Como mostrado na Fig. 3D, o VEGF desencadeada de forma significativa a germinação de microvasos, levando à formação de uma rede complexa de microvasos em torno dos anéis da aorta, enquanto que o tratamento com BMX (5 uM) antagonizou o surgimento. Estes resultados indicam que as bicicletas podem exibir actividade anti-angiogénica, através da inibição da proliferação celular, migração e formação do tubo de células endoteliais.
HUVECs (A) foram deixados em jejum em FBS a 2% contendo meio sem ECGS durante 16 h. monocamada celular foram então riscado e tratados com veículo ou concentrações de BMX indicada na presença de VEGF durante mais 16 h. em seguida, foi determinado o número de células que migraram. Cada coluna representa a média ± S.E.M. de quatro experiências independentes. *
P
0,05, comparado com o grupo tratado apenas com VEGF. (B) Depois de fome como descrito em (A), as células foram então semeadas na câmara superior na ausência ou na presença de BMX (5 uM) utilizando o VEGF como quimio-atractor. Após 16 h, invadido células através da membrana revestidos por gelatina foram coradas e quantificado. Cada coluna representa a média ± S.E.M. de quatro experiências independentes. *
P
0,05, comparado com o grupo tratado apenas com VEGF. (C) As HUVECs foram semeadas em Matrigel, na presença de VEGF (20 ng /ml) com ou sem BMX nas concentrações indicadas. As células foram então fotografados sob microscopia de contraste de fase após 16 h. Os gráficos de barras mostram os dados de números médios arco broto compilado (n = 4). *
P
0,05, comparado com o grupo tratado apenas com VEGF. anéis da aorta (D) de rato foram colocados em Matrigel e tratado com VEGF (20 ng /ml) na presença ou ausência de BMX (5 uM). O efeito de BMX sobre a formação de broto vaso de várias amostras de aorta foi examinado no dia 8. Os gráficos de barras mostram os dados de área média microvasos compilado (n = 4). *
p
. 0,05, em comparação com o grupo tratado apenas com VEGF
BMX inibe a ERK induzida por VEGF e fosforilação Akt
VEGF sinalização através de VEGFR2 é a via mais importante na indução da proliferação de células endoteliais, migração e formação do tubo, levando a angiogénese [36]. A ligação de FCEV ao VEGFR2 VEGFR2 induz a dimerização e, subsequentemente, a autofosforilação sobre resíduos de tirosina seus. Takahashi et ai revelaram que os resíduos de tirosina de 1175 e 1214 são os dois principais locais de autofosforilação dependente de VEGF de VEGFR2 [37]. Nós, portanto, determinar se BMX afeta VEGFR2 Y1175 e Y 1214 fosforilação em HUVECs estimuladas com VEGF. Examinámos também o estado de fosforilação de Src, Akt, ERK e FAK, que são as proteína-quinases essenciais envolvidas na sinalização de VEGFR2. Como mostrado na Fig. 4, BMX inibida VEGFR2 Y1175 e Y1214 fosfolarização em HUVEC estimulada por VEGF (Fig. 4B). BMX também foi mostrado para suprimir a fosforilação de Src (Fig. 4C), FAK (Fig. 4D), Akt (Fig. 4E) e ERK (Fig. 4F) em células HUVEC estimulada por VEGF. Juntos, estes resultados mostram que BMX exercida a sua actividade angiogénese por inibição da activação de VEGFR2 e bloqueando cascatas de sinalização mediada por VEGFR2.
As células foram pré-tratadas com as concentrações indicadas de BMX para 30 (20 ng /ml) durante mais cinco (VEGFR2 e Src) ou 30 (FAK, Akt e ERK1 /2) min. estado de fosforilação de VEGFR2, Src, FAK, Akt, e ERK1 /2 foram, então, determinado por imunotransferência. Os números mostrados em (A) são representativos de quatro experiências independentes, com resultados semelhantes. Os resultados compilados de VEGFR2 Y1175 e Y1214 (B), Src Y416 (C), FAK Y397 (D), Akt S473 (E), e fosfolarização ERK1 /2 T202 /Y204 (F) são mostrados. Cada coluna representa a média ± S.E.M. de quatro experiências independentes. *
p Art 0,05, em comparação com o grupo controle; #
p
. 0,05, em comparação com o grupo tratado apenas com VEGF
BMX aumenta p21
expressão CIP /WAF1, mas diminui cyclinD1, CDK4 e expressões survivinas
a passagem através do ciclo da célula é regulada por complexos de ciclina-CDK, cinases de proteínas heterodiméricas [1] – [3]. Muitos estudos têm demonstrado que a indução ou a expressão ectópica de p21
CIP /WAF1, um regulador negativo de CDKs, inibe a proliferação celular e causa diferenciação em vários tipos de células. p21
CIP /WAF1 é, assim, um importante regulador da proliferação durante o desenvolvimento, diferenciação, e tumorigénese [38]. Além disso, a survivina, um inibidor da apoptose (IAP) um membro da família, se verificou ser sobre-expresso em cancros humanos e foi reportada desempenhar um papel crucial na regulação da progressão do ciclo celular, apoptose, e tumorigénese [39] – [42] . Desde BMX suprimiu a proliferação HUVEC sem causar apoptose, como descrito acima, examinamos se BMX afeta os níveis de proteína de p21
CIP /WAF1 e survivin em HUVECs. Os níveis de proteínas reguladoras do ciclo celular, tais como cyclinD1 e CDK4 também foram determinados em células HUVEC BMX-estimuladas. Como mostrado na Fig. 5, o tratamento de HUVEC com BMX durante 24 horas provocou um aumento no nível de proteína de p21
CIP /WAF1 (Fig. 5B). Em contraste, os níveis de proteína de ciclina D1 (Fig. 5C), CDK4 (Fig. 5D) e survivina (Fig. 5E) foram diminuiu em HUVEC estimuladas BMX. Estes resultados sugerem que a proliferação celular BMX inibida em células HUVEC pode também ser mediada por meio de alterações dos níveis de proteína de p21
CIP /WAF1, cyclinD1, CDK4 e survivina.
As células foram tratadas com as concentrações indicadas de BMX para 24
CIP /WAF1, cyclinD1, CDK4 e survivina foram então determinados por immunoblotting. Os números mostrados em (A) são representativos de quatro experiências independentes, com resultados semelhantes. Os resultados compilados de p21
CIP /WAF1 (B), cyclinD1 (C), CDK4 (D), e a survivina (E) níveis são mostrados. Cada coluna representa a média ± S.E.M. de quatro experiências independentes. *
p Art 0,05, em comparação com o grupo controle
BMX reprimida angiogênese induzida por tumor em ratinhos nus
Em seguida, utilizou-se uma angiogênese induzida por tumor modelo para investigar se BMX inibe a angiogénese induzida pelo tumor. HCT116 células de cancro colorrectal foram misturados com Matrigel e injectado nos flancos de ratinhos. tampões de gel foram colhidas 10 dias após a implantação. Como mostrado na Fig. 6A, as células HCT116 profundamente induziu a formação de vasos sanguíneos no tampão (Fig. 6A). No entanto, a cor pálida dos tampões removidos a partir dos ratinhos por via intraperitoneal com BMX (20 mg /kg /dia) indicou que as células HCT116 menos induzida a neovascularização ao longo do período de 10 dias. Foi realizada CD31 coloração imuno-histoquímica para detectar a densidade microvascular nas fichas. Como mostrado na Fig. 6B, fichas derivadas de ratinhos tratados com BMX exibiram uma diminuição da densidade de microvasos, quando comparados com os de ratinhos de controlo tratados com veículo. Nós também quantificado o nível de angiogénese por meio da determinação do teor de hemoglobina dos tampões. Uma redução acentuada na neovascularização foi mostrado em fichas a partir de ratinhos tratados com BMX quando comparado com os de ratinhos de controlo tratados com veículo (Fig. 6C). Estes dados indicam que a administração sistémica com BMX suprimiu significativamente a angiogénese neste
ensaio in vivo.
(A) células HCT 116 de cancro colorrectal foram misturados com Matrigel e então injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus. Após a implantação, os animais foram tratados por via intraperitoneal com o veículo ou BMX 20 mg /kg /dia durante 10 dias. tampões de Matrigel removidos a partir dos ratinhos por via intraperitoneal com o veículo ou BMX foram mostradas. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. A viabilidade das células foi então determinada por ensaio MTT. A viabilidade das células foi então determinada por ensaio MTT.