Abstract

O câncer de próstata é o câncer mais comum entre os homens nos Estados Unidos. A citocina IL-6 ativa várias vias de câncer de próstata, mas a sua via de sinalização trans montante permanece mal compreendido. Neste estudo, avaliou-se o papel de IL-6 na expressão do gene PDCD4 e como o microRNA miR-21 regula este processo em células de cancro de próstata PC linhas-3 e LNCaP. O padrão de expressão de PDCD4 a partir de amostras de cancro da próstata humano, lesões pré-cancerosas, e hiperplasia benigna da próstata foi investigada por imuno-histoquímica. PDCD4 transcrição e tradução foram detectados por quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), e análise de transferência de Western, respectivamente. A modulação específica de PDCD4 por miR-21 foi analisada em células LNCaP de PC-3 e, e o efeito de IL-6 sobre a expressão de PDCD4 foi estudada in vitro. expressão PDCD4 em amostras dos 3 tipos de tecidos aumentou progressivamente, e os níveis de PDCD4 e antígeno prostático específico de expressão foram negativamente correlacionadas. Os níveis de ARNm e proteína PDCD4 em células LNCaP de PC-3 e transfectadas com anti-miR-21 construtos foram menores do que aqueles em células de controlo. A expressão de PDCD4 foi inibida pela IL-6, mas este efeito foi enfraquecida em linhas de células com baixa expressão de miR-21. O nosso estudo demonstra que a regulação da PDCD4 por miR-21 é orientada e IL-6 inibe a expressão do gene em células LNCaP PDCD4 PC-3 e a função alvo através de miR-21 em PDCD4. Estes resultados suportam a viabilidade de futuros esforços para a terapia de diagnóstico e gene do câncer de próstata que são baseados em IL-6, miR-21, e PDCD4

Citation:. Dong B, Shi Z, Wang J, Wu J , Yang Z, fang K (2015) IL-6 inibe a modulação alvejado de PDCD4 por miR-21 no câncer de próstata. PLoS ONE 10 (8): e0134366. doi: 10.1371 /journal.pone.0134366

editor: Craig N. Robson, Instituto Norte para Pesquisa do Câncer, REINO UNIDO

Recebido: 19 de fevereiro de 2015; Aceito: 08 de julho de 2015; Publicação: 07 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Dong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:. os autores receberam financiamento específico para este trabalho do Departamento Heath da província de Yunnan (Grant No.2010NS053). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais comum ea segunda causa de morte por câncer entre os homens nos Estados Unidos. Na China, a incidência de câncer de próstata está aumentando a cada ano. A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina pleiotrópica que estimula a proliferação e modula a eventos celulares importantes no cancro da próstata [1]. A expressão de IL-6 é elevada em cancro avançado da próstata [2], e se correlaciona com o grau de Gleason de cancro da próstata [3] e progressão do cancro da próstata [4]. IL-6 é um importante activador da cinase Janus transdutor /sinal e o activador da transcrição 3 via no cancro da próstata [5]. A IL-6 também pode activar a via da proteína quinase activada por mitogénio [6]. No entanto, a via de sinalização de IL-6 trans a montante no cancro da próstata permanece mal compreendido.

A morte celular programada 4 (PDCD4) é um supressor de tumorigénese, a progressão do tumor, invasão e que actua com ou sem iniciador de desafio. PDCD4 foi o primeiro supressor encontrada para atingir a tradução [7]. PDCD4 interage com factores de iniciação da tradução e elF4A eIF4G para inibir a tradução de um modo específico do mRNA, o que conduz à inibição de factores pró-oncogénicas [8]. A sobre-expressão de PDCD4 inibe a tumorigénese e progressão do tumor em um modelo de ratinho transgénico e inibe a invasão de células tumorais in vitro

.

MicroRNAs (MIRs) são pequenos RNAs não codificantes que são reguladores pós-transcricional da expressão de genes e reguladores importantes de várias processos fisiológicos e patológicos. miRs também afecta a produção de proteína [9] e desempenham um papel chave em diferentes tipos de tumores humanos [10]. expressão de miR-21 é mais elevada em alguns tumores sólidos [11-13], incluindo tumores da próstata, do que em tecidos normais [14]. Além disso, o miR-21 é um oncogene com função anti-apoptótica [15]. miR-21 inibe a apoptose em linhas celulares de cancro da próstata metastático independente de androgénios androgénio-negativo e PC-3 e DU-145 e pode regular a motilidade e invasão nestas linhas de células [16].

Neste estudo, verificou-se se IL-6 regula a expressão do gene PDCD4 e definida a função de miR-21 no presente processo, no cancro da próstata LNCaP e linhas celulares de PC-3.

Materiais e Métodos

Reagentes

as linhas de células PC-3 e LNCaP foram obtidas do Instituto Kunming de Zoologia da Academia chinesa de Ciências. IL-6 recombinante humana foi adquirida de R D Systems (Minneapolis, MN). Gibco meio RPMI 1640 e soro fetal de vitela foram adquiridos a Life Technologies (Grand Island, NY); HyClone 0,25% trypsinase da GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ); e DMSO a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-inibidor de miR-21 e anti-miR-21 de controlo negativo foram adquiridos a partir de ABI Biotech (EUA). Lipofectamine 2000 foi adquirido a Invitrogen (Carlsbad, CA). O kit RNAiso Além disso, para o isolamento de ARN, PrimeScript RT kit de reagentes para o ADNc de transcrição reversa, e perfeito Tempo real kit para quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) foram adquiridos a partir de Takara Bio (Mountain View, CA) juntamente com o marcador de DNA DL1000 . Primers para

PDCD4

e

GAPDH

foram obtidos a partir Sangon (China). anticorpo humano o anticorpo monoclonal e policlonal de coelho anti-anti-PDCD4 β-actina foram adquiridos a Abcam (Cambridge, MA). Anti-IgG de coelho, anticorpo ligado a HRP foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). O kit de ensaio de proteína BCA e o tampão RIPA lisado foram adquiridos a Beyotime Instituto de Biotecnologia (China). In situ kits de hibridização para HSP e DAB foram adquiridos da LBP Biotech Company (China).

As amostras dos pacientes

Vinte amostras de cada um de câncer de próstata, lesões pré-cancerosas, e amostras de tecido hiperplasia benigna da próstata de pacientes com câncer de próstata hiperplasia atípica adenomatosa, neoplasia intra-epitelial prostática ou hiperplasia benigna da próstata, respectivamente, foram fornecidos pelo Departamento de Patologia, o Segundo Hospital Afiliado da Universidade médica Kunming, Yunnan, China, a partir de janeiro de 2010 a outubro de 2011. Todas as amostras foram fixadas em formalina, incluídos em parafina e cortado.

cultura celular

LNCaP e células PC-3 foram cultivadas em placas de 25 ml em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina ( 100 U /mL) e estreptomicina (100 ug /ml) num banho a 37 ° C, 5% de CO

2 incubadora. O meio de cultura foi trocado a cada segundo dia.

Quantitative real-time PCR

PDCD4 expressão foi determinado por análise de qRT-PCR. As células (5 × 10

5) foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços, cultivadas durante 24 h, e incubou-se com IL-6 (0, 5, ou 10 ng /mL) durante 24 h. O ARN foi extraído utilizando o estojo de extracção de ARN RNAiso Além disso, de acordo com as instruções do fabricante. qualidade de ARN foi medida usando o kit de reagentes PrimeScript RT de acordo com as instruções do fabricante antes de se ARN transcritos de modo inverso em ADNc. Foram utilizados os seguintes iniciadores PDCD4: iniciador a montante 5′-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3 ‘e iniciador a jusante 5′-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3’. Foram utilizados os seguintes iniciadores GAPDH: iniciador directo 5′-TCACTTTGTCACAGCCCAAG-3 ‘e iniciador inverso 5′-AGCAAGCAAGCAGAATTTGG-3’. A transcrição reversa foi realizada a 37 ° C durante 15 minutos (reacção de transcrição reversa), seguido por 85 ° C durante 5 s (reacção de inactivação da transcriptase reversa), de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação foi realizada sob as seguintes condições: durante 2 ciclos a 95 ° C durante 30 s cada um, seguido por 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s

análise de Western Blot

As células (5 × 10

5) foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços, cultivadas durante 24 h, e incubou-se com IL-6 (0, 5, ou 10 ng /mL) durante 24 h . A proteína total foi extraído utilizando o tampão de lise RIPA, e a concentração de proteína foi medida pelo ensaio BCA. As proteínas foram separadas de acordo com o tamanho por electroforese, transferido para a película, e incubadas com os seguintes anticorpos: anticorpo PDCD4, 1: 5000; p-actina de anticorpo, 1: 8000; e o anticorpo secundário, 1: 5000. ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare Life Sciences) foi usada para a imagem dos géis.

transfecção celular e IL-6 tratamento

As células (5 × 10

5) foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços e cultivadas durante 24 h, para assegurar que a integração de células transfectadas foi, pelo menos, 60%. O meio foi mudado uma vez antes de 4 h a transfecção em meio isento de antibiótico com Lipofectamine 2000, de acordo com as instruções do fabricante. A concentração final do inibidor anti-miR-21 e controlo negativo foi de 30 nM. A mistura de transfecção foi incubada à temperatura ambiente durante 20 min e, em seguida, colocada num banho a 37 ° C, 5% de CO

2 incubadora durante 30 min. O meio foi substituído por fresco, meio RPMI antibiótico livre de 1,640 depois de 6 h. As células foram incubadas com ou sem IL-6 (10 ng /mL) durante 24 h antes de serem colhidos e utilizados para qRT-PCR e análises de Western blot para detectar a expressão PDCD4.

A análise imunohistoquímica

o cancro da próstata, lesões pré-cancerosas, e amostras de tecido de hiperplasia benigna da próstata foram seccionados em fatias de 2 mm de espessura e fixadas em formalina a 10% durante até 24 h. As fatias foram então desparafinadas, o antigénio foi recuperado a partir deles, e foram incubadas em peróxido de hidrogénio durante 15 min. O anticorpo primário (50 uL; concentração de 1: 500) foi adicionado a cada fatia e incubadas a 4 ° C durante a noite. Polímero HRP (anticorpo secundário HRP) foi adicionado a lâminas foram lavadas, e as lâminas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 min. Em seguida, 1 ml de DAB mais Substrato foi adicionado gota a gota a cada lâmina juntamente com 2 gotas de DAB mais cromogénio e incubou-se durante 10 min. As lâminas foram lavadas, contrastadas e desidratado antes de se adicionar o meio de montagem transparente e lamelas. Todos os cortes foram avaliados separadamente por 2 patologistas e graduada como -, +, ++, ou +++, dependendo da profundidade de coloração PDCD4 no citoplasma e núcleo. Também identificamos as células basais com a coloração p63.

Análise estatística

Os dados foram analisados ​​pelo software estatístico SPSS17.0. O teste do qui-quadrado foi utilizado para estimar diferenças entre as expressões de PDCD4 e PSA. O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para examinar a normalidade de dados de análise imuno-histoquímica, e ANOVA one-way foi usada para comparar a diferença entre os grupos de intervenção. diferença mínima significativa de Fisher (LSD) teste foi usado para testar diferenças entre os 2 grupos.

Ética Declaração

O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Segunda Hospital Afiliado da Universidade Médica Kunming e conduzida de acordo com a Declaração de Helsinki. A necessidade de obter consentimento informado por escrito foi dispensado pelo conselho de revisão institucional, porque este era um estudo retrospectivo. registros dos pacientes foram anónimos antes da análise.

Resultados

expressão PDCD4 em tipos de tecido da próstata

proteína PDCD4 foi expresso principalmente no citoplasma, mas foi também expresso em menor medida no núcleo das amostras de próstata e hiperplasia prostática pré-cancerosa. Houve uma diferença marcante no padrão de expressão PDCD4 entre espécimes de cancro da próstata, neoplasia intraepitelial prostática, e hiperplasia prostática (Fig 1). No carcinoma pouco diferenciado, expressão PDCD4 foi baixa ou ausente. PSA expressão foi maior em amostras de cancro da próstata do que aqueles a partir de hiperplasia benigna da próstata (Figura 1). Os resultados de PSA e coloração PDCD4 em diferentes tipos de tecido da próstata revelou que a menos diferenciadas do cancro da próstata, menor será o nível de expressão PDCD4 e quanto maior for o nível de expressão do PSA. Os resultados da coloração p63 mostraram que as células basais foi abundante em BPH, escasso em PIN e ausente em CaP tecido (Fig 1).

No câncer de próstata, quantidade considerável de glândula normal é falta. ninhos de câncer são formados com glândulas cribriforme irregulares e câncer se infiltra no tecido muscular e citoplasma da célula. Este padrão de coloração foi classificada PDCD4 (+), PSA (+++). Em neoplasia intra-epitelial prostática, o padrão de coloração foi classificada PDCD4 (++), PSA (++). Na hiperplasia prostática /hiperplasia glandular, o padrão de coloração nuclear foi graduada PDCD4 (+++), PSA (+/-). A expressão de PDCD4 e PSA foram diferentes (

x

2 = 8,632,

P Art 0,05) entre os 3 tipos de tecidos. No teste de Spearman, os níveis de expressão de PDCD4 e PSA entre os 3 tipos de tecido da próstata foram correlacionados negativamente (-1

r Art 0).

Efeito da miR-21 na inibição da expressão PDCD4

Um locus de miR-21-regulada na 3’UTR de PDCD4 foi avaliado em células de carcinoma cervical HeLa [17]. Para determinar se o miR-21 também regula a expressão PDCD4 no cancro da próstata, linhas de células LNCaP PC-3 e foram transfectadas com miR-21 inibidor para reduzir a quantidade de endógena miR-21 antes de se medir ARNm PDCD4 e a expressão da proteína por PCR em tempo real e imunotransferência, respectivamente. O nível de expressão de ARNm de PDCD4 foi maior no grupo transfectado do que em qualquer dos grupos de controlo, com a expressão em células LNCaP sendo mais elevado do que em células PC-3 (Figura 2a) (

F

= 20,562,

P Art 0,001). a expressão da proteína PDCD4 aumentou após LNCaP e PC-3 foram transfectadas com o inibidor de miR-21 (Figura 2b) (3-PC células:

Z = -3,920

,

P

0,001 ; células LNCaP:.

Z

= 3,883,

P Art 0,001), sugerindo que PDCD4 é regulada por miR-21 nestas linhas celulares de cancro da próstata

qRT- os resultados da PCR que mostram um aumento da expressão de mRNA de células LNCaP PDCD4 PC-3 e transfectadas com miR-21 inibidor, indicando que foi PDCD4 ARNm expressos diferencialmente entre os dois grupos. Entre as células-miR-21 inibiu a expressão do mRNA PDCD4 em células LNCaP foi significativamente mais elevado do que em células PC-3. a expressão de ARNm de PDCD4 LNCaP e PC-3 de células foi regulada negativamente após um tratamento de 24 horas com diferentes concentrações de IL-6. (B) análise de transferência de Western que mostra um aumento nos níveis de expressão da proteína PDCD4 em PC-3 e LNCaP células transfectadas com o inibidor de miR-21. Não transfectadas e as células de controlo negativo foram classificados de 1 a 6 no teste de classificação de amostras pareadas. Níveis de expressão de proteína PDCD4 de LNCaP e PC-3 de células foi regulada negativamente após um tratamento de 24 horas com diferentes concentrações de IL-6.

expressão PDCD4 depois de IL-6 tratamento

os resultados de análise de qRT-PCR revelou uma diminuição significativa na transcrição de PDCD4 em células LNCaP de PC-3 e após pré-tratamento com IL-6 (5 ou 10 ng /ml; Fig 3a). Os resultados da análise de mancha de Western revelou uma diminuição significativa na tradução de PDCD4 após pré-tratamento com IL-6 (5 ou 10 ng /ml; Fig 3b). Além disso, houve uma correlação negativa entre a concentração de IL-6 e o ​​nível da regulação negativa da expressão PDCD4. expressão PDCD4 diminuiu mais em células PC-3 do que em células LNCaP. As células PC-3 e LNCaP foram estavelmente transfectadas com o inibidor de miR-21 e, em seguida, tratado com IL-6 (10 ng /ml) para determinar o papel de miR-21 na regulação da expressão PDCD4 pela IL-6. Em ambas as células PC-3 e LNCaP, o nível de ARNm PDCD4 e expressão da proteína nos grupos transfectadas foi maior do que em qualquer dos grupos de controlo ou os grupos de controlo negativo (Figura 4). Como mencionado anteriormente, PDCD4 foi alvo de regulação de miR-21, e IL-6 inibiu a expressão PDCD4 através de miR-21.

Os níveis de expressão de mRNA em PDCD4 LNCaP e PC-3 foram regulados negativamente após um 24- h de tratamento com IL-6 a 0, 5, ou 10 ng /mL. A diferença houve significância estatística (a) entre si. A mesma diferença também foi observada nos níveis de expressão da proteína PDCD4 (b). (A) a expressão de ARNm de PDCD4 LNCaP e PC-3 de células foi regulada negativamente após uma 24-h de tratamento com IL-6 a 10 ng /mL. (B) a expressão da proteína PDCD4 de LNCaP e PC-3 de células foi regulada negativamente após uma 24-h de tratamento com IL-6 a 10 ng /mL,

PDCD4 expressão da proteína foi significativamente maior em células de cancro da próstata transfectadas com o miR-21-inibidor antes do tratamento Il-6 do que em células não transfectadas com o inibidor (teste ANOVA one-way:

F

value = 241,781,

P Art 0,05) . Os níveis de expressão da proteína PDCD4 em células transfectadas e não transfectadas de ambas as linhas celulares foram significativamente diferentes (teste de LSD:

P Art 0,05).

Discussão

neste estudo, verificou-se que a expressão da proteína PDCD4 diminuiu com uma diminuição no grau de diferenciação do tecido da próstata. Esta observação sugere que o grau de malignidade em tecidos de cancro da próstata está relacionado com a expressão PDCD4. Um padrão semelhante é observada em cancros do sistema digestivo [18], do cancro do fígado [19], carcinoma ductal da mama [20], e cancro nasofaríngeo [21]. Dado que os níveis de expressão PDCD4 diferem com a extensão da doença em tecidos da próstata, PDCD4 pode ser um marcador tumoral promissora tanto para o diagnóstico e tratamento do cancro da próstata (Figura 1). Nós também descobrimos que PDCD4 foi expresso tanto em células luminais e células basais em BPH, mas em tecidos PIN e PCA expressos principalmente em células luminais (Fig 1), e as expressões de PDCD4 e PSA foram negativamente correlacionadas em tecidos da próstata, sugerindo que o diagnóstico de cancro da próstata pode ser facilitada através da combinação da detecção dos 2 factores.

o nosso estudo revelou também que PDCD4 é um alvo de miR-21 regulação em células de cancro da próstata. miR-21 é conhecido por ser sobre-expresso em muitos tipos de tumores sólidos. miR-21 madura pode reduzir a expressão PDCD4 por induzir a via de TGF-β, que é um regulador de PDCD4 [22]. Além disso, um locus de proteína conservada foi identificado na sequência PDCD4, através do qual o miR-21 regula a expressão PDCD4 para induzir a invasão tumoral e metástase [23]. Consistente com os achados anteriores [24,25], o nosso estudo apoia que o miR-21 e PDCD4 tem uma correlação negativa, com miR-21 redução da expressão PDCD4 e induzindo a invasão da célula tumoral e metástases à distância.

Para determinar se miR expressões -21 e PDCD4 eram diferentes no cancro da próstata dependentes de androgénio-e independente de androgénios, realizamos nossos estudos na linha celular de cancro da próstata PC-3 e a linha de células de cancro de próstata dependente de androgénios LNCaP independente de androgénios. Em ambas as linhas celulares, PDCD4 era um alvo de miR-21 nos níveis de transcrição e tradução. No entanto, o mecanismo de acção de miR-21 na regulação PDCD4 foi diferente nas células dependentes de androgénio e independente de androgénios, com miR-21 inibição PDCD4 afectar a expressão em maior extensão em células PC-3 do que em células LNCaP. Assim, nossos resultados sugerem que o gene PDCD4 é alvo de miR-21 regulação no câncer de próstata.

Os níveis circulantes de IL-6 em tumores sólidos pode ser de significado prognóstico em pacientes com metastático e hormônio-refratário próstata cancro [26]. IL-6 promove a proliferação de células de cancro da próstata através da activação do receptor de androgénio (AR), e este efeito é inibido pelo anti-androgénios, tais como bicalutamida [27]. Além disso, o miR-21 pode regular a expressão de AR durante o desenvolvimento do cancro da próstata [28]. Os nossos estudos mostram que o miR-21 promove o crescimento de células de cancro da próstata por regulação negativa da expressão de PDCD4. Portanto, a RA pode ser o alvo comum para a IL-6 e miR-21 em cancro da próstata, com miR-21 desempenha um papel na activação de intermediário de IL-6 para regular a expressão PDCD4. Além disso, IL-6 afeta a expressão PDCD4 ao longo do desenvolvimento do câncer de próstata, tanto o câncer de próstata e câncer de próstata independente de androgénios. Dependente de andrógeno-

Conclusões

Este estudo fornece dados experimentais para dirigir os esforços futuros na terapia de gene do cancro da próstata e diagnóstico de que são baseados em IL-6, miR-21, e PDCD4.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Zhiwei Yuan para ajudar com análise imuno-histoquímica.