Abstract

Fundo

A disparidade mundial na incidência de câncer continua sendo um grande problema de saúde pública. Estamos focados em câncer de próstata desde que a doença microscópica em homens é comum, mas a incidência de doença clínica varia mais de 100 vezes em todo o mundo. Ca

2 + de sinalização é um regulador central da proliferação celular, mas tem recebido pouca atenção na prevenção do câncer. Nós e outros autores relataram uma redução dependente da dose forte na incidência do cancro da próstata e cancro do pulmão em populações expostas ao boro (B), em água potável e de alimentos; e no tumor e proliferação celular em modelos de cultura de células animais e.

Métodos /principais conclusões

Foi examinado o impacto do B em Ca

2 + lojas utilizando o câncer e não-câncer humano linhas de células da próstata, Ca

2 + indicadores Rhod-2 AM e Indo-1 AM e microscopia confocal. Em células DU-145, a inibição de Ca

2+ libertação era aparente após o tratamento com agonistas de Ringer contendo RYR cADPR, 4CmC ou cafeína e respectivos níveis de BA (50 uM), (1, 10 uM) ou (10, 20 , 50150 uM). células cancerosas LNCaP menos agressiva exigida 20 uM a BA e a linha celular de não tumor, PWR1E 150 uM necessária para inibir significativamente BA cafeína estimulada Ca

2+ libertação. BA (10 uM) e o antagonista dantroline RyR (10 uM) foram equivalentes na sua capacidade para inibir a ER Ca

2+ perda. Citometria de fluxo e análise de microscopia confocal mostrou a exposição de células DU-145 a 50? M BA por 1 hr diminuição armazenados [Ca

2 +] em 32%.

Conclusão /Significado

show de B provoca uma diminuição dependente da dose de Ca

2 + liberação das lojas sensíveis do receptor rianodina. Isto ocorreu em concentrações BA presentes no sangue de populações geograficamente distintos. Nossos resultados sugerem níveis sanguíneos mais elevados BA diminuir o risco de cancro da próstata, reduzindo intracelular Ca

2 + sinais e armazenamento

Citation:. Henderson K, Stella SL Jr, Kobylewski S, Eckhert CD (2009) Receptor activado Ca

2 + lançamento é inibida por ácido bórico em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 4 (6): e6009. doi: 10.1371 /journal.pone.0006009

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 17 de novembro de 2008; Aceito: 20 de maio de 2009; Publicado: 23 Junho 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Henderson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho para este subsídio foi financiado por fundos pessoais (CE) e em parte pela Universidade da Califórnia Substâncias tóxicas Programa de Pesquisa e Treinamento (TSR TP) para o apoio parcial da KH e SK. CE é o mentor de doutorado para KH e SK. TSR financiamento TP foi para bolsas estudantis restritos ao apoio ao estudante e não tinha papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses: Os autores declararam que nenhum. existem interesses conflitantes.

Introdução

Uma das maneiras as células respondem a estímulos do meio ambiente é através da abertura de canais entre os sites de cálcio armazenado, tais como o retículo endoplasmático (ER), Golgi e mitocôndrias ( mt), que contêm altos livres Ca

2 + concentrações (500 mm) e do citoplasma, que contém baixos livre Ca

2 + concentrações (100 nm) [1]. Uma ascensão rápida em Ca citoplasmática

2 + pode ser alcançado pela entrada capacitiva de cálcio (CCE) liberação envolvendo de Ca armazenado

2 + pelo receptor de rianodina (RyR) eo IP

3 receptor (IP

3R) para o citoplasma seguido por um afluxo de extracelular Ca

2 +. CCE activa Ca

2+ proteínas que regulam numerosas funções das células, incluindo a transcrição de genes, a proliferação celular, a secreção da vesícula, e a apoptose de ligação [2], [3]. Citoplasmática Ca

2+ são devolvidos ao normal como Ca

2+ é removido por transportadores, tais como o Na

2 + – Ca

2+ permutador na membrana plasmática, a ATPase endoplasmático sarcoplasmático ( SERCA) na membrana do RE, Ca

2+ uniporter na mitocôndria, e por ligação a proteínas de ligação de elevada afinidade [4], [5]. Neste relatório nós apresentamos evidências de que níveis fisiológicos de ácido bórico (BA) inibem armazenado Ca

2 + liberação de locais sensíveis agonistas RyR.

Boro (B) é o 9

th elemento mais abundante na água do mar (425 mM B) e até recentemente rejeitado como biologicamente irrelevantes [6]. B está ligado a oxigénio na natureza e nos fluidos fisiológicos 98,4% está presente sob a forma de B (OH)

3 ácido bórico e 1,6% como B (OH)

4

– borato. Biologia usou este elemento da estrutura de várias moléculas, incluindo: fungos antibióticos em [7]; quorum sensing auto indutor 2 em bactérias [8]; e o dímero de ramnogalacturonano-II em plantas [9]. Em plantas, B é necessária para o alongamento das células, a floração e a formação das sementes e constitui uma parte integrante de culturas alimentares. Não-carregada BA atravessa a membrana plasmática de células epidérmicas de raiz para o citosol por difusão passiva e isto é facilitado pela NIP5; 1 transportadores [10]. BA é parcialmente convertido em borato no citosol (pKa 9,6) e transportado para o xilema através do transportador de exportação BOR1 [11], [12]. Um homólogo humano de NaBC1has BOR1 nomeados sido relatado para estar presente em linhas celulares de mamífero e para melhorar a proliferação celular a concentrações baixas BA [13], mas esta tem ainda de ser confirmado por qualquer outro laboratório. O efeito da BA sobre o crescimento e a proliferação celular em truta, peixe-zebra e a HEK de mamífero e células HeLa a seguir uma forma de U invertido, com concentrações mais elevadas que provocam inibição do crescimento de células [13] – [15]. As concentrações de 60 a 100 uM BA inibir a proliferação celular em células de cancro da próstata enquanto que altas concentrações de 500 a 1000 BA uM são necessários para inibir a proliferação de células epiteliais da próstata não tumorais ao longo do mesmo período de tempo [16].

níveis sanguíneos Humanos da BA reflectem a geologia local, qualidade da água, e as plantas na dieta com uma gama mundial de 2 a 120? M (21-1232 ng B /g sangue molhada) em homens vivos livres saudáveis ​​e mulheres [17 ], [18]. Vários estudos humanos foram observados uma diminuição do risco de cancro da próstata e pulmão, e citopatologia cervical anormal em proporção com a quantidade de B ingeriu a partir de alimentos e de água [19] – [22]. Um estudo não se observou um efeito protetor, mas diferiram de outros estudos em usar um banco de dados B comida diferente e conteúdo B estimado de alguns alimentos [23], [24].

A plausibilidade biológica para o efeito quimiopreventivo de BA é apoiado por várias linhas de investigação. Em ratinhos imunocomprometidos, a suplementação BA reduziu o crescimento dos tumores da próstata humanos transplantados, diminuição de IGF-1 concentrações nos tecidos, e da próstata reduzido níveis de antigénio no soro específicas [25]. Em cultura de células, BA reduziu a proliferação de linhas de células de cancro humano da próstata numa forma dependente da dose e inibiu a migração celular e invasão [16], [26], [27]. Descobrimos a relação entre a capacidade da BA para inibir a proliferação de células de câncer de próstata e sinalização de cálcio após estudos de espectrometria de massa mostrou a afinidade da BA para NAD

+ foi reduzida de fosforilação e, portanto, potencialmente sujeitos a regulação biológica [28], [29]. BA também foi mostrado como sendo um inibidor não competitivo de ADP-ribosil-ciclase [30]. Isso nos levou a estudar o seu impacto sobre o NAD

+ /cADPR Ca

2 + via de liberação. Nós mostramos que os níveis farmacológicos de BA (250 e 1000 um), mas não ácido metilborónico, diminuiu NAD

+ libertação estimulada de Ca

2+ sem afectar a libertação de cálcio quando aplicado sobre a sua própria [27]. Não ficou claro a partir desses estudos se BA foi inibindo Ca

2 + libertação por interferir com NAD

+ conversão para cADPR, bloqueando liberação de Ca

2 + lojas, ou interferir com a CCE. Ele também levantou a possibilidade de que as concentrações BA na faixa normal de sangue pode ser capaz de inibir Ca

2 + libertação do receptor rianodina (RyR) lojas sensíveis. Aqui demonstramos que níveis fisiológicos de BA inibir Ca

2 + liberação das lojas que respondem RYR em células epiteliais da próstata humana e menor luminais Ca

2 + níveis.

Métodos

celular culturas

Experiências utilizadas linhas celulares de cancro da próstata DU-145 e LNCaP e a linha celular de não tumor, PWR1E. As células foram cultivadas e mantidas em placas de cultura de células a 37 ° C em 95% de ar e 5% de CO

2 incubadora humidificada. Para as experiências de confocal, as células foram cultivadas na tampa de vidro desliza durante 24 horas antes dos ensaios de palco e estudou a uma confluência de menos do que 80%. células DU-145 e PWR1E foram adquiridos a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e LNCaP foi um presente do Dr. Allen Pantuck do Departamento de Urologia da Faculdade de Medicina Geffen da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Meios de cultura celular RPMI foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml), e L-glutamina (200 mM). células não tumorais PWR1E foram mantidas em meio de queratinócitos contendo estreptomicina (100 ug /ml), L-glutamina (200 mM), 2,5 ug de EGF recombinante humano, e 25 mg de extracto de pituitária de bovino (Gibco, Carlsbad, CA). Boro empobrecido meios foram preparados utilizando o boro resina de permuta iónica específica, Amberlite IRA-743 (Sigma) como previamente descrito [16] e modificado como se segue. Nove gramas de IRA-743 resina de permuta iónica autoclavados foram adicionados a 500 ml de meio e misturados em um rotador órbita a 75 a 100 rpm durante 15 a 20 horas a 9 ° C.

Medição de Ca

2 + Transitórios

Armazenamento Ca

2 + alterações foram controladas usando o cálcio corante sensível Rhod-2, éster AM (Biotium, Hayward, CA) que se acumula em organelas. Rhod-2, éster AM tem um Kd de 1 mM e foi mostrado para compartimentar, particularmente nas mitocôndrias, mas como se mostra, em outros organelos assim (fig. 1). Nós também utilizado ER Rastreador verde e Mito verde Tracker (Molecular Probes, Carlsbad, CA) em conjunto com Rhod-2, éster Am. Eles são marcadores fluorescentes altamente específico para o retículo endoplasmático e mitocôndrias, respectivamente. Analisamos Ca

2 + mudanças em resposta a BA e vários agonistas, selecionando regiões de interesse em células que se sobrepôs ao Rhod-2 vermelho Ca

2 + etiqueta com o rastreador ER verde (Fig. 1A) [31] – [33]. Rhod-2, éster AM foi preparado como uma solução-mãe 1 mM em DMSO e diluídas em meio RPMI completo ou meios completos de queratinócitos a 3 uM. As células foram incubadas com o éster de Rhod-2 AM (5 uM) e ER ou MT Rastreio (0,5 uM, 250 nM, respectivamente) em meio RPMI ou meios de queratinócitos durante 30 minutos a 37 ° C. Ca

2 + libertação foi estimulado usando agonistas em combinação com diferentes concentrações de BA em solução de Ringer. As imagens foram coletadas com uma Zeiss LSM 510 5 Pascal montado em um microscópio vertical (Zeiss Axioplan 2) equipado com uma objectiva de imersão em água Axoplan X63 (NA 0,95). Um laser de HeNe foi utilizado para excitar Rhod-2 a 543 nm. 488 nm a partir de um diodo de laser foi utilizado para excitar ER ou MT Tracker. A emissão foi recolhido num tubo fotomultiplicador através de um filtro PB de 560 nm para Rhod-2 e um filtro LP 505 para ER e rastreadores Mito. ampliação adicional, séries temporais e subtração de fundo eram controlados usando software de aquisição Zeiss LSM. Todas as imagens foram obtidas em 12 bits.

A. Duas células DU-145 marcados com fluorescência fluoróforo cálcio intracelular vermelho, Rhod-2, e etiqueta retículo endoplasmático verde fluorescente, ER Tracker. O amarelo indica sobreposição de Ca

2 + e ER e o círculo representa a região de interesse (ROI) analisados ​​nestas experiências. As setas indicam organelas: Nucl (nucléolo), nuc (núcleo), ER (retículo endoplasmático) B. Dois DU-145 células marcadas com vermelho fluorescente Ca intracelular

2 + fluoróforo, Rhod-2, e no rótulo mitocondrial verde fluorescente, Mito rastreador. Amarelo indica sobreposição de cálcio e mitocôndrias. As setas indicam organelas:. Nucl (nucléolo), nuc (núcleo), mt (mitocôndrias)

Análise de Ca

2 + liberação usando microscopia confocal

tratamentos BA foram aplicadas em Ca

2 + solução gratuita de Ringer preparadas usando água ultrapura para remover B [16], [34]. Ca

2+ libertação do RyR foi activada pela adição de 25 uM, quer para cADPR digitonina 10 uM células permeabilizadas, ou de 20 mM de cafeína ou 100 uM 4-cloro-m-cresol (4cmc) em células intactas [35] , [36]. A inibição de Ca

2+ libertação foi conseguida utilizando 10 uM dantroleno ou concentrações variáveis ​​de BA, na presença de um agonista [37]. SERCA foi inibida usando ácido ciclopiazônico 10 uM (CPA) [2]. Todas as aplicações de droga foram para uma duração de 30 segundos na solução de cálcio livre de Ringer (NaCl 143 mM, KCl 5 mM, MgCl 1 mM de

2, 10 mM de glucose, 10 mM de HEPES, 1 mM de EGTA-2H

2O, 1 EGTA mM), a fim de visualizar Ca

2 + libertação das lojas sem a entrada de Ca externa

2 +. Drug Application foi seguido por uma lavagem de três minutos em solução de Ringer contendo (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, glicose 10 mM, HEPES 10 mM) de cálcio. As soluções foram apresentadas para a câmara de perfusão a um caudal de 1 ml /min usando um de uma única passagem, sistema de perfusão de alimentação por gravidade. imagens confocais foram tomadas a cada segundo e começou a 2 minutos antes da primeira aplicação dos tratamentos, a fim de estabelecer uma linha de base da intensidade da fluorescência. A alteração na intensidade da fluorescência (F) causada pela aplicação da droga foi comparada com uma medição de linha de base que consistia em média de três medidas, antes da aplicação do fármaco (FO). Todas as medições foram normalizadas para a linha de base desta forma utilizando o rácio F-FO /FO. Tipicamente 6-10 células foram analisadas em um campo de vista e todas as experiências foram realizadas com um mínimo de três preparações independentes. A ordem de aplicação de drogas foi baseada em uma experiência inicial envolvendo aplicações só de agonistas consecutivos. Se o 2

nd aplicação do agonista causou um Ca inferior

2 + liberação do que o 1

st, as células foram tratadas com agonista além BA em primeiro lugar. Isso evitou a possibilidade de que mediu a inibição da Ca

2 + liberação devido a BA foi em parte devido a células refratários feitos até pelo tratamento prévio com agonista.

Análise dos níveis de cálcio armazenados

DU-145 células de cancro da próstata foram tratados com BA, durante 1 a 72 horas em meios desprovidos de boro utilizando Amberlite IRA-743 resina de permuta iónica (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como descrito anteriormente. Imediatamente antes da análise as células foram removidas a partir da placa, utilizando 1% a digestão com tripsina, centrifugadas e marcadas durante 45 minutos em meios padrão com 3 uM Rhod-2 éster AM para armazenamento Ca

2+ análise. A fim de monitorar citoplasmáticos Ca

2 + níveis, as células foram marcadas com 5 uM de Indo-1 AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 45 minutos. As células marcadas foram então lavadas e ressuspensas em 1 ml de meio normal. A fluorescência foi analisada utilizando um fluxo analítica Beckton Dickinson BD LSR-I citómetro. Rhod-2 excitação foi realizada com um laser de árgon 514 nm e analisadas no (581 nm) do canal FL-2. Indo-1 estava animado com um laser UV (351 nm) e analisados ​​em 400 nm (FL5) e 510 nm (FL4) filtros passa-banda. Resultados para Indo-1 células marcadas são dadas como razões de fluorescência (FL5 /FL4). Dispersão frontal e lateral foram usados ​​para deixar de fora os fragmentos celulares [38]. fluxo bruto citometria dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo (Treestar Software, San Carlos, CA, EUA). Os resultados são apresentados como% de Ca

2+ níveis comparação com células não tratadas. Armazenamento Ca

2 + níveis também foram analisados ​​em BA tratadas e células não tratadas, comparando Ca

2 + armazenamento de esvaziamento em resposta a 100 mm thapsigargin usando microscopia confocal [39].

A análise estatística do

dados

os dados são apresentados como média ± SD e foram analisados ​​por meio de Student ou o teste t não pareado ou ANOVA de uma via para comparações múltiplas com teste de comparações múltiplas post-hoc de Dunnett utilizando Graphpad Prism 4.0. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A equação para não linear um local de ligação (hipérbole) Y = Bmax * X /(K

X + d) foi usada para calcular K

d e valores de Bmax utilizando o software GraphPad.

Chemicals e suprimentos

B foi retirado da água e mídia usando métodos previamente descritos [13]. A cafeína, 4-CMC, ATP, CPA, dantroleno, tapsigargina, cADPR, digitonina e ácido bórico foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO) diluído em cálcio Solução de Ringer livre para garantir que se DMSO foi de níveis presentes eram não superior a 0,1 %. Todas as soluções foram preparadas logo antes do perfusão. Superfusão com 0,1% de DMSO na solução de Ringer livre de cálcio não afetou ER Ca

2 + níveis ou respostas de imagem.

Resultados

O objetivo do estudo foi determinar se as concentrações fisiológicas de BA inibir a liberação de Ca

2 + a partir de lojas sensíveis RYR em células epiteliais de cancro da próstata humana e não-tumorais. células DU-145 foram carregados com Rhod-2 e ER rastreador ou Mito rastreador para determinar se Rhod-2 compartimentada em um ou ambos os compartimentos. Não foi possível delinear Ca

2 + sinalização do ER contra mitocôndria em células vivas usando microscopia confocal. Rhod-2 marcado Ca

2 + na mitocôndria, ER, nucléolo, e outras áreas na célula (Fig. 1A-B). Em nossos experimentos, uma combinação de ER Tracker e Rhod-2 foram utilizados para definir as nossas regiões de interesse em sites de Ca armazenado

2 + (Fig. 1A). Esta área incluída Ca

2 + lojas localizadas na ER e mitocôndrias (Fig. 1A-B). Aplicação da BA a partir de 0,1-1000? M isoladamente não demonstrou um efeito mensurável imediato sobre armazenamento de Ca

2 + usando microscopia confocal (dados não mostrados).

O ácido bórico inibe Ca

2 + lançamento em resposta a agonistas do receptor rianodina

para determinar se BA inibida Ca

2 + libertação da RyR, nós tratados DU145 células com três agonistas RYR diferentes em combinação com BA. A análise de ligação ao ligando competitiva mostrou BA foi um único local inibidor competitivo reversível de cADPR, um agonista endógeno do RyR (Fig. 2A-C). A constante de equilíbrio de dissociação (K

D) para cADPR era 15.10, mas na presença de BA aumentada para 49,39. A inibição pela BA foi invertido pelo aumento da concentração de cADPR e a presença de BA não alterou o número máximo de locais de ligação (Bmax) (Tabela 1).

. 50 mM BA inibiu 25 um cADPR induzida Ca

2 + release (n = 6; *** p 0,001). B. estudo de ligação ao ligando competitiva mostrou BA era um antagonista competitivo surmountable de cADPR em um único modelo site. As concentrações de BA foram realizadas a 50? M. Em baixas concentrações cADPR BA mudou a resposta liberação Ca

2 + para a direita, mas isso foi revertido em concentrações cADPR mais elevadas e a resposta máxima (Bmax) não foi alterada. Cada ponto é a média de n = 6. R

2 é 0,9155 e 0,8606 para cADPR sem e com BA, respectivamente.

Em seguida, analisamos o efeito da BA na outra agonistas RYR em células intactas. Nós usado pela primeira vez cafeína [20 mM] um agonista que potencializa a sensibilidade RyR ao seu ligando nativo, Ca

2 +. Em resposta a duas aplicações consecutivas de cafeína, a segunda libertação foi ligeiramente maior do que a primeira (Fig. 3A). Esta sequência foi então repetida com a BA adicionado em combinação com cafeína na segunda aplicação. Os resultados destas experiências mostram que a BA reduzida Ca

2+ libertação de uma forma dependente da dose entre 10 e 150 uM BA (Fig. 3B-F). Em seguida, examinaram o efeito da BA em 4CmC, um agonista directo do RyR. aplicações consecutivas de 50 mM 4CmC resultou em Ca equivalente

2 + release (Fig. 4A). Tal como observado com a cafeína, BA diminuiu 4CmC estimulada Ca

2+ libertação de uma forma dependente da dose (Fig. 4B-E). No entanto, a inibição começou a 1? M BA e atingiu um máximo em 10 mM BA.

A. Ca

2+ libertação nas células DU-145, em resposta aos pedidos consecutivos de cafeína 20 mM (n = 6, * P = 0,0168). B. BA 10 uM inibiu significativamente Ca

2+ libertação (n = 6, ** p 0,01). C. 20? M M BA inibiu significativamente Ca

2 + release (n = 6, * p = 0,0163). D. 50 mM BA inibiu significativamente Ca

2 + release (n = 6, ** p = 0,0042). E. 150 uM BA inibiu significativamente Ca

2+ libertação, n = 6, p = 0,0001 ***. F. combinado de análise de dados mostrando efeitos dose-resposta inibitória da BA na cafeína estimulou Ca

2 + libertação, (n = 6 por concentração, ** p 0,01). As Figuras 2-9, cada barra representa a resposta média de 6 experiências (n = 6) com 3 repetições. As varreduras de linha à direita de cada gráfico de barras são respostas representativas de uma única experiência.

A. aplicações consecutivas de 4-CMC não alterou a resposta de libertação de cálcio (n = 6, NS). B. BA 0,1 mM não inibiu Ca

2 + release. C. 1,0 uM inibido BA Ca

2+ libertação (N = 6, * P 0,05). D. 10 mM BA inibida Ca

2 + release (n = 6, *** p = 0,0005). E. análise de dados combinados mostrando um Ca

2 + resposta libertação dependente da dose (n = 6 por concentração (** p . 0,01)

Estudos anteriores demonstraram que o efeito inibitório da BA sobre a proliferação celular no ic

50 para células DU-145 foi de aproximadamente 10% menos eficazes na linha celular de cancro da próstata LNCaP menos agressiva. Além disso, a BA não foi capaz de atingir uma redução de 50% na proliferação em não-tumoral PWR1E próstata células epiteliais em experimentos utilizando até 4 vezes o IC

50 para DU145 [16]. Nós examinamos essas linhas de células para determinar se a BA também foi menos eficaz na inibição da cafeína sensível Ca

2 + release. a inibição da Ca

2+ libertação em resposta a cafeína em células de tumor de próstata LNCaP ocorreu ao longo de 20 uM-150 uM BA (Fig. 5A-D). Assim, as células LNCaP foram menos sensíveis à BA comparação com DU-145. As células LNCaP foram não sensíveis ao tratamento 4CmC (não mostrado). O não-tumoral PWR1E, linha de células de próstata hiperplásica exigido 150 uM para inibir BA cafeína estimulada Ca

2+ libertação (fig. 6A-D). PWR1E células eram não-responsivo ao tratamento 4CmC (não mostrado).

. inibição de 20 uM de BA libertação de cálcio (N = 6, * P = 0,0226). B. inibição de 50? M BA de Ca

2 + release (n = 6, ** p = 0,0019). C. 150 mM a inibição BA de cafeína induzida Ca

2 + release (n = 6, *** p 0,0001). D. Dados Combinadas que mostram a inibição dependente da concentração de cafeína estimularam a libertação (n = 6, ** p 0,01)

A.. aplicações cafeína consecutivos em células PWR1E próstata. (N = 6, NS). B. BA 50 mM e cafeína induzida Ca

2 + libertação não mostra inibição (n = 6, NS). C. 150? M BA cafeína inibida induzida Ca

2 + release (n = 6, ** p = 0,0029). D. dados combinados demonstram que não há resposta à dose e inibição apenas com 150? M (n = 6, * P 0,05).

O ácido bórico inibe Ácido ciclopiazônico induzida Ca

2 + liberação do ER

a libertação de ER Ca

2 + lojas em algumas células não-excitáveis ​​pode ser estimulada utilizando ácido ciclopiazônico (CPA) SERCA que inibe de um modo semelhante a tapsigargina, mas pode ser lavado para fora [40] . BA (0,1-1000 | iM) por si só não alterou os níveis de armazenamento de cálcio durante o curso do tempo da experiência (não mostrado). As respostas a pedidos consecutivos de CPA [10 mM] não decair (Fig. 7A). A aplicação simultânea de CPA e 1 uM BA causou uma redução significativa na libertação e 10 uM BA causada perto inibição completa (Fig. 7B-D). Em seguida, testamos o efeito de dantrolene, um conhecido inibidor da RyR em Ca

2 + liberação pela CPA. Descobrimos que 10? M dantrolene inibida CPA estimulado Ca

2 + libertação a um nível equivalente a 10 BA? M (Fig. 8A-B).

As células foram testadas com CPA + BA seguido de CPA. A. aplicações consecutivas de CPA não alterou Ca

2 + release (n = 6, NS). B. 0,1 mM M BA não inibiu CPA estimulado Ca

2 + release (n = 6, NS). C. BA 1,0 mM inibiu CPA estimulado Ca

2 + release (n = 6, ** p = 0,0037). D. BA 10 mM inibiu CPA estimulado Ca

2 + release (n = 6, *** p 0,0001)

A.. As células foram testadas com CPA (10 uM) + dantroleno (10 uM) seguido de CPA (N = 6, *** p 0,0001 B. BA inibida CPA estimulada Ca

2+ libertação de uma forma dependente da concentração A.. efeito inibitório do dantroline e BA foram equivalentes a 10 uM, CPA (n = 6, ** p 0,01).

tratamento com ácido bórico reduz o armazenamento [Ca

2 +] sem efeito sobre citoplasmática [Ca

2 +]

Nossos resultados mostram BA inibida Ca

2 + libertação levar-nos a analisar [

2 + Ca]

níveis relativos st usando Rhod-2 células coradas e [Ca

2 +]

níveis cyt relativos usando Indo-1 células coradas e citometria de fluxo. a exposição de células DU-145 para a BA [10-50 mM] por 24 horas não afetou [Ca

2 +]

cit (Fig. 9A). no entanto, as reduções [Ca

2 +]

st (22%) ocorreu com 10 mM BA resultou em uma redução de 32% na [Ca

2 +]

r por BA 50 uM a 1 hora (Fig. 9B). As concentrações mais elevadas nem BA Nem o tratamento com 10 uM BA até 72 horas resultou numa redução adicional na [Ca

2+]

st (Fig. 9BC). em seguida, conduzidas medições confocal de thapsigargin estimulado Ca

2 + liberação depois que as células DU-145 foram pré-tratados com BA (50 mM) durante 24 horas e observaram uma diminuição de 35% no Ca

2+ liberação (Fig. 9D).

A. Relativa [Ca

2 +]

cit após a exposição a 0, 10 e 50 BA uM durante 24 horas (n = 5, NS). B. [Ca

2 +]

r como uma percentagem de 0 tratamento de DU-145 células tratadas com 0-250 uM BA durante 24 horas. ácido bórico [10-50 uM] reduziu os níveis de cálcio do ER por mais de 22% -32% em comparação com células não tratadas (n = 5, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). C. Redução da [Ca

2 +]

st em células DU145 tratados com 50? M BA partir de 1-72 horas (n = 5, ** p 0,01). D. confocal medição mostrou o pré-tratamento de células com BA durante 24 horas baixou thapsigargin estimulado Ca liberação

2 + em comparação com células não tratadas (n = 6, *** p 0,0001)

Discussão.

Este estudo relata a descoberta inesperada que armazenado Ca

2 + liberação e níveis luminais pode ser modulada por níveis fisiologicamente relevantes da BA no DU-145 células epiteliais de cancro da próstata. Isso é relevante para a nossa compreensão do risco de câncer desde os níveis sanguíneos de BA são determinados pelo consumo de B em água e derivados de plantas alimentos [17] potável. É provável que seja a primeira resposta celular à exposição B e, portanto, um ponto de partida para a compreensão de como o risco de cancro da próstata e do pulmão é reduzida por B de uma maneira dependente da dose [16], [21], [22]. BA exibiu os atributos de um antagonista clássico em que não tem um efeito imediato sobre Ca

2 + libertação quando aplicado por si só e seus efeitos foram agonista dependente. BA forma dependente da dose inibiu Ca

2+ libertação em resposta a cADPR, um agonista endógeno do RyR, e os agonistas de cafeína e 4-CMC (Fig. 2-5). Na nossa análise de ligação do ligando competitivo, BA exibida a característica única de um antagonista do local em que foi reversível em concentrações mais elevadas de cADPR (Fig. 2B). BA aumentaram K

d, 15,1-49,4, mas não afetou Bmax (Tabela 1). BA tem sido demonstrado que se ligam a cADPR em concentrações elevadas, no entanto, a capacidade de BA para inibir cADPR, cafeína e 4CmC induzida Ca

2+ libertação indica que, em concentrações fisiológicas BA pode ligar-se ao local de cADPR ligação na RyR estabilizar o Ca

2+ canal no seu estado inactivo [30].

a proliferação das células LNCaP foram relatados para ser cerca de 10% menos células não tumorais sensíveis e PWR1E são mais do que quatro vezes menos sensível do que a ba As células DU-145 [16]. Também observamos este padrão de sensibilidade na capacidade da BA para inibir a cafeína estimulou Ca

2 + release. A concentração mais baixa eficaz para DU-145 foi de 10 uM BA, LNCaP foi de 20 uM BA, e PWR1E foi de 150 uM BA (Fig 3F, 5D . 6D). Além da capacidade de resposta diminuiu para BA, tanto LNCaP e PWR1E eram não-responsivo ao tratamento 4CmC. RyR isoformas 1 e 2, mas não 3 são conhecidos por ser activada por 4CmC em algumas linhas de células [41]. É possível que as diferenças de linha celular eram devidas a diferenças na isoformas RYR ou a sua expressão. linhas de células LNCaP foram mostrados para expressar RyR 1 e 2, mas não 3 [42]. Nós não conseguimos localizar estudos na literatura que identificaram isoformas RYR em DU-145 ou células PWR1E em qualquer linha de células de próstata.

Testes de função renal mostraram BA é reabsorvida pelos rins em mulheres grávidas e não grávidas [43]. A descoberta de um eletrogênica, regulados por voltagem de bicarbonato de borato de co-transportador acoplado de sódio (NaBC1) nos túbulos renais de ratos pode explicar esta observação, mas que ainda não tenha sido confirmada por outro laboratório. expressão NaBC1 proliferação em células HEK e Hela induzida por activação da via MAPK 16 horas pós-tratamento [13]. Desconhece-se neste momento se NaBC1 é expresso em linhas celulares de tumor da próstata e não de tumor, mas as diferenças na sua expressão tem sido levantada como uma possível explicação para a variação da sensibilidade celular à ba entre as células de tumor da próstata e não tumorais [10 ].

para explorar ainda mais a capacidade da BA para inibir armazenado Ca

2 + libertação testamos seus efeitos na presença de CPA (Fig. 7-8). CPA inibe o canal SERCA resultando em esvaziamento do Ca

2 + lojas [44]. Nosso estudo mostrou que a dose CPA BA dependente bloqueado mediada Ca

2 + lançamento em células DU-145. Observou-se também uma redução de armazenamento de Ca

2 + níveis de 22% a 32% em 10 a 50 BA? M tratada DU-145 células em comparação com células não tratadas. proteínas STIM estão envolvidos no desencadeamento Ca

2 + influxo no ER [45] – [48]. Se BA reduz Ca

2+ fuga através de canais de RYR a grande perda por fuga pode ocorrer através de presenilinas e outras proteínas não-canal que não estimulam a proteínas STIM. Isso resultaria em diminuição armazenado Ca

2 + níveis que não são capazes de sinalizar recarga.

A importância do Ca

2 + no controle do ciclo celular e proliferação é uma área bem estabelecida de investigação do cancro, mas não tem sido estudado como um modo de acção na prevenção do cancro [49] – [51]. capacidade de BA para modular a proliferação das células tem sido associada a alterações na expressão de ciclinas e a via da MAPK em células DU-145, HeLa e HEK293 [13], [16], [26]. No entanto, é possível estes efeitos ocorrem em resposta a reduções de Ca

2 + libertação ou de armazenamento. Na linha celular LNCaP do cancro da próstata, Humez observado que o IGF (5 ng /ml), o que aumenta o crescimento de células, o aumento da ER [Ca

2 +]

ER, enquanto que o TNF alfa (1 ng /ml), que reduz a proliferação celular, redução da [Ca

2 +]

ER [52].

em conclusão, BA foi previamente relatado para reduzir o risco de cancro da próstata em humanos e reduzir o crescimento do tumor e da próstata proliferação de células de cancro, migração e invasão. Os nossos resultados demonstram que os níveis fisiológicos de agonista BA inibição estimularam a libertação de Ca armazenado

2+ de uma forma dependente da dose e inferior armazenado Ca

2+ níveis de armazenamento.