Abstract

Background

o objetivo deste estudo foi demonstrar o câncer anti-pele e potencial quimiopreventivo de 1,1-bis (3′-indolil) -1- (p-clorofenil metano) (DIM-D), utilizando um modelo in vitro.

Métodos

In vitro a citotoxicidade celular e ensaios de viabilidade foram realizados em linha de células de carcinoma epidermoide A431 humana e queratinócitos humanos normais epidérmico (NHEK), respectivamente, por coloração violeta cristal. indução de apoptose em células A431 (DIM-D tratado) e as células NHEK pré-tratadas com DIM-D (2 horas) antes da irradiação UVB, foram avaliados. A acumulação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em DIM-D pré-tratados células NHEK (2 horas) antes da exposição UVB também foi determinada. Imunocitoquímica e western blot foi realizada para determinar caspase 3 e DNA marcadores de dano clivados em DIM-D trataram células A431 e DIM-D pré-tratados células NHEK antes da irradiação UVB.

Resultados

A Os valores de IC50 de dim-D foram de 68,7 ± 7,3, 48,3 ± 10,1 e 11,5 ± 3,1 pM enquanto que para epigalocatequina galato (EGCG) foram 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 e 56,7 ± 3,1 uM para tratamentos de 24, 48 e 72 h, respectivamente. DIM-D exibiram um aumento significativo (p 0,05) maior indução de fragmentação de ADN em células A431 em comparação com EGCG com a morte celular por cento de 38,9. Além disso, DIM-D induziu maior expressão em células A431 em comparação com EGCG clivada da caspase 3 (3,0 vezes vs alterações 2,4-vezes), Nurr1 (2,7 vezes vs mudanças de 1,7 vezes) e NFkB (1,3 vezes vs . mudanças 1,1 vezes). DIM-D também exibiu actividade quimiopreventiva em células NHEK irradiadas com UVB por significativamente (p 0,05) a redução induzida por UVB formação de ROS e apoptose em comparação com EGCG. Além disso, DIM-D expressão induzida de Nurr1 mas a expressão reduzida de 8-OHdG significativamente em células irradiadas NHEK-UVB comparação com EGCG e UV somente.

Conclusão

Nossos resultados sugerem que DIM-D exibe transactivação dependente de Nurr1 na indução de apoptose em células A431 e que protege as células contra ROS NHEK formação e danificam o ADN induzida por UVB

citação:. Boakye CHA, Doddapaneni R, Shah PP, Patel AR, C Godugu , S Seguro, et al. (2013) Quimioprevenção do cancro de pele com 1,1-Bis (3′-indolil) -1- (aromático) Metano analógico através da indução do órfão Nuclear Receptor, NR4A2 (Nurr1). PLoS ONE 8 (8): e69519. doi: 10.1371 /journal.pone.0069519

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de maio de 2013; Aceito: 11 de junho de 2013; Publicação: 07 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Boakye et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Minority Saúde e Saúde disparidades concessão P20 MD 006738-01 e SC-1 concessão 5SC1CA161676-03 do National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

incidência de câncer de pele tem vindo a aumentar e mais de 2 milhões de novos casos são diagnosticados a cada ano nos Estados Unidos [1]. Estimou-se que uma em cinco americanos caucasianos irá desenvolver cancro da pele, pelo menos uma vez no decurso do seu /sua vida [2]. O melanoma é a forma mais grave de câncer de pele e é responsável por 5% de todos os casos de câncer de pele nos Estados Unidos, é responsável pela maioria das mortes por câncer de pele [3], [4], com um impacto estimado em US $ 2,36 bilhões em 2010 [5]. O aumento da incidência de câncer de pele é esperado que continue conforme a população envelhece, maiores quantidades de radiação UV atingem a superfície da Terra devido ao esgotamento da camada de ozônio, e do uso contínuo de aparelhos de bronzeamento [6], [7], [ ,,,0],8].

Estudos têm demonstrado que a exposição persistente à luz solar é um fator de risco importante para o desenvolvimento de ambos câncer de pele não melanoma (CPNM) e melanoma devido a efeitos prejudiciais da radiação UVB que rompe a camada epidérmica da pele [ ,,,0],9], [10]. O início ea progressão da carcinogênese de pele envolve uma complexa cascata de eventos celulares e moleculares decorrentes da produção inicial de espécies reactivas de oxigénio (ROS) pela radiação UVB [11], [12], [13] e resulta em danos no DNA dos queratinócitos e mutação incluindo a formação de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD). Estudos têm mostrado que existe também danos substanciais causados ​​aos lípidos da pele e proteínas após exposição UVB [14], [15].

Muitos fitoquímicos e análogos sintéticos têm a capacidade de reverter e /ou reduzir o aparecimento e progressão da carcinogênese pele e angiogênese [16], [17]. Estes fitoquímicos são principalmente polifenóis, que incluem mas não estão limitados a silimarina, epigalocatequina 3-galato (EGCG), curcumina, miricetina, quercetina e hesperitin. EGCG é um polifenol abundante presente no extrato de chá verde e é um flavonóide potente antioxidante que tem potencial quimiopreventivo [18]. EGCG pode induzir a paragem do ciclo celular e a apoptose em células de hepatoma por indução de p53 e Fas /FasL via apoptótica, respectivamente [19]. A citotoxicidade de EGCG in vitro requer relativamente altas concentrações [20], que não são prontamente conseguidas no soro e ambas as formulações orais e tópicas de EGCG exibem protecção mínima contra o fotoenvelhecimento e respostas inflamatórias induzidas por UV na pele [21], [22] , [23].

3,3′-Diindolylmethane (DIM) (Fig. S1) é um produto natural derivado de indole-3-carbinol (I3C) que está presente em vegetais crucíferos tais como as couves de Bruxelas, brócolis e couve-flor. DIM tem gerado muito interesse na pesquisa do câncer por causa de sua baixa toxicidade e efeitos citotóxicos em células cancerosas in vitro e inibição do crescimento do tumor in vivo [24]. Por exemplo, DIM expressão induzida de inibidores do ciclo celular, tais como p21 e p27 e proteínas regulada negativamente de ciclina, incluindo a ciclina D1 e também a diminuição da expressão de sobrevivência e proteínas anti-apoptóticas incluindo survivina, Bcl-2, Bax e polimerase poli induzida (ADP-ribose) ( PARP) clivagem, a libertação de citocromo c mitocondrial e clivagem procaspase [25], [26], [27]. Uma série de novos 1,1-bis sintéticos (3′-indolil) -1- (p-substituído fenil) análogos de metano (C-escurece), são também agentes anti-cancro potentes [25], [28], [29] e as suas actividades são dependentes da estrutura. Os derivados de p-t-butilfenil e p-bifenil γ activar PPAR (PPARy) ao passo que os não substituídos p-fenilo e p-metoxifenilo análogos de activar o receptor órfão NR4A1 (Nurr77 /TR3) [30]. Estudos em nosso laboratório relatou um efeito sinérgico entre 1,1-bis (3′-indolil) -1- (p-bifenil) metano (DIM-C-pPhC6H5) e docetaxel em células não-pequenas de cancro do pulmão de células através da indução reforçada de PARP clivada, Bax e N-caderina e inibição de fosfo-Akt, ciclina D1, survivin, NF-kB, Mcl-1 e fosfo JNK2 [29], [31].

Um membro do nervo factor de crescimento IB Nurr1 (NR4A2) é outro receptor NR4A, que tem sido implicado, em vários processos hormonais, fisiológicos e patológicos incluindo as doenças cardiovasculares, neurológicas e metabólicas, inflamação e oncogénese. Nurr1 desempenha um papel na função cerebral e, consequentemente, tem sido associada à doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e [32]. Nurr1 é altamente expressa em Panc1 e Pan28 pâncreas e algumas linhas celulares de cancro da bexiga humanos [28], [33]. Neste estudo, que ilustram a importância de Nurr1 no potencial quimiopreventivo de 1,1-bis (3′-indolil) -1- (p-clorof enil metano) (DIM-D) em cancro da pele utilizando uma pele induzidos in vitro UVB modelo de câncer. DIM-D tem mostrado para induzir a transactivação dependente de Nurr1 e os resultados do nosso estudo sugerem um possível papel para DIM-D /Nurr1 na quimioprevenção do câncer de pele.

Materiais e Métodos

1. Materiais

análogos substituída p C-DIM (DIM-C-pPhCl; DIM-D), (DIM-C-pPhCN; DIM-B) e (DIM-C-pPhBr; DIM-C) estavam sintetizado como descrito [36]. EGCG foi comprado de Selleck Chemicals (Houston, TX, EUA). A linha de células de carcinoma epidermóide humano A431 e queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEK) foram adquiridos a partir de Invitrogen (Grand Island, NY, EUA). Salina tamponada com fosfato (PBS) foi adquirido a partir de Invitrogen. A (1 Nurr) NR4A2 anticorpo foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Os anticorpos dirigidos contra a 8-hidroxi deguanosine (8-OHdG), CCAAT /-enhancer- proteína de ligação a proteína homóloga (CHOP), factor nuclear Kappa-luz de cadeia-potenciador de células B activadas (NF-kB) e caspase 3 clivada eram também obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).

2. As linhas celulares e culturas de células

células A431 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma Aldrich, St Louis, MO) mistura de nutriente suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a partir de Invitrogen (Grand Island, NY ) e antibiótico-antimicótico a mistura compreendendo penicilina (5000 U /mL), estreptomicina (0,1 mg /mL), e a neomicina (0,2 mg /mL) a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA) a 37 ° C, na presença de 5% de CO

2 e 95% de humidade relativa. As células NHEK foram mantidas em meio Epilife (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) e foram mantidos por qualquer suplemento de crescimento epidérmico (EDGS) ou suplemento de crescimento dos queratinócitos humanos (HKGS) a partir de Invitrogen (Grand Island, NY) e mistura de antibiótico-antimicótico compreendendo penicilina (5000 U /mL), estreptomicina (0,1 mg /mL), e a neomicina (0,2 mg /mL) a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) a 37 ° C. Ambas as linhas de células foram sub cultivadas quando cerca de 80-90% confluentes com 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen, Grand Island, NY). As células foram cultivadas em 1,12 cm

2 0,4 um insertos de membrana de policarbonato de poro de 12 mm x 12 Transwell-permeáveis ​​placas de suporte (Corning, NY).

3.

In vitro A citotoxicidade celular

e Viabilidade Ensaios

citotoxicidade celular e ensaios de viabilidade celular foram realizados em células A431 e NHEK, respectivamente, utilizando o ensaio de coloração com violeta de cristal convencional. As células A431 e NHEK foram semeadas em placas de 96 poços (10

4 células /poço) e incubadas durante a noite em 5% de CO

2 a 37 ° C. As células A431 foram tratadas com o controlo de solvente (DMSO) e várias concentrações de dim-B, DIM-C e DIM-D e EGCG, enquanto células NHEK foram expostas a radiação UVB (150 J /m

2) 2 hr após o tratamento e, em seguida, incubadas durante 24 horas em meio de crescimento. As células A431 em mistura de drogas e media foram incubadas por 24, 48 e 72 horas. As células viáveis ​​foram fixadas com glutaraldeído e coradas com violeta de cristal durante 15 minutos à temperatura ambiente. O violeta de cristal foi lavado; o resíduo foi solubilizado com fosfato de hidrogénio de sódio e a absorvância foi medida com um espectrofotómetro a 462 nm de comprimento de onda de. Viabilidade das células NHEK tratados com C-escurece ou EGCG foram expressos como percentagens da absorção das células de controlo, que foram considerados como 100% os valores viáveis ​​e IC50 foram determinados pela seguinte fórmula, [(50- menor kill) /(maior matança – matar menor) * (maior conc -. menor conc)] + menor conc

4… Ensaio TUNEL

células A431 foram tratados com 34,4 uM DIM-D (50 por cento do valor de IC50) e incubou-se durante 24 h. As células foram então lavadas com tampão PBS e fixadas em 10% de formaldeído em lados microscópicas. O Vermelho ApoTag

In Situ

kit® de detecção da apoptose (Millipore, Billerica, MA) foi usada para a detecção de apoptose em conformidade com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células fixadas foram incubadas na solução de proteinase K 20 ng /ml durante 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por incubação com tampão de equilíbrio durante 10 seg. As células foram lavadas em PBS e incubada com a enzima TdT a 37 ° C durante 1 hora numa câmara humidificada para a incorporação de nucleótidos conjugados na extremidade 3 ‘OH do ADN termina. As células fixadas foram lavadas em PBS e incubadas com solução de conjugado anti-digoxigenina (Rodamina de anticorpo) e contrastadas com DAPI. As imagens microscópicas de células fixas nos slides foram visualizados com um microscópio de luz Olympus BX40 equipado com uma câmera digital controlado por computador (DP71, Olympus Center Valley, PA, EUA). fragmentação de ADN foi indicada por uma coloração positiva Rodamina (vermelho). células não tratadas foram mantidos como controle.

5. Acridina laranja /brometo de etídio coloração

As alterações morfológicas nos núcleos celulares NHEK após a exposição à radiação UVB foi determinada para avaliar os efeitos protetores do DIM-D e EGCG nas células expostas. As células foram semeadas em placa de 96 poços (10

4 células /cavidade) e tratou-se durante 2 horas com diferentes concentrações de soluções de dim-D e EGCG em DMSO antes da exposição a radiação UVB, na dose de 150 mJ durante 30 seg. As células foram em seguida incubadas em meio de crescimento durante 24 h e a coloração foi realizada com laranja de acridina /brometo de etídio (AO /EB) como descrito [34], e analisadas por microscopia de fluorescência. Resumidamente, a absorção diferencial dos dois corantes foi utilizada para determinar a viabilidade das células. Após incubação durante 24 horas, as células foram lavadas com PBS (2X) e coradas com uma mistura de brometo de etídio e laranja de acridina.

6. Determinação de espécies de oxigénio reactivas (ROS) intracelulares

O corante fluorescente, 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA) foi utilizado para avaliar a acumulação de ROS nas células NHEK após exposição UVB. As células foram semeadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 0,05 x 10

6 células /poço, tratado com diferentes concentrações de dim-D e EGCG em DMSO durante 2 horas, aspirou uma película fina de PBS foi adicionado e as células foram então expostas a dose de radiação UVB de 150 mJ durante 30 seg. As células foram então incubadas durante 24 h em apenas meio de crescimento. solução DCF-DA (10 uM) foi adicionado às células (0,05 x 10

6 /mL) e a mistura foi incubada a 37 ° C durante 1 h no escuro. As células foram lavadas com PBS (2X) e a intensidade de fluorescência das células foi determinada por microscopia de fluorescência.

7. Análise imunocitoquímica

ambas as células A431 e NHEK foram tratados com dim-D e EGCG (34,4 uM e 210,0 uM, respectivamente) e incubou-se durante 24 h. As células foram depois fixadas em 10% de formaldeído e cytospun em lâminas microscópicas. A análise foi realizada seguindo o protocolo especificado no SignalStain

TM kit IHC (Cell Signaling, Beverly, MA). As células fixadas foram hidratados com várias concentrações de álcool e de PBS (3X), incubadas com os anticorpos primários contra a caspase 3 clivada, Nurr1 e 8-OHdG durante a noite a 4 ° C e detectada por um anticorpo secundário conjugado com HRP. As células foram coradas com Nova Red mancha e contrastadas com hematoxilina. A análise microscópica das células fixas foi realizada com um microscópio de luz Olympus BX40 equipado com câmera digital controlado por computador (DP71, Olympus Center Valley, PA, EUA).

8. A análise Western blot

As proteínas foram recolhidos a partir de células A431 e NHEK ambos como descrito [33]. Resumidamente, após 24 o tratamento de RH com dim-D (17,2 ^ M) e EGCG (104,8 mM), as células foram tratadas com tampão RIPA (50 nM Tris-HCl, pH 8,0, com cloreto de sódio 150 mM, 1,0% de Igepal CA-630 ( NP-40), 0,5% deoxychlorate de sódio, e 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio) com o inibidor de protease (mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo 500). As concentrações de proteína foram determinadas de acordo com o protocolo de reagente de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) e o gráfico padrão foi gerado usando albumina de soro bovino, 50 ^ g de proteína sobrenadante a partir do grupo de controlo e todas as amostras diferentes de tratamento foram desnaturadas por fervura em 100 ° C durante 5 min em tampão de amostra de SDS e foram, subsequentemente, a electroforese em gel de SDS-PAGE 10%, transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com leite desnatado a 5% em solução salina de Tris tamponada com Tween 20 (10 mM Tris-HCl (pH 7,6 ), NaCl 150 mM e 0,5% de Tween), e sondados com anticorpos contra Nurr1 (1:400), NFkB (1:500) e caspase 3 clivada (1:1000) para células A431. As proteínas foram detectados com anticorpos secundários conjugados com HRP utilizando SuperSignal West Pico solução quimioluminescente (Pierce, Rockford, IL). A quantificação e análise dos resultados foi realizada com o software Image J. (v1.33u, NIH, EUA). Os resultados foram expressos como razões percentuais de expressão da proteína de p-actina (definido como 100%).

9. A análise estatística

Os resultados são expressos como a média ± D.P. para pelo menos três repetições e comparação entre vários grupos foi estabelecida através de uma análise unidireccional da variância (ANOVA) e entre dois grupos por análise do teste t de Student. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

Resultados de

1.. atividade anticancerígena de análogos DIM

1.1 Efeito de análogos DIM em células de câncer de pele A431.

células A431 foram tratadas com três análogos DIM diferentes, que diferem estruturalmente na posição p-fenil (Fig. S1). As células A431 foram tratadas com dim-B para 24, 48 e 72 horas e os valores de IC50 para citotoxicidade foram 56,8 ± 10,7, 30,8 ± 6,6 e 7,2 ± 1,2 mm, respectivamente (Fig. 1A). Os valores de IC50 para DIM-C após o tratamento para 24, 48 e 72 horas foram de 78,3 ± 16 anos, 50,2 ± 12,2 e 7,2 ± 1,5 mM, respectivamente, e os valores IC50 correspondentes para DIM-D eram de 68,7 ± 27,3, 48,3 ± 11,5 ± 10.1and 3,1 uM após o tratamento durante 24, 48 e 72 h. Em contraste, os valores de IC50 para EGCG após o tratamento durante 24, 48 e 72 h foram 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 e 56,7 ± 3,1 ^ M, respectivamente (Fig. 1B), que foram significativamente maiores do que os observados para C-escurece (Tabela 1) . Todos os três derivados DIM mostrou mais potência do que o EGCG com pequenas variações entre suas potências. DIM-D foi entretanto seleccionado para estudos posteriores como uma droga modelo porque ele exibiu mais fotoestabilidade do que DIM-B e DIM-C.

(A) perfil de citotoxicidade (Lote de morte celular% vs concentração do fármaco em A ) 24 horas, B) 48 horas e C) 72 horas, onde, DIM-B = DIM-C-pPhCN, DIM-C = DIM-C-pPhBr e DIM-D = DIM-C-pPhCl). Os dados representam SD ± média. (B) perfil de citotoxicidade (Lote de morte celular% vs concentração da droga) a A) 24 horas, B) 48 horas, C) 72 horas para EGCG em células A431.

1.2 actividade apoptótica de DIM-D contra células A431.

os efeitos da DIM-D sobre a apoptose em células A431 foram examinados pelo método TUNEL por citometria de fluxo. células A431 tratadas com dim-D (34,4 uM) durante 24 h a morte celular induzida significativamente (38,9%) comparado com o controlo DMSO (Fig. 2A). Investigou-se também os efeitos de dim-D e EGCG sobre a fragmentação de ADN de células A431, usando o método de TUNEL por análise microscópica (Fig. 2B). Nas células de controlo tratadas com PBS, foi observada a fragmentação do ADN mínimo enquanto que DIM-D aumentou significativamente a fragmentação do ADN, como evidenciado por um aumento da fluorescência vermelha. Da mesma forma, EGCG (104,8 mM) aumentou também a fragmentação do ADN, mas comparativamente menor quando comparado com dim-D (Fig. 2B).

(A) Detecção de células apoptóticas pelo método TUNEL utilizando análise de citometria de fluxo. As células A431 foram coradas para células apoptóticas com FITC pelo método TUNEL antes e depois de tratamento de 24 horas. (I) gráfico de pontos que descreve FSC contra o perfil SSC de células após o tratamento. (Ii) Dot trama que descreve o perfil de FITC de fluorescência em função do FSC para células após o tratamento. A maioria das células em apoptose TUNEL coradas são um pouco menores do que as células vivas não coradas. (Iii) Histograma mostrando células antes do tratamento no portão R1. Muito poucas células apoptóticas são detectados. (Iv) células histograma representando após o tratamento com DIM-D (DIM-C-pPhCl) na porta R1. células em apoptose (brilhantemente coradas por TUNEL) são detectados. (B) Detecção de células apoptóticas pelo método TUNEL utilizando análise microscópica. As células A431 foram coradas para células apoptóticas com Rodamina pelo método TUNEL para o tratamento de 24 horas. As células foram contrastadas com corante Hoechst (DAPI).

1.3 Efeito da DIM-D em proteínas apoptóticas e Nurr1.

células A431 foram tratados com 34,4 uM DIM-D e 104,8 mM EGCG por 24 hr e lisados ​​de células totais foram analisadas por western blot (Fig. 3A). Foram observadas expressão D DIM-induzida significativamente de (activada), proteínas de caspase-3 e Nurr1 clivados e resultados semelhantes para EGCG. A quantificação destes resultados (Fig. 3B) mostrou que o DIM-D foi mais potente do que o EGCG como um indutor de caspase-3 clivada (3,0 vezes vs 2,4 vezes) e Nurr1 (2,7 vezes vs 1,7 vezes), enquanto que os efeitos sobre NFkB (p65) foram mínimas (1,3 vezes vs 1,1 vezes). Expressão de caspase-3 clivada e Nurr1 foi significativamente induzida por DIM-D e EGCG (p 0,05). DIM-D (34,4 ^ M) e EGCG (104,8 | iM) também induziu expressão CHOP como indicado por imunocoloração de células A431 após o tratamento durante 24 horas (Fig. 3C). A quantificação destes resultados mostraram aumento significativo de CHOP células coradas positivamente (79%) em DIM-D células tratadas, em comparação com 67% de células coradas positivamente após tratamento EGCG. Estes resultados sugerem que o anti-pele potencial cancerígeno de DIM-D é maior do que EGCG em condições idênticas.

(A) A expressão de caspase clivada 3, Nurr1 e NFkB em comparação com o controlo de β-actina em Dim -D e EGCG células A431 tratadas por western blot. As células não tratadas foram mantidos como controlo. (B) análise por Western blot da expressão de proteínas diferentes aumentou significativamente em DIM-D células tratadas. (C) ICC peroxidase coloração de células A431 tratadas com DIM-D e EGCG, respectivamente, para a proteína pró-apoptótica, CHOP. coloração Brown foi considerado resultado positivo. As células não tratadas foram mantidos como controlo. Os dados são calculados a partir de ensaios em triplicado e apresentados como média, e as barras de erro referem-se a SD, * P 0,05, ** P 0,01 comparado com o controlo

2.. atividade quimiopreventiva da DIM-D em queratinócitos normais epidérmico humano (NHEK) células

efeito

2.1 citotóxica da DIM-D em células NHEK.

A fim de investigar os efeitos da DIM-D contra o normal células da pele, células NHEK foram tratados com várias concentrações de dim-D (15-140 uM), durante 24 h e os resultados indicaram que a DIM-D foi minimamente tóxico para as células NHEK (Fig. 4a). Na concentração máxima de 140 uM, a morte celular percentual foi de 56,2 ± 1,3, enquanto na concentração de IC50 (68,7 ± 7,3 mM) observada em células A431, a morte das células NHEK foi reduzida para 48,7 ± 2,1%. Assim, a concentração de DIM-D 68,7 ± 7,3 mM foi utilizado para todas as investigações subsequentes. Por outro lado, a exposição das células NHEK pré-tratadas à radiação UV, reduz ainda mais a viabilidade celular. Isto no entanto não foi significativa, com aumento da morte celular por cento a 67,5 ± 2,6 e 65,9 ± 3,1 para 140 pM e 68,7 pM, respectivamente (Fig. 4A).

(A) Linha gráfico do perfil de citotoxicidade (Lote de% a morte de células vs concentração de droga) de células NHEK tratados com dim-D (DIM-C-pPhCl) a várias concentrações, com e sem radiação UVB. Os dados representam SD ± média. (B) Produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) com DIM-D e tratamento EGCG antes da exposição UVB. Cada valor é expresso como a média ± desvio padrão. eliminação de radicais (C) hidroxilo num tratamento sistema isento de células in vitro por DIM-D. Os dados são expressos em termos de percentagem de controlo na qual o sistema isento de células não foi tratada com dim-D.

atividade potencial e apoptótica 2.2 Anti-oxidante de DIM-D em células NHEK (D) determinação apoptose em células NHEK tratadas com DIM-D (DIM-C-pPhCl) e EGCG em diferentes concentrações. .

A atividade antioxidante dos DIM-D e proteção contra ROS induzidos por UV também foi investigado em células NHEK tratados com 34,4 mM DIM-D e 209,6 mM EGCG, durante 24 horas. Os níveis de ROS induzida por UVB em células pré-tratadas com DIM NHEK-D foram significativamente reduzidos em comparação com EGCG; isto demonstra que o DIM-D tem uma actividade anti-oxidante mais potente do que EGCG (Fig. 4B). Além disso, a capacidade de dim-D para eliminar hidroxilo (-OH) radicais num sistema in vitro isento de células foi utilizado para confirmar o potencial anti-oxidante melhorado de dim-D em comparação com EGCG. Os resultados na Figura 4C revelou que, em concentrações de 34,4 pM a 280 uM, não ofuscante-D foi capaz de matar cerca de 30% a 90% dos radicais hidroxilo.

Em seguida, a actividade apoptótica foi analisada em células NHEK, que foram pré-tratadas com EGCG (17,2 mM e 68,7 mM) e DIM-D (8,6 e 34,4 mM) antes da exposição UVB. Para efeito de comparação eficiente entre EGCG e DIM-D com relação à proteção contra a apoptose, o IC50 e um quarto foram empregadas as concentrações IC50 dos DIM-D para EGCG pré-tratamento das células, enquanto metade das respectivas concentrações foram empregados para DIM-D pré-tratamento. A acridina laranja /brometo de etídio coloração dupla foi utilizado para o ensaio de apoptose porque o corante laranja de acridina tem capacidade para manchar os núcleos de células viáveis ​​verdes, enquanto o corante de etídio, um agente intercalante de permeado células apoptóticas ou necróticas para corar o seu laranja núcleos. Demonstrou-se que em células, que foram tratadas com dim-D, houve uma morte celular apoptótica redução significativa (coloração vermelha) em comparação com as células tratadas com EGCG (Fig. 4D). Nenhuma morte celular por apoptose foi observada nas células de controlo, que foram tratados ou com PBS única ou veículo. tratamento DIM-D causou redução significativa na indução de apoptose pela radiação UVB em células NHEK. EGCG, no entanto, mostrou protecção mínima das células contra a apoptose. As células pré-tratadas com irradiação UVB antes de EGCG foram marcadamente manchado de vermelho por brometo de etídio. No geral, estes resultados sugerem que, embora houvesse redução na viabilidade das células em células tratadas UV DIM-D + em comparação com DIM-D células tratadas apenas (como mostrado na Fig. 4A); DIM-D tratamento relativamente impede a indução de apoptose pela radiação UVB e, portanto, aumenta a viabilidade celular de forma mais significativa do que EGCG.

2.3 Efeito da DIM-D sobre o stress induzida por UVB-oxidativo.

Para investigar se DIM-D inibe o estresse oxidativo induzido pela radiação UV e inflamação através da valorização do Nurr1 nas células da pele exposta aos raios UV, nós examinamos a expressão de Nurr1 e 8-OHdG em células NHEK (Fig. 5). Após a irradiação UVB, as células foram tratadas com dim-D (34,4 ^ M) e EGCG (209,6 mM) durante 24 horas e a formação de 8-OHdG foi determinada por imunocoloração (Fig. 5A). UVB aumentou significativamente 8-OHdG mas ambos DIM-D e EGCG diminuiu significativamente a resposta induzida por UVB, confirmando assim a actividade antioxidante de ambos os compostos. Sua potência relativa era evidente por imunocoloração. Apenas 3,6% das células foram coradas positivamente no tratamento dim-D, em comparação com as células tratadas EGCG (células de 20%).

(A) coloração imunocitoquímico de peroxidase de Nurr1 e 8-OHdG em células NHEK tratada com DIM- D e EGCG. Presença de mancha castanha indicado coloração positiva para o anticorpo primário. (B) (C) Análise de Western blot da expressão de Nurr1 em comparação com o controlo β-actina em Dim-D e EGCG tratada células NHEK. As células não tratadas foram mantidos como controlo. Os dados são calculados a partir de ensaios em triplicado e apresentados como média ± DP, * P 0,05, ** P 0,01 comparado com o controlo

Análise imunocitoquímica revelou que, a expressão Nurr1 foi significativamente mais forte, em comparação com. EGCG e UV única (Fig. 5A). A quantificação destes resultados mostraram que aproximadamente 83% das células foram coradas positivamente para Nurr1 em DIM-D células tratadas, em comparação com as células tratadas EGCG (66%). Estes resultados demonstraram claramente que o DIM-D foi mais potente do que o EGCG como um indutor de Nurr1. Além disso estes resultados foram confirmados por análise de Western blot. Para este fim, as células foram tratadas com NHEK DIM-D (34,4 ^ M) e EGCG (209,6 uM) durante 24 h e os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​(Fig. 5B). células NHEK tratadas com DIM-D mostrou expressão Nurr1 aumentou significativamente mais em DIM-D células tratadas (1,8 vezes) em comparação com EGCG (1,4 vezes) (Fig. 5C).

Discussão

mau resultado clínico das avenidas atuais de tratamento fez com que a necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de câncer de pele. Existe uma necessidade urgente de identificar alvos moleculares utilizando compostos alimentares, que têm tanto terapêutico, bem como a actividade quimiopreventiva. Nurr1 é um receptor nuclear, órfão e relatórios preliminares sugerem um papel para Nurr1 na artrite reumatóide e cancro através da modulação da apoptose. Além disso ele também tem sido demonstrado que os análogos de DIM activa o receptor nuclear, órfão Nurr1 e inibe o crescimento do cancro da bexiga [28]. No entanto não há relatos sobre o potencial quimiopreventivo do DIM-D ativada Nurr1 em câncer de pele. Por isso, na primeira parte do presente estudo foi focado em anticancerígeno ou atividade terapêutica de DIM-D usando células de câncer de pele A431. Na segunda parte de nosso estudo investigou a atividade quimiopreventiva da DIM-D através Nurr1 sinalização mediada usando NHEK.

Na primeira parte do nosso estudo, avaliou-se o efeito citotóxico do DIM-D em células da pele A431. É importante salientar que o DIM-D apresentou efeito citotóxico sobre estas células e o seu efeito citotóxico foi maior do que EGCG. Semelhante a EGCG, estudos anteriores demonstraram que a DIM inibe o crescimento de células de cancro derivadas de tumores da próstata, mama, cólon, colo do útero e pâncreas [34]. O papel da apoptose foi adicionalmente investigada por determinação da expressão de proteína por apoptose, tais como a caspase-3 clivada em células A431. A análise de Western blot mostrou um aumento significativo da expressão da caspase-3 na sequência de tratamento dim-D em células A431. Estudamos também a fragmentação do DNA em células A431 após o tratamento DIM-D, porque a fragmentação do DNA é uma característica da apoptose, o que compromete as células a morrer. fragmentação de ADN foi altamente induzida por DIM-D em comparação com EGCG, confirmando assim que a apoptose é uma via importante associado com a actividade anti-cancro destes compostos. Este foi bem correlacionada com o nosso estudo anterior de potenciação da actividade anti-cancro de um composto DIM em células de cancro do pulmão de células humanas não pequenas [29]. Estudos anteriores demonstraram que DIM-D ativa estresse do retículo endoplasmático no pâncreas e células do cancro do ovário [35], [36]. DIM-D induzida expressão de proteína endoplasmático retículo estresse GRP78 através da expressão aumentada de CHOP e este foi acompanhado por inibição do crescimento do tumor [37]. Da mesma forma, os nossos estudos mostraram que imunocitoquímicos DIM-D aumentou a expressão de CHOP em células A431 depois de tratamento durante 24 h. Estes resultados demonstram que DIM-D exerce os seus efeitos anti-câncer orientando os vários alvos moleculares associados com a sobrevivência celular e apoptose.

A superexpressão de Nurr1 diminui mediadores inflamatórios, expressão receptor de limpeza e reduz a acumulação de LDL nos macrófagos [38] , [39]. No nosso estudo, a expressão da caspase-3 clivada foi aumentada em células A431 depois de tratamento dim-D.