Abstract

supressor da sinalização de citocinas (SOCS) a família é um importante regulador negativo da sinalização de citocinas e desregulamentação do SOCS foi envolvido em muitos tipos de câncer. Todas as linhas celulares de cancro do colo do útero testados apresentaram menor expressão de SOCS1, SOCS3 e SOCS5 de tecido ou célula linhas normais. O resultado imunohistoquímica para as proteínas SOCS no tecido cervical humano também confirmou que o tecido normal expressa nível mais elevado de proteínas SOCS do que na vizinha tumor. Semelhante à regulação da SOCS em outros tipos de cancro, a metilação do DNA contribuiu para SOCS1 downregulation na CaSki, ME-180, e as células HeLa. No entanto, a expressão de SOCS3 ou SOCS5 não foi recuperado por meio da inibição de metilação de ADN. Histona desacetilação pode ser um outro mecanismo de regulação envolvidos na expressão SOCS1 e SOCS3, no entanto, a expressão SOCS5 era nem afetada por metilação do DNA nem desacetilação da histona. A expressão ectópica de SOCS1 ou SOCS3 conferido radiorresistência a células HeLa, o que implicou SOCS sinalização regula a resposta à radiação no câncer cervical. Neste estudo, nós mostramos que a expressão SOCS reprimida por, em parte, epigenetically e expressão alterada SOCS1 e SOCS3 poderia contribuir para o fenótipo radiossensível no cancro do colo do útero

Citation:. Kim MH, Kim MS, Kim W, Kang MA, Cacalano NA, Kang SB, et al. (2015) supressor de citocina (SOCs) Genes são silenciados por DNA Hipermetilação e histona desacetilação e regular a resposta à radioterapia em células de cancro do colo do útero. PLoS ONE 10 (4): e0123133. doi: 10.1371 /journal.pone.0123133

Editor do Academic: Rodney John Scott, da Universidade de Newcastle, Austrália

Recebido: 15 de julho de 2014; Aceito: 22 de fevereiro de 2015; Publicação: 07 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Os dados podem não ser disponibilizados devido a restrições éticas. Os dados estão disponíveis a partir Comissão /Ética KIRAMS Institucional de acesso a dados para os pesquisadores que preenchem os critérios para o acesso a dados confidenciais

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National R D Programa do Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro, República da Coreia (KIRAMS RTR: 504580-2012). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os membros do supressor da sinalização de citocinas (SOCS) família de proteínas desempenham papéis fundamentais na regulação negativa da transdução de sinal de citocinas. Estas proteínas agem em um loop de feedback negativo, inibindo as Janus quinase /transdutores ativada por citocinas de sinal e ativadores de transcrição (JAK /STAT) via de sinalização para modular as respostas celulares [1]. SOCS1 parece ter actividade supressora de tumores [2] e restauração da expressão do gene SOCS1 provoca supressão do crescimento e indução da apoptose em células de carcinoma hepatocelular [3]. Recentemente, Sobti et al mostraram perda de expressão SOCS1 através de metilação do promotor em mais de 60% dos casos de câncer do colo do útero e propôs a importância de SOCS1 downregulation na carcinogênese induzida pelo HPV cervical [4]. SOCS3 está envolvido no desenvolvimento e progressão de várias doenças malignas, e há indícios de que SOCS3 tem funções diferentes, dependendo da origem do tumor. No pulmão humano [5], hepatocelular [6], e câncer de cabeça e pescoço [7], SOCS3 é silenciada pela hipermetilação, o que dá uma vantagem de crescimento às células cancerosas. Em contraste, SOCS3 é detectável no cancro da mama [8], e expressão SOCS3 é aumentada durante o desenvolvimento e progressão do câncer de próstata [9].

É geralmente aceite que os cancros do colo do útero são radiossensíveis e os resultados do tratamento são ainda prometendo mesmo depois de o tumor é diagnosticado tarde demais para tratamento com histerectomia radical. Na Coreia, o câncer cervical é um importante problema de saúde para as mulheres, sendo responsável por 9,8% dos novos casos de câncer do sexo feminino. Embora as taxas de incidência e mortalidade têm vindo a diminuir, a incidência de câncer cervical em idosos está a aumentar [10]. No entanto, a maioria das falhas de tratamento em cancersoriginate cervical avançado do desenvolvimento de radiorresistência, um problema que ainda não venci. Curiosamente, SOCS1 sensibiliza as células de glioblastoma à radiação, enquanto que SOCS3 aumenta a sobrevivência das células de tumor e radiorresistência [11]. Zhou et al. sugerido que a segmentação de expressão ou função SOCS em células de glioblastoma pode ser uma estratégia útil para sensibilizar células de tumor à radiação ionizante. Embora a via de resposta a danos no ADN é crítico para controlar o stress genotóxico, o resultado da resposta é altamente dependente do contexto celular. Claramente, outras vias de sinalização activado na célula na altura de dano no DNA pode modular a resposta e alterar a saída de transdução de sinal induzida por danos no ADN [12].

No presente estudo, analisamos SOCS1, SOCS3 e SOCS5 expressão do gene em um painel de linhas celulares representando primário,

de novo

cancersthat cervical humano são radiossensíveis. Nós mostramos que a expressão SOCS1, SOCS3 e SOCS5 é reprimido, em parte, epigenetically por hipermetilação do DNA e desacetilação da histona. Mostramos que alterou a expressão SOCS1 e SOCS3 pode contribuir para o fenótipo radiossensível em câncer cervical.

Materiais e Métodos

tratamento

cultura de células, tecidos colo do útero normal e inibidor

O humano linhas celulares de carcinoma cervical CaSki, HeLa, ME-180, e SiHa foram obtidos a partir da linha celular coreana Banco (KCLB, Seul, Coreia do Sul). linhas de células de fibroblastos humanos normais CCD-18Lu, CCD-18Co, e WI-38 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As linhas de células CaSki e ME-180 foram mantidas em meio RPMI-1640 (PAA Laboratories, Pasching, Austria) e o HeLa, SiHa, e linhas celulares de fibroblastos normais foram mantidas em DMEM (PAA Laboratories), suplementado com soro bovino fetal a 10% ( Lonza, Walkersville, MD, EUA) e 100 unidades de penicilina e estreptomicina (PAA Laboratories). Todas as células foram cultivadas numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C. Para a inibição da metiltransferase de ADN, as células foram semeadas a uma densidade de 2-5 x 10

5/100-mm pratos e tratada com 5-azacitidina (5-AzaC) a 10 ^ M durante 72 h. Mídia e 5-AzaC foram substituídos a cada 24 h. Para a inibição de histona-desacetilase, as células foram tratadas com a Tricostatina A (TSA), a 100 ou 200 nM durante 16 h. Ambos os inibidores foram adquiridos a Sigma Chemical Co. (St Louis, MI, EUA). Um tecido colo normal foi obtido de um paciente submetido à histerectomia por mioma uterino. Obtivemos um consentimento informado por escrito de um paciente antes da cirurgia. A Institutional Review Board aprovou o processo de aprovação e o protocolo do estudo (K-1103-003-016) na Coreia do Instituto de Radiologia e Ciências Médicas.

RealtimeqRT-PCR

O RNA total a partir de células e tecido foi isolado utilizando o Hybrid-R total RNA Purification Kit (GeneAll, Seoul, Coreia do Sul). Um total de 1 ug de ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de reagentes PrimeScript RT (Takara Bio Inc., Japão) com 25 pmol de iniciador oligo-dT e 50 pmol de hexâmero aleatório. O ADNc foi diluída 1/10 com tampão de diluição EZ (Takara Bio Inc.), e 2 mL foi utilizado como molde numa reacção de 20 ul de PCR. Quantitative PCR foi realizada utilizando Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.) num termociclador CFX-96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Os seguintes iniciadores foram utilizados para PCR: ciclofilina A (CypA) (sentido, ACG GCG AGC CCT TGG; antisense, TTT CTG CTG TCT TTG GGA CCT), SOCS1 (sentido, TTT TCG CCC TTA GCG TGA A; antisense, CAT CCA GGT GAA AGC GGC), SOCS3 (sentido, GCT CCA AAA GCG AGT ACC AGC; antisense, AGT AGA ATC CGC TCT CCT GCA G), e SOCS5 (sentido, AAA AGT TGG ATC TGT TCC TAT GCC; antisense, ACT ATT ATC TGA CTT GTT TG). sondas fluorogênicos (6-carboxifluoresceína) foram: CypA, CGC GTC TCC TTT GAG CTG TTT GCA; SOCS1, CCT CGG GAC CCA CGA GCA TCC; SOCS3, TTG CGC ACG GCG TTC ACC AC; SOCS5, AGG ATG ATT TTG TGA ACC GTG AAG TAC GTG expressão do gene A. DNMT1 foi medido utilizando kit SYBR premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) com iniciadores (sentido, CTT CTT CAG CAC AAC CGT CA; antisense, GAA GAG CCG GTA GGT GTC AG). A quantificação relativa da expressão do gene foi calculado com o método de ddC (t), onde CypA ARNm foi utilizado para normalização. O programa de PCR foi como se segue: depois de um passo inicial de pré-incubação a 95 ° C durante 3 min, foram 45 ciclos, cada um consistindo em 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s. O último ciclo de amplificação foi seguido por uma análise da curva de fusão para certificar-se sobre a especificidade do qRT-PCR.

A imuno-histoquímica

Todas as amostras de tecido foram obtidas com aprovação ético completo a partir da revisão institucional KIRAMS pensão (IRB No. K-1103-003-016). coloração imuno-histoquímica para SOCS1, SOCS3, e SOCS5 foram realizados por um corante imuno-histoquímica automatizado (Autostainer 480, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, EUA) em secções de tecido embebidas em parafina fixadas com formalina de carcinomas de células escamosas do colo uterino obtidos. Os cortes foram desparafinados em xileno durante 15 minutos e pré-tratado num forno de micro-ondas usando 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) durante 30 min. As secções foram incubadas com anticorpos primários dirigidos contra SOCS1 (1:25, ab62584, Abcam, Cambridge, Reino Unido), SOCS3 (1: 100, ab16030, Abcam) e SOCS5 (1: 100, SC-100858, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, EUA) durante 60 min à temperatura ambiente e detectado utilizando Sistema de Detecção UltraVision LP HRP polímero DAB Além disso Chromogen (Thermo Fisher Scientific).

metilação específicas de PCR (MSP)

MSP foi realizado para investigar o estado de metilação das regiões promotoras do SOCS1, SOCS3, e genes SOCS5 . Após o tratamento com bissulfito para modificar o ADN, a PCR foi realizada para distinguir a partir de ADN metilado não metilado como descrito por Herman et al [13]. O ADN genómico foi extraído de linhas celulares utilizando o kit de Exgene celular SV (GeneAll, Coreia) e bissulfito de modificação de ADN genómico foi realizado utilizando o Kit de metilação do DNA EZ (Zymo Research, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN tratado com bissulfito-foi amplificado com qualquer um primers específicos de metilação ou iniciadores específicos para a sequência não metilado. Resumidamente, um volume de reacção de 20 uL contendo bissulfito modificado ADN 25 ng, um tampão × PCR, MgCl 1,5 mM

2, dNTPs 0,25 mM, 0,5 uM mistura de iniciadores específicos e uma unidade de enzima Ex-Taq Hot Start (Takara BioInc) foi usava. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 2%, corados com coloração de Ácido Nucleico RedSafe Solução (Intron, Coreia) e visualizados sob iluminação UV. listas de iniciadores e condições de PCR para MSP estão resumidos na Tabela S1.

Bissulfito sequenciação

ADN genómico-bissulfito tratado foi amplificado pelos iniciadores listados na Tabela S2. Os produtos de PCR foram clonados no kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) ou o t-romba PCR kit de clonagem (Solgent, Daejeon, Coreia do Sul). Cinco clones escolhidos aleatoriamente foram sequenciados e alinhados usando Quma (ferramenta de quantificação para análise de metilação).

Gene silenciamento por shRNA

Os plasmídeos de expressão shRNA Lentivirus segmentação DNMT1 foram gerados por clonagem de oligonucleotídeos no pLKO. 1 vector puro. As sequências de grampos segmentação DNMT1 são: GCCGAATACATTCTGATGGATCTCGAGATCCATCAGAATGTATTCGGC (TRCN0000021890) e GCCCAATGAGACTGACATCAACTCGAGTTGATGTCAGTCTCATTGGGC (TRCN0000021891). O controlo scrambled shRNA plasmídeo que expressa foi obtido a partir de Addgene com a seguinte sequência de gancho de cabelo: CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG. Em relação às embalagens, foram usadas dvpr pCMV-dR8.2 e pCMV-VSVG, ambos os quais foram comprados na Addgene (Cambridge, MA, EUA). A produção de partículas virais e a transdução de células alvo foi realizada seguindo o protocolo de pLKO.1 Addgene. Os sobrenadantes a partir de células 293T transfectadas pelo shRNA e vectores de embalagem foram recolhidos 48 e 72 h após a transfecção, seguido por concentração do vírus. vírus concentrado foi usado para as infecções na presença de 8 ug /mL de polibreno. Um dia após a infecção, a puromicina (1 jag /ml) foi aplicada durante 4 dias para seleccionar células transduzidas, que foram colhidas para análise de PCR em tempo real.

clonagem de SOCS que sobre-expressam as construções retrovirais

para Constrói superexpressando SOCS1, SOCS3, e SOCS5 foram feitas por clonagem do SOCS1, SOCS3, e SOCS5 ORF no vector retroviral pLNCX2 (Clontech). Os genes SOCS1 e SOCS3 de origem do rato foram gentilmente cedidas pelo Dr. Cacalano NA (UCLA, CA). O

Bam

fragmento HI contendo cDNA SOCS1 marcado com Myc no C-terminal ou cDNA SOCS3 marcado com FLAG no terminal C foi subclonado em

Bgl

II local de pLNCX2. Os clones com a orientação correcta foram rastreados com

Eco

RI digestão e, em seguida, confirmada por sequenciação. O gene SOCS5 de origem em ratinho foi adquirido à Openbiosystems (MMM1013-9202191) e amplificado com sentido (5′-AAACTCAGATCTACCATGGATGGATAAAGTGGGGAAAATG-3 ‘) e anti-sentido (5′-AGATATGGATCCCTCGAGCTACTACTTATCGTCATCATCTTTATAATCGATCTTTGCCTTGACTGGTTCTC-3’) iniciadores. A

Bgl

II e

Sal

Eu fragmento contendo SOCS5 com FLAG no terminal C foi subclonado no

Bgl

II e

Xho

Eu local de pLNCX2 retroviral vector.

a produção de vírus e o estabelecimento de células estáveis ​​

SOCS com superexpressão vetores retrovirais e embalagem plasmídeos, pCMV-Gag-Pol e pCMV-VSVG, foram co-transfectados em células 293T. Os sobrenadantes de células 293T foram recolhidos 48 e 72 h após a transfecção, seguido por concentração do retrovírus e utilizado para infectar células HeLa na presença de 8 ug /mL de polibreno. Um dia após a infecção, foi aplicado a G418 (200 ng /mL), até que colónias estáveis ​​formados. As colónias foram reunidas para verificar a superexpressão SOCS e utilizado para ensaio clonogénico.

análise Western blot

As células foram lisadas com tampão de amostra de SDS (Tris-HCl a 125, pH 6,8, SDS a 4% , glicerol a 15%, e 0,004% de azul de bromofenol) e depois fervido durante 10 min. O teor de proteína foi medida com o reagente de ensaio de proteína BCA (Intron). Quantidades iguais de lisado celular foram separados por gel de SDS-poliacrilamida, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, imunotransferidas e detectado por quimiluminescência utilizando reagentes de detecção ECL. Anti-myc, anti-actina e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, EUA) e o anticorpo anti-FLAG foi da Sigma Chemical Co.

ensaio clonogénico

sobrevivência clonogénica foi definida como a capacidade das células para manter a capacidade clonogénico e para formar colónias. Resumidamente, as células foram colhidas a partir de culturas em fase exponencial por tripsinização, contadas e semeadas para formação de colónias. No dia seguinte, a radiação gama, foi entregue usando uma dupla fonte

unidade de 137Cs a uma taxa de dose de 3,2 Gy /min com um GC-3000 Elan irradiador (MDS Nordion, Ontário, Canadá). Após 14 dias, as colónias foram coradas com violeta de cristal a 0,4% (Sigma Chemical Co.). As colónias foram contadas e grupos de 30 células foram consideradas colónias. A eficiência de plaqueamento (PE) representa a percentagem de células semeadas que crescem em colónias sob uma condição de cultura específica para uma determinada linha celular. A fracção de sobrevivência, expressos como uma função da irradiação, foi calculada como se segue: Sobrevivência = fracção de colónias contadas /(células semeadas × PE /100). Nós repetimos os experimentos cinco vezes para garantir a reprodutibilidade.

A análise estatística

Os dados são apresentados como média ± SD.

t

-test foi realizado e

p

-Valores inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

SOCS perfil de expressão câncer incervical de Student emparelhado células

Para revelar o possível papel da SOCS no desenvolvimento do cancro do colo do útero e proliferação, expressão de SOCS1, SOCS3 e SOCS5 foi examinado em várias linhas celulares de cancro do colo do útero humanos, CaSki, HeLa, ME-180, e SiHa. O nível de ARNm de SOCS1 (Figura 1A), SOCS3 (Fig 1B), e SOCS5 (Fig 1C) foi significativamente mais baixa em todas as células de cancro cervical testados do que no tecido normal colo do útero e cólon normal estabelecido (CCD-18Co) ou de fibroblastos de pulmão (CCD -18Lu, WI-38) linhas de células de viajantes

a expressão de SOCS1 (a), SOCS3 (B), e SOCS5 gene (C) foram examinadas por qRT-PCR no colo normal N Cx) tecido (, três linhas de células de fibroblastos normais (CCD-18Co, CCD-18Lu, WI-38) e linhas celulares de cancro do colo do útero (CaSki, HeLa, ME-180, SiHa). O nível de expressão de amostras de controlo normais marcada bar, aberto e de células do câncer do colo bar fechado. Asterisco (*), estatisticamente significativa (

p Art 0,05)

Para confirmar que a menor expressão de SOCS1, SOCS3 e SOCS5 em células de cancro do colo do útero é um fenómeno geral. observada em tumores humanos, coloração imuno-histoquímica de proteínas SOCS foi realizada em tecido de cancro do colo do útero humano e no tecido normal circundante como um controlo (Figura 2). Todas as três proteínas SOCS foram coradas mais escuras em (N) tecido normal em comparação com (T) na área do tumor. Todos esses resultados levaram à conclusão de que SOCS1, SOCS3 e SOCS5 ishigher expressão no tecido normal do que no cancro cervical, e apoiar a possibilidade de que a regulação negativa da SOCS pode contribuir para a tumorigênese ou manutenção de câncer cervical.

Expression nível de SOCS1 (a), SOCS3 (B), e SOCS5 (C) em tumor (T) e adjacente normal (N) de células epiteliais de uma amostra do paciente removidos cirurgicamente foram comparados.

metilação do DNA análise de SOCS promotor do gene

para determinar se a metilação do ADN contribui para a regulação negativa de proteínas SOCS em cancro cervical, foi efectuada uma PCR de ensaio específicos para a metilação (MSP). SOCS1 expressão foi correlacionada com a metilação do DNA diferencial apenas em CaSki, HeLa, e células ME-180 (Figura 3A). O promotor SOCS1 em células SiHa não foi metilado nesta região, embora SOCS1 transcrição foi regulada negativamente em células SiHa para um levelas semelhantes outras linhas de células do cérvix. Em contraste, não foi detectada a metilação do ADN na região promotora do SOCS3 SOCS5 e, pelo menos na região de CpG enriquecido examinados nesta experiência, de todas as linhas celulares de cancro do colo do útero (Fig 3A).

(A) Dissolveu-se A análise de PCR espec�ico. ADN genómico-tratada com bissulfito foi amplificado não metilado (U) ou iniciadores específicos metilados (M) de ADN. (B-D) sequenciação de bissulfito de SOCS1 (B), SOCS3 (C), e SOCS5 (D). Ilha CpG não metilado na região do promotor amplificado foi mostrado como um círculo aberto e metilado CpG como um círculo fechado.

Para confirmar o resultado MSP, as regiões promotoras de SOCS1, SOCS3, e genes SOCS5 abrangendo ilhas CpG foram clonados e cinco clones independentes foram sequenciados (Figura 3B-3D). locais de CpG não metiladas são indicadas por um círculo aberto e os locais CpG metilados são indicadas por um círculo a cheio. metilação de ADN foi detectado no promotor do gene SOCS1 em CaSki, HeLa e células ME-180, mas não em SiHa (Fig 3B), que corresponde ao resultado de MSP (Fig 3A). Em CaSki e HeLa, a região de SOCS1 metilado quase iguala a região não metilado, enquanto que em células ME-180 a maioria da região promotora foi metilada. locais CpG metilados não foram detectados nos promotores SOCS3 e SOCS5 em células normais cellsor cancro cervical (Figura 3C e 3D), coincidindo com a experiência de MSP (Fig 3A).

A inibição da hipermetilação do ADN restaura expressão SOCS1

para determinar se a metilação do DNA do promotor SOCS1 contribui para a regulação negativa da expressão do gene SOCS1

in vivo

, o tratamento com 5-AzaC foi usada para inibir a DNMT1 (Figura 4). Em CaSki (Figura 4A) e HeLa (Figura 4B), SOCS1expression foi proeminentemente aumentou após o tratamento com 5-AzaC. expressão em SOCS1 ME-180 foi ligeiramente aumentado por tratamento com o inibidor DNMT1 (Fig 4C), possivelmente devido tothe maior metilação do promotor do gene SOCS1 em células ME-180 (Figura 3A e 3B) do que nas outras linhas de células. SOCS3 expressão e SOCS5 não foi afectada pelo tratamento com 5-AzaC, suportando o resultado anterior (Figura 3) que a metilação de DNA não está envolvida na regulação negativa da SOCS3 e SOCS5. Este resultado foi confirmado por DNMT1 knock-downof shRNA mediada (Fig 4D-4F). interferência de RNA (RNAi) é a via pela qual curto ARN interferente (siRNA) ou ARN de gancho de cabelo curto (shRNA) são usados ​​para inactivar a expressão de genes alvo [14]. expressão SOCS1 foi aumentada pela inibição da DNMT1 enquanto expressão SOCS3 e SOCS5 aumentou pouco. Estes resultados, juntamente com os resultados da sequenciação de MSP e bissulfito, sugerem uma possibilidade de que os mecanismos de regulação que não seja hypermethylationare importante para controlar a expressão SOCS

CaSki (A, D), HeLa (B, E), e ME-180. (C, F), as células foram tratadas com 10? M de 5-azacitosina (5-Aza) durante 72 h (AC) ou infectadas com lentivírus controlo (shSCR) ou lentivírus expressando shRNA segmentação DNMT1 (shDNMT1) (DF). Knock-down de DNMT1 e expressão do gene SOCS foi examinado com qRT-PCR. Asterisco (*), estatisticamente significativa (

p Art 0,05)

acetilação das histonas regula SOCS1 e SOCS3 expressão do gene

histona desacetilação é um bem conhecido. mecanismo de regulação epigenética que nós testamos para uma associação com a infra-regulação da expressão do gene SOCS. Tratamento de Tricostatina A (TSA), um inibidor selectivo da família II de mamífero de histona desacetilase (HDAC) de classe I e enzimas, o aumento da expressão do gene em SOCS1 CaSki, HeLa e SiHa, mas não ME-180 células (Figura 5A). a expressão do gene SOCS3 também foi recuperado em células CaSki e SiHa, após o tratamento de TSA (Fig 5B). No entanto, a expressão destes genes não foi afectada pela TSA em WI-38, uma linha celular de fibroblastos de pulmão normal de controlo. Estes resultados sugerem que SOCS1 e SOCS3 são reprimidos por HDAC em várias células de câncer do colo do útero. Este é o primeiro relato de que a expressão SOCS é afectada não só pela hipermetilação mas também desacetilação da histona em células de tumores sólidos. Em contraste, a expressão do gene SOCS5 não foi alterada em todos por inibição de HDAC em WI-38 ou em qualquer uma das células de cancro cervical testadas (Figura 5C). Mais estudos são necessários para caracterizar os mecanismos suprimindo a expressão do gene SOCS em câncer cervical.

As células normais de fibroblasto de pulmão (WI-38) e as células cancerosas do colo do útero foram tratados com 0, 100 ou 200 nM de TSA durante 16 horas e SOCS1 (A), SOCS3 (B), e a expressão do gene SOCS5 (C) foi medida com qRT-PCR. Asterisco (*), estatisticamente significativa (

p Art 0,05).

A superexpressão de SOCS1 ou SOCS3 dotar radiorresistência a células HeLa

Para examinar os efeitos biológicos de expressão aumentada do gene SOCS em células de cancro do colo do útero, várias células HeLa foram estabelecidas por infecção com o retrovírus que sobre-expressam o gene de SPE. A expressão do gene SOCS exógeno em células HeLa resistentes neomicina foi confirmada por Western blotting (Figura 6A). Não houve diferença significativa observada na proliferação celular ou a viabilidade entre simulada ou SOCS que sobre-expressam células HeLa (dados não mostrados). Como SOCS1 e SOCS3 ter sido envolvido em resposta à radiação no glioblastoma [11], os ensaios clonog�icas foram realizados para avaliar a possível contribuição da expressão do gene SOCS para radioresponsivity. Como mostrado na Figura 6, a sobre-expressão de SOCS1 SOCS3 ou tornar as células HeLa mais resistentes à radiação do que as células de controlo (Fig 6B). No entanto, a radiossensibilidade das células HeLa sobre-expressam SOCS5 não foi alterada.

SOCS1, SOCS3, ou SOCS5 superexpressando células HeLa foram estabelecidas utilizando o vector retroviral pLNCX2 e a sobre-expressão foi confirmada por análise de Western blot (A). Um ensaio clonogénico foi realizada após a exposição à dose indicada de radiação em células que sobre-expressam SOCS (B). Os valores são médias ± desvio padrão para poços em triplicado para cada ponto de dose. Asterisco (*), estatisticamente significativa (

p Art 0,05)

Discussão

SOCS é uma grande superfamília de proteínas que são geralmente vistos como antagonistas de citocina induzida por Janus quinase activada sinalização-STAT. No entanto, SOCS está envolvido na regulação de vias de sinalização adicionais, incluindo fosfatidilinositol-3-quinase ERK e MAPK [15]. Estudos sobre SOCS e câncer cervical são em número reduzido. SOCS1may desempenhar um papel na regulação dos níveis da proteína E7 do vírus do papiloma humano, e que afectam o seu potencial de transformação [16]. Eles observaram tratamento com IFN-γ para HeLa e linhas de células CaSki resultou na redução da proteína E7. Kamio et ai. mostrou superexpressão de SOCS1 reduzida taxa de proliferação em ambas as linhas de células HeLa e CaSki. Eles também confirmada SOCS1 suprimiu a síntese de ADN através da observação reduziu a incorporação de BrdU [16]. No entanto, no aspecto da resposta imune, SOCS1 silenciamento melhorado os níveis de expressão de citoquinas pró-inflamatórias como as interleucinas, TNF-alfa, IFN-γ resultantes na apresentação de antigénios melhorada de células dendríticas [17]. Por isso, sugerimos que o efeito líquido da supressão SOCS1 vai desfavorável para os anfitriões. Os nossos resultados também sugerem a possibilidade que as proteínas SOCS funcionam como supressores de tumores. SOCS1, SOCS3, e expressão SOCS5 foi menor no cancro do colo do que o tecido normal circundante (Figura 2), e os níveis de mRNA de genes SOCS foram mais baixos em linhas celulares de cancro do colo do útero do que em linhas celulares de fibroblastos de tecido ou cérvix normal (Figura 1). Foi previamente relatado que a repressão acentuada da transcrição de genes SOCS resultou da hipermetilação do ADN na região do promotor [6,7,9]. Uma longa lista de genes hypermethylated é uma característica comum de todos os tipos de câncer humano. Apesar de muitos genes supressores de tumor são silenciados por metilação do DNA durante a carcinogênese, downregulation de SOCS3 e SOCS5 não estava dependente de hipermetilação DNA (Figuras 3 e 4). Outro gene epigenético mecanismo, hipoacetilação histona, silenciando SOCS1 medeia a regulação baixa em CaSki, HeLa, e células SiHa e CaSki SOCS3downregulation em células SiHa e (Fig 5). a expressão do gene SOCS5 não foi alterada em todos por inibição de metilação de ADN ou de acetilação da histona. Como gene silenciador muitas vezes envolve uma combinação de metilação do DNA e a acetilação cromatina histona, que também examinou o efeito da combinação de 5-aza e de TSA sobre a expressão de SOCS1 em células ME-180. No entanto, não foi observado aumento significativo na expressão de SOCS1 (dados não mostrados). regulação epigenética de genes SOCS em células de câncer cervical foi resumido na Tabela S3. Vale a pena lembrar que analisamos regulação do gene SOCS epigenética apenas em quatro linhas celulares de cancro do colo do útero estabelecidos e mais uma confirmação é necessária se este mecanismo de regulação é aplicável ao câncer de colo do útero primário.

Nossos dados mostraram que a expressão alterada de SOCS1or SOCS3 afetou a resposta da radiação de células de câncer do colo do útero. Superexpressão de SOCS1 e SOCS3 melhorou a sobrevivência das células após a radiação ionizante (Fig 6). SOCS1 é um activador importante de p53 e a resposta a danos no ADN [18]. Porque SOCS1 requer caixa SOCS para formar um complexo com ATM, v-Abl- ou Pim fosforilação mediada por quinase poderia interferir com esta interação e bloco de p53 ativação. Por conseguinte, afigura-se que a fosforilação aberrante por quinases oncogénicas poderia interferir com as actividades de supressor do tumor de SOCS1 por pelo menos dois mecanismos diferentes: (1) SOCS1 fosforilado não seria capaz de inibir a via de JAK /STAT e de interagir com ATM e promover p53 activação [18]. (2) SOCS3improves survivalin celular de glioblastoma [11], mas agiu como um chemosensitizer no cancro da tiróide anaplásico [19]. a sobre-expressão específica do queratinócito de SOCS3 levou a atrofia do epitélio da ferida margem aumentada e a resposta inflamatória dos queratinócitos da ferida por um aumento da quimiocina (MIP-2) e enzima inflamatória (COX-2 e iNOS) expressão de [20]. COX-2 contribui para a metástase do cancro do colo do útero, promovendo a expressão do VEGF autócrina ou parácrina em ambos os locais primários e metastáticos [21]. Por isso, é razoável sugerir que SOCS3 geralmente atua como um fator de sobrevivência celular, exceto no cancro da tiróide anaplásico. No entanto, SOCS1 agiu como um radiossensibilizador em células de glioblastoma [11]. É interrompida a transformação do epitélio cervical normal em células neoplásicas através de uma proteína E7, como um supressor de tumor. Por outro lado, SOCS1 inibiu a apoptose de enxertos de ilhéus devido a caspase 3 e vias de factor indutor de apoptose em pâncreas de ratos [22], o que indica que, consistente com os nossos dados, que promove a sobrevivência celular.

selvagem -tipo linhas celulares de cancro do colo do útero mostraram expressão reprimida de SOCS1, SOCS3 e SOCS5. Tanto a metilação do DNA e a desacetilação das histonas pode contribuir para a regulação negativa da SOCS 1, 3, 5 genes em células de cancro cervical. Recuperação da expressão do gene SOCS1 SOCS3 e diminuiu a radiossensibilidade das células HeLa. Parece improvável que a função do SOCS1 e SOCS3 em tumores sólidos agir uniformemente em uma direção

in vivo

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Informações de Apoio

Tabela S1. lista Primer e condição PCR para MSP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123133.s001

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S2 Table. lista Primer usado para seqüenciamento bissulfito

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123133.s002

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S3 Tabela. Resumo da regulação epigenética de genes SOCS em células cancerosas cervicais

doi:. 10.1371 /journal.pone.0123133.s003

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