Abstract
A galectina-4 (Gal-4) é um membro da família galectina de glicanos proteínas de ligação que mostra uma expressão significativamente maior em tumores císticos do pâncreas humanos e em adenocarcinomas pancreáticos em comparação com pâncreas normal. No entanto, a função putativa de Gal-4 na progressão tumoral do câncer de pâncreas é ainda completamente compreendida. Neste estudo o papel de Gal-4 na progressão do cancro foi investigado, utilizando um conjunto de linhas celulares de cancro do pâncreas definidos, Pa-Tu-8988S (Patu-S) e Pa-Tu-8988T (Patu-T), como modelo . Estas duas linhas celulares são derivadas da mesma metástases do fígado de um adenocarcinoma pancreático humano primário, mas diferem nas suas características de crescimento e capacidade metastática. Nós demonstramos que Gl-4 de expressão é alta em Patu-S, o que mostra fracas propriedades migratórias, ao passo que muito mais baixos níveis de Gl-4 são observados na linha celular altamente metastático Patu-T. Em Patu-S, Gl-4 é encontrada no citoplasma, mas também é segregado e acumula-se na membrana em locais de contacto com as células vizinhas. Além disso, mostramos que Gal-4 inibe a formação de metástases, atrasando a migração de células de câncer de pâncreas
in vitro
usando um ensaio de zero, e
in vivo
usando peixe-zebra (
Danio rerio
) como um modelo experimental. Os nossos dados sugerem que a Gal-4 pode actuar na superfície celular de Patu-S como uma molécula de adesão para evitar a libertação das células tumorais, mas tem além disso uma função citosólica por inibição da migração através de um mecanismo ainda desconhecido.
Citation: Belo AI, van der Sar AM, Tefsen B, van Die I (2013) galectina-4 diminui a migração e formação de metástases de células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (6): e65957. doi: 10.1371 /journal.pone.0065957
Edição: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil
Recebido: 14 de fevereiro de 2013; Aceito: 29 de abril de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Belo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), em Lisboa, Portugal, através de bolsas de investigação SFRH /BD /44820/2008 atribuído a AIB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas é uma das principais causas de morte por câncer no mundo ocidental. Clinicamente estratégias eficientes para a detecção precoce da doença ainda não estão disponíveis. Incidência de câncer de pâncreas e mortalidade em pacientes com este tipo de câncer praticamente não diminuiu ao longo dos últimos 50 anos [1], [2], [3], [4]. Por isso ainda mais o entendimento dos mecanismos de início, progressão e metástase de câncer de pâncreas é justificada.
galectinas são proteínas que podem ser expressos de maneira aberrante no cancro e têm sido implicados na progressão do cancro [5], [6]. Eles consistem de uma família de lectinas de ligação ao galactósido solúveis que têm sido classificadas em três subgrupos, com base na sua estrutura e o número de domínios de reconhecimento de hidratos de carbono: protótipo (galectinas-1, -2, -5, -7, -10, -11 , -13, e -14), tipo quimera (tipo de galectina-3), e repetição em tandem (galectinas-4, -6, -8, -9 e -12) [revisto em [7]]. Eles funcionam numa grande variedade de processos biológicos intra e extracelularmente. Grades de galectina-glicoproteína desempenham um papel importante na regulação da função celular, como adesão célula-célula, célula-matriz extracelular (ECM) interações, o crescimento celular [8], a organização de domínios de membrana na formação jangada lipídica [9], [10] [11], a migração de leucócitos [revisto por [12]] e regulação de sinalização intracelular [13], [14], [15].
a expressão de galectinas é modulada durante o desenvolvimento de células individuais e pode ser alterada, sob diferentes condições fisiológicas ou patológicas. A galectina é frequentemente sobre-expressa em células cancerosas e células do estroma associadas a cancro, especialmente nos tipos de células que normalmente não expressam o galectina específica [16]. Na progressão do cancro, galectinas estão envolvidos na diferenciação, adesão, migração, angiogénese, a transformação maligna, a apoptose e a resistência à droga de cancro [revisto em [5], [17], [18], [19], [20], [21] , [22]]. Além disso, existem vários relatórios que têm ligações destas proteínas a invasão e metástases, em vários tipos de cancros [16], [23], [24], [25], [26], [27], [28].
neste estudo, têm-se centrado sobre o papel da galectina-4 (Gal-4) na metástase das células cancerosas do pâncreas. formação de metástases é um processo multi-passo, no qual as células de tumor primárias invadir os tecidos vizinhos, migram através da vasculatura para finalmente extravasar para o tecido perivascular e proliferam em tumores secundários. Gal-4 é um ácido amino-323 (36 kDa) da proteína que é predominantemente expresso no epitélio luminal do tracto gastrintestinal, da língua para o intestino grosso. Gl-4 de expressão não é detectada em pâncreas saudável, mas está significativamente aumentada em tumores císticos do pâncreas humanos e adenocarcinomas pancreáticos em comparação com amostras de tecido normal, enquanto que a sua expressão é baixa em tumores neuroendócrinos pancreáticas [26], [27], [29 ], [30], [31]. A função de Gal-4 em progressão tumoral e metástases no cancro pancreático, no entanto, permanece obscura. Neste estudo o papel putativo de Gal-4 na progressão do cancro foi investigado, utilizando um conjunto de linhas de células pancreáticas definidos. Os resultados demonstram que a Gal-4 é mais elevada expresso nas células tumorais pancreáticas mais diferenciadas em comparação com as células pancreáticas que demonstram capacidades metastáticas. Além disso, Gal-4 afeta formação de metástases, atrasando a migração e metástase das células cancerosas pancreáticas
in vitro
em um ensaio de zero e
in vivo
em embriões de peixe-zebra como modelo experimental.
h3> Declaração de Materiais e Métodos
Roy
– /-; nácar
– /- Casper
Danio rerio
(zebrafish) foram tratados de acordo com as normas de protecção dos animais locais e mantidos de acordo com protocolos padrão (zfin.org). A criação de peixes adultos foi aprovado pelo comitê de bem-estar animal local (Comitê de licenciamento Experimental Animal, DEC) do centro médico da Universidade VU. Todos os protocolos aderiram às diretrizes internacionais especificadas pela Diretiva de Proteção Animal da UE 86/609 /CEE, que permite que embriões de peixe-zebra a ser utilizado até ao momento de vida livre (cerca de 5-7 dias após a fertilização). Porque os embriões utilizados neste estudo encontrou estes critérios, nenhuma licença DEC é necessário para este estudo.
Os anticorpos, reagentes e Buffers
cabra anti-humana galectina-4 (BD Biosciences, Bélgica) foi usado para a detecção de Gal-4 e de murganho anti-tubulina (Cedarlane, Canada) foi usado como um controle endógeno. anticorpos secundários (ABS) usado foram Odyssey IRDye 680 de burro anti-cabra (0,5 mg); IRDye 800CW de cabra anti-IgG de coelho (LI-COR Biosciences, EUA); coelho anti-cabra Alexa Fluor 488; de coelho anti-cabra Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, EUA). TO-PRO®-3 Iodeto com fluorescência vermelha distante do Live Technologies (Invitrogen, EUA) foi utilizado como indicador de células mortas
recombinante Hgal-4 proteína foi comprado de BD Biosciences.; tampão de bloqueio LiCor foi adquirida da LI-COR Biosciences, EUA; lactose foi obtido a partir de Sigma (EUA) e vermelho fluorescente coloração de células CM-Dil de Vybrant, Invitrogen (EUA). ARNsi de controlo (precipitação A) e para GAL4 siRNA (10 uM) foi adquirido de Santa Cruz Biotecknology (EUA). Silencer pré-concebido siRNA contra Gal-4 (20 mM) e Ambion®
Silencer®
Negative Control # 1 siRNA (20 mM) foi adquirida da Ambion (EUA). reagentes de transfecção Lipofectamine RNAiMax e Opti-MEM foram obtidas de Invitrogen (EUA).
Células e condições de cultura
linhas celulares de cancro do pâncreas Pa-Tu-8988S (Patu-S) e Pa-Tu -8988T (Patu-T) foram adquiridos da DSMZ (Alemanha). Outras linhas de células pancreáticas foram uma gentil oferta do Prof. Dr. Richardson (Universidade de Leiden, Países Baixos) [32]. As linhas celulares AsPC1, BxPC3, MiaPaCa Panc01 e foram cultivadas em meio RPMI (Gibco, Invitrogen), com 10% de FCS (Lanza, Bélgica) e 1:100 Pen /Strep (Gibco, Invitrogen) a 37 ° C + 5% de CO
2. As linhas celulares Capan-I e Capan-II foram cultivadas com 15% de FCS. Patu-S, Patu-T e PaTu8902 foram cultivadas em meio DMEM rico em glicose (Gibco, Invitrogen), com 10% de FCS e 1:100 Pen /Strep a 37 ° C + 5% de CO
2.
de síntese de ADNc e quantitativa PCR em tempo real
o ARN total foi isolado a partir de todas as linhas celulares, utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) seguindo as orientações do fabricante. ARNm foi subsequentemente transcrito em ADNc utilizando o kit de transcrição reversa do sistema (Promega, EUA), como descrito anteriormente [33]. cDNA da linha normal humana pâncreas ducto epitelial-like células hTERT-HPNE [34] era uma simpática oferta do Dr. E. Giovannetti (Dept. of Medical Oncology, VUmc Cancer Center Amsterdam, Países Baixos). reacções (RT) de PCR em tempo real foram realizadas com o método de SYBR Green no sistema de detecção de sequência ABI 7900HT (Applied Biosystems, EUA) como descrito anteriormente [35]. Todos os oligonucleótidos foram projetados usando Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, EUA) software de computador, e sintetizados pela Invitrogen Life Technology (EUA). As reacções foram realizadas como se segue: 2 min a 50 ° C, seguido de 10 min a 95 ° C e 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. Os dados são expressos como a abundância de ARNm relativa obtida a partir dos valores do CT do alvo em relação ao gene de referência endógena
GAPDH
.
construção de células-T que expressam Patu Gal-4
para construir células Patu-T que expressam gene recombinante Gl-4, a galectina-4 (Hgal-4) foi clonado através da inserção de cDNA do gene Hgal-4 no vector pRRL-cPPT-CMV-X2-PRÉ-SIN- IRES-eGFP (a simpática oferta do Dr. A. Horrevoets, VU Medical Center, Amsterdã, Países Baixos). Toda a Hgal-4 quadro de leitura aberta (ORF) foi obtido através de amplificação por RT-PCR, introduzindo locais Nsil /EcoRI de restrição para inserção e uma sequência Cosac antes do ORF (Fwd: catatgcatcaccATGGCCTATGTCCCCGC; Rev: gaattcgatTTAGATCTGGACATAGGACAAGG). A inserção Hgal-4 foi clonada utilizando o local EcoRI do vector, colocando assim o gene Hgal-4 sob um promotor de CMV constitutivo activo. A construção de lenti-viral resultante foi propagado em
Escherichia coli
BL21 (DE3) e purificado por meio de kit de spin-coluna de isolamento de plasmídeo (Qiagen, Alemanha). produção Lenti-viral e infecção de células-T Patu com o construto virai, resultando na linha de células-T Patu /Gl-4, foi realizada como previamente descrito [36]. Uma linha celular de controlo (Patu-T /simulada) foi construído por introdução do vector vazio.
Gal-4 Knock Down (KD) em células Patu-S
interferência mediada por ARN foi utilizado para reduzir Gl-4 de expressão em células Patu-S. Para eficiência óptima de transfecção em células Patu-S, tanto Gal-4-alvo ARNsi (40 nM concentração final) a partir de Santa Cruz Biotechnology silenciador e pré-concebidas de siRNA (10 nM de concentração final) foram simultaneamente utilizadas para inibir a expressão de Gal-4 (PaTu- S /Gal-4-KD). Um controle negativo (corrida A juntamente com siRNA controle negativo 1 #) foi incluído nos experimentos (Patu-S /mock-KD). As transfecções foram realizadas de acordo com as directrizes da Invitrogen para transfecção inversa numa placa de 24 poços utilizando um ul de Lipofectamina RNAiMax e 100 de meio Opti-MEM ul. Para reduzir Gl-4 de expressão em células Patu-S, siARN foi introduzida duas vezes com intervalo de 4 dias e as células foram transplantadas para o embrião do peixe-zebra 24 h após a segunda transfecção. níveis Gal 4 de mRNA foram medidos em vários pontos de tempo durante esta experimentos usando RT-PCR quantitativo.
Western-Blotting
As células foram lisadas a 0 ° C em tampão TEA lise (Triton X- 100, de NaCl, MgCl, CaCl
2, TEA pH 8,2) contendo inibidores de protease. A concentração de proteína foi determinada por medições de A280 e determinação de BCA Protein Assay utilizando o Kit de Pierce (EUA). As proteínas dos lisados celulares (75 ug) e meio de cultura (25 ul) foram separadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 12,5% num sistema tampão descontínuo e as proteínas transferidas para membranas de nitrocelulose (Protran Whatman, Sigma). Após o bloqueio durante a noite em tampão de bloqueio LiCor 1:01 em PBST /1% BSA (PBS com Tween 20, 1% de BSA a 0,05%), as manchas foram incubadas durante 60 min à temperatura ambiente com anticorpo de cabra anti-Hgal-4 (0,1 ug /ml ). De murganho anti-tubulina (1:2000 diluição) foi utilizado como controlo de carga (lisados celulares) e de detecção de fragmentos de células (meio de cultura). Secundária AB IRDye 680 anti-cabra e IRDye 800CW anti-IgG de coelho foram usados a 1:15000 diluições (0,07 ug /ml), em PBST /1% BSA durante 1 hora à temperatura ambiente (TA) no escuro. -análise de Western blotting foi realizado utilizando LI-COR scanner de sistemas de software e Odyssey.
Ensaio de Proliferação Celular
As células foram semeadas numa placa de 96 poços a cerca de 1 × 10
4 e 1 × 10
5 células por poço e incubadas durante a noite para a adesão de células à placa. [
3H] timidina (1 uCi /cavidade; Amersham Biosciences, EUA) foi adicionada e as células incubadas durante mais 24 h a 37 ° C + 5% de CO
2. As células foram colhidas e [
3H] timidina foi avaliada utilizando um cintilação líquida MicroBeta
2 placa de contra-2450 (Perkin Elmer, EUA).
Imunofluorescência Microscopia
Patu-S , Patu-T /simulada e Patu-t /Gl-4 de células crescidas em lamelas de vidro durante 24 h foram lavadas 3 vezes com PBS, fixadas durante 30 minutos em 4% de paraf ormaldeido e permeabilizadas em 0,1% de Triton- X-100 /PBS durante 5 min. A ligação não específica foi bloqueada por têmpera 10 min com PBS /glicina (0,15 M), seguido por 30 min com PBS /gelatina 0,2% /BSA 0,5% (PBSG). As células foram incubadas com anticorpo policlonal de cabra anti-Hgal-4 em PBSG (diluição de 0,2 ng /ml) durante 1 h e, subsequentemente, lavadas com PBS. A detecção foi realizada após 1 h de incubação à temperatura ambiente com 5 ug /ml de o Abs secundário (anti-cabra Alexa Fluor 488 ou anti-cabra Alexa Fluor 647). Os núcleos foram corados com Hoechst (1 ug /ml em PBS) durante o passo de incubação com Ab secundário. Actina foi detectado por coloração com faloidina (1:5000 em PBS, 15 min). Depois de um passo final de lavagem em PBS e incorporação utilizando Mowiol (Kuraray Poval, Alemanha), várias células de cada condição foram visualizados usando um microscópio Leica M6000 B com a lente objetiva HCX PL APO 40,0 × 0,85 DRY. Fotos foram tiradas com uma câmera DFC350FXR2-095903305 e analisados utilizando software LASAF (Leica Microsystems, Alemanha).
Citometria de Fluxo
Para a detecção de Gal-4 endógena, as células foram fixadas pela primeira vez em 4% paraformaldeído durante 30 min à temperatura ambiente, seguido de permeabilização celular em PBA /0,5% de saponina durante 15 min a 4 ° C. Para detectar a ligação de Gl-4 recombinante humana (REC Hgal-4) à superfície da célula, os procedimentos foram realizados de acordo com Patnaik,
et al [37]. Em resumo, as células foram recolhidas, centrifugadas e ressuspensas em solução salina equilibrada fria de Hank (HBSS, Sigma, EUA) com lactose 500 mM. As células foram subsequentemente recolhidas e incubadas em HBSS frio com 2% de BSA durante 1 hora a 4 ° C com agitação suave. Após isto, as células foram lavadas uma vez com HBSS /BSA com mM β-mercaptoetanol 2 (Gibco, Invitrogen), e subsequentemente incubou-se durante uma hora a 4 ° C em HBSS /BSA /mm β-mercaptoetanol 1, na ausência ou presença de rec Hgal-4 (5 ug /ml) para detectar endógena ligada à superfície de Gal-4 ou rec ligado à superfície Hgal-4, respectivamente. Para avaliar se Gl-4 de ligação é dependente de hidratos de carbono, os ensaios de ligação foram realizados na presença de 500 mM de lactose. Para tanto a superfície e análise citosólica, as células foram coradas com anticorpo anti-Gal-4 Ab (2 ug /ml) em PBS com 0,5% de BSA e 0,02% de azida (PBA) contendo 10% de FCS (Sigma, EUA), durante 30 min a 4 ° C. Para a coloração secundário, Alexa488 ou Alexa647 marcado Abs foram usadas (5 ug /ml e incubação durante 30 min a 4 ° C). indicador de células mortas TO-PRO®-3 Iodeto (1 nM) foi adicionado apenas previamente a fluir medições cytrometry. A citometria de fluxo foi realizada utilizando um FACScan ou um citómetro de fluxo FACSCalibur e o software cimeira. As células mortas definidas como alta TO-PRO®-3 coloração foram excluídos da análise.
In vitro
Migration Assay ( “zero” -assay)
O zero-ensaio foi realizada como anteriormente descrito por Liang et ai. [38]. As células foram cultivadas até à confluência numa placa de 24 poços. A monocamada de células foi raspado em uma linha reta com uma ponta de pipeta de 200 mL (Sarstedt, Alemanha). Fotografias do zero foram levados sob um invertido Leica DMI microscópio em 0 h, 12 h, 24 h e 48 h para as células simuladas Patu-T /Gal-4 e Patu-T /. Fotografias em cada ponto de tempo foram tiradas com a câmera Leica DFC420. largura do intervalo h a 0 foi definido como 100%. análise de largura Gap foi realizada com PhotoshopCS4 usando a ferramenta régua analítica. As medidas foram tomadas em vários definido locais ( 5) ao longo do zero. Cada zero foi dada uma média de todas as medições. Os dados são expressos como a média ± SEM de três experiências independentes
In vivo
Metástase Ensaio
Roy
– /-;. Nácar
– /- Casper Danio rerio
(zebrafish) foram tratadas em conformidade com os regulamentos de cuidados de animais locais e protocolos padrão da Holanda. Os peixes foram mantidos a 28 ° C em aquários com ciclos de luz de dia /noite (10 horas de escuro contra 14 períodos de horas de luz). Os embriões em desenvolvimento foram mantidas em água do ovo (60 ug /ml de Instant Ocean ver sais) a 28 ° C antes do transplante e a 35 ° C após o transplante.
transplante de células do cancro foi realizada de acordo com Marques
et al
[39]. Basicamente, as células foram cultivadas até à confluência, tripsinizadas (Gibco, Invitrogen) e centrifugou-se 5 min, a 1500 rpm. As células foram então coradas em PBS contendo CM-Dil, a uma concentração final de 4 ng /mL, durante 4 min a 37 ° C e 15 min a 4 ° C. Subsequentemente, as células foram colhidas e os sedimentos celulares ressuspensos em 100% de FCS, durante 5 min a recuperação e lavadas duas vezes com PBS. Finalmente, as células foram re-suspensas em PBS para transplante em embriões de peixe-zebra de 2 dias após a fertilização (dpf). Os embriões foram dechorionated e anestesiados com tricaina (MS-222, Sigma-Aldrich, EUA). Utilizando um injector manual (Eppendorf, Alemanha; InjectMan NI2), a suspensão celular foi carregada num capilar de injecção (15 uM e 18 uM interiorização externo de diâmetro). Em seguida, cerca de 100 células fluorescentes vermelhas foram injectados no saco vitelino de embriões dechorionated. Após a injecção, os embriões foram deixados a recuperar da transplantação durante 1 h à TA. Após este período (2 h após o transplante (HPT)), os embriões foram examinados quanto à presença de células fluorescentes. Os embriões que contêm células fluorescentes fora da área do transplante em 2 HPT foram considerados gotejante e excluídos de análises posteriores. O número de embriões vivos, nesta fase, foi definido como 100% para cada condição de forma independente. Todos os outros embriões foram incubados a 35 ° C para os 3 dias seguintes.
Imaging, Seleção e Posicionamento de Transplanted embriões Zebrafish
Em 1, 2 e 3 dias após o transplante (DPT), o embriões foram anestesiados com tricaina e posicionados lateralmente em 3% de metilcelulose. Os embriões foram examinados sob uma fluorescência DSR Leica MZ16FA microscópio estéreo. células cancerosas fluorescentes fora da área de implante foram contados em cada embrião. Os embriões que apresentaram mais de 5 células cancerosas no exterior da gema foram consideradas como sendo positivas para a metástase e foram retiradas separada do resto dos embriões transplantados. Percentagem de metástases foi definido como o número de embriões que contenham mais de 5 células fora da gema por dia em relação ao dia zero. percentagem total metástase é definido como o número total de embriões com metástases após 3 dias em relação ao dia zero.
Estatísticas
Os dados são apresentados como média ± SEM. A análise estatística aplicada aos dados quantitativos de RT-PCR foi de ANOVA one-way utilizando testes-t de Dunnett. Para todos os outros dados, análise estatística utilizada foi one-way Tukey teste t de ANOVA.
In vivo
ensaios de metástase foram analisados estatisticamente usando t-testes de amostra emparelhados. Os dados foram considerados significativos se
p
≤0.05.
Resultados
mRNA expressão de Gal-4 em linhas de células de pâncreas Adenocarcinoma
Para investigar expressão diferencial de Gl-4, os níveis de ARNm foram determinados em nove linhas pancreáticos humanos diferentes de células de cancro utilizando Tempo real (RT) por PCR (Figura 1). Como um controlo para a expressão em tecidos normais do ducto pancreático, Gl-4 níveis de ARNm foram determinados de uma linha celular imortalizada derivada de ducto pancreático epitelial humana normal (hTERT-HPNE). Os resultados demonstraram que a Gal-4 níveis de ARNm na linha de células do ducto pancreático normal não eram detectáveis. Os níveis de ARNm de Gal-4 mostrou uma baixa abundância relativa em oito dos nove linhas celulares de cancro, utilizando
GAPDH como gene de referência agregado familiar. Uma linha celular, Pa-Tu-8988S (Patu-S), no entanto, mostrou uma expressão elevada de mais de 10 vezes em comparação com as outras linhas celulares.
Gl-4 de expressão do mRNA epithelial- ducto pancreático humano normal como linha celular (hTERT-HPNE) e 9 linhas humanos diferentes de células de cancro pancreático foi analisada por quantitativa PCR em tempo real e descrita como a quantidade relativa de Gal-4 transcritos (± SEM) em comparação com a expressão do gene de referência endógena
GAPDH
. (*** P≤0.001 contra todas as outras linhas celulares, usando uma maneira ANOVA com pós Dunnett dois testes t lados).
Curiosamente, Patu-S originada da mesma metástase hepática de um primário humano adenocarcinoma do pâncreas como um dos Gal-4 linhas de células que expressam baixos, Pa-Tu-8988T (Patu-T) [40]. Estas duas linhas celulares são descritos para conter capacidades migratórias e metastáticos opostas. Patu-S e Patu-T exibir uma muito baixa e uma alta capacidade metastática, respectivamente, ambos
in vitro
e
in vivo
usando zebrafish como um sistema modelo [39]. Além disso, demonstrou-se anteriormente que a maioria das linhas de células descritas na Figura 1 possui um aumento
In vitro
capacidade de migração, em comparação com Patu-S [32], [41]. Estes dados nos levou a considerar a possibilidade de que a expressão de Gal-4 pode restringir a capacidade migratória e /ou metastático destas células de câncer pancreático. Devido à sua origem comum, a linha celular de baixo migratória Patu-S e a linha de células-T Patu metastático representam um sistema modelo muito atraente para estudar o papel putativo da Gal-4 em metástase.
Localização de Gal- 4 em células Patu-S e Patu-T
A expressão e localização da proteína Gal-4 em células Patu-S e Patu-T foi determinada por citometria de fluxo, imunocitoquímica (ICC) e western blot (WB) (Figuras 2-4). Para determinar endógena Gl-4 de células-T Patu Patu-S e as células foram fixadas e permeabilizadas, seguido por citometria de fluxo utilizando anticorpo anti-Gal 4-anticorpos (ABS), e Abs secundário fluorescente. Os resultados mostram uma clara diferença na ligação Gal-4 Ab entre Patu-S e Patu-T. células Patu-S mostram uma forte coloração pelo anti-Gal-4 Abs, enquanto Gl-4 de coloração em células Patu-T é dificilmente detectável (Figura 2A). Para avaliar a presença de ligandos de glicano na célula-superfície exterior que poderiam ser reconhecidos por Gal-4, as células foram primeiro rigorosamente lavadas com 500 mM de lactose para remover galectinas ligado à superfície endógena. Subsequentemente, rec exógeno. Hgal-4 proteína (5 ug /ml) foi adicionado às células e Gal-4 de ligação foi determinada por citometria de fluxo utilizando anticorpo anti-Gal-4 Abs. Os resultados mostram que ainda se observou um nível significativo de Gal-4 coloração na superfície de células Patu-S, mas não de células Patu-T, após a lavagem com lactose (Figura 2B), indicando a presença de liga fortemente Gal-4 endógena sobre a superfície de células Patu-S. Após a adição de 4-Hgal REC para as células, a superfície celular Gl-4 de coloração fortemente aumentada, indicando que as células Patu-S pode ligar-se elevados níveis de Gl-4 para a sua superfície. Em contraste, os níveis muito baixos de Hgal-4 rec ligado à superfície celular de células-T Patu. Para investigar se o rec Hgal-4 liga-se a células de uma forma dependente de hidratos de carbono, as células-T e Patu Patu-S foram incubadas com Hgal-4 REC na presença de lactose. Na presença de 500 mM de lactose a ligação de Hgal-4 para ambas as linhas celulares foi inibida, o que indica que o Gl-4 de ligação à superfície da célula é glicano-dependente. Colectivamente, estes resultados demonstram que altos níveis de Gl-4 estão presentes em células Patu-S, enquanto que Gl-4 é dificilmente detectável em células Patu-T. Além disso, as células Patu-S pode ligar-se níveis muito mais elevados de Gal-4 para a sua superfície exterior do que as células-T Patu, indicando que eles expressam mais ligandos de hidratos de carbono Gal-4-ligação.
Detecção de Gal- endógena 4, e Gal-4 ligantes, em células Patu-T Patu-S e por citometria de fluxo. Um histograma de uma experiência representativa é mostrada para cada condição de duas experiências independentes menos. A) Os gráficos de pontos de Gal-4 coloração das células permeabilizadas Patu-S e Patu-T. Gal-4 foi detectada a 4 ° C com anti-Hgal-4 Abs em células permeabilizadas fixadas. coloração Abs secundário sem anti-Hgal-4 Abs foi utilizado como controle fundo autofluorescência. B) A presença do Gal-4 endógena ligada à superfície de Patu-S e Patu-T após a lavagem das células com 500 mM de lactose antes da Gal-4 coloração. A presença do Gal-4 foi estabelecida por análise de FACS utilizando anticorpos anti-Hgal-4 Abs a 4 ° C. Endógena Gal-4 ligada à superfície é mostrada por uma linha preta. C) A presença de sítios de ligação de Gal-4 em células T-Patu Patu-S e foi determinada após a lavagem das células com 500 mM de lactose antes da Gal-4 coloração. A ligação do recombinante adicionado externamente (REC) Hgal-4 (5 ng /mL, linha preta) foi investigada. A ligação de Hgal-4 REC para a superfície poderia ser inibida pela adição de lactose (de campo escuro). coloração de fundo com Abs secundário é descrito como campos cinza claro em B e C.
fotografias de análise ICC representante da localização celular da Gal-4 em células Patu-S. foi detectado Gal-4 usando Alexa marcado com anti-Gal-4 Abs (verde), actina foi corado utilizando faloidina (vermelho) e coloração núcleo obtidos utilizando HOESCHS (azul); o terceiro painel mostra a fusão das diferentes colorações. Bar = 25 um.
A) Proteínas de extratos de células inteiras (75 ug de proteína total) e meio de cultura (4 dias de cultura, 25 ul) de Patu-S (PS), Patu-T (PT), Patu-t /Gl-4 (PT /Gal-4) e Patu-T /simulada (PT /M) foram separadas por SDS-PAGE. Após a transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose, as membranas foram coradas utilizando anticorpo de cabra anti-Hgal-4 para a detecção de Gal-4, e de murganho anti-tubulina como controlo para a presença da proteína intracelular. B) fotografias de análise ICC representante da localização celular da Gal-4 em Patu-T /Gal-4 e Patu-T /células simulados. foi detectado Gal-4 usando Alexa marcado com anti-Gal-4 Abs (verde), actina foi corado utilizando faloidina (vermelho) e coloração núcleo obtidos utilizando HOESCHS (azul); o terceiro painel mostra a fusão das diferentes colorações. Bar = 25 um.
A localização celular da Gal-4 foi ainda estudada usando ICC. Os resultados mostram uma alta intensidade de fluorescência ao longo do citoplasma das células Patu-S (Figura 3), indicando que a maior parte Gal-4 está localizada no citosol. Alta fluorescência foi observada na membrana citoplasmática em células individuais e entre as células, em particular nos locais de contacto entre as células adjacentes (contactos célula-célula), enquanto quase nenhuma fluorescência foi detectada no núcleo. Gal-4 não é homogeneamente distribuída no citoplasma, mostrando algumas áreas com níveis de fluorescência mais elevados do que outros, embora não existam indicações claras de organelos específicos envolvidos na acumulação de Gal-4. Em células Patu-T, sem Gal-4 pode ser detectado utilizando este método, que estabelece a citometria de fluxo de dados que indica que os níveis de Gl-4 em células T-Patu são muito baixos.
A sobre-expressão de Gal-4 em Patu as células -T
Para avaliar um putativo envolvimento de Gal-4 em migração, Gl-4 foi sobre-expresso em células-T Patu por introdução de um vector virai contendo o gene Hgal-4 conduzido por um promotor de CMV (Patu -T /Gal-4). Como um controlo, o vector viral, sem inserção foi transduzida para Patu-T (T-Patu /simulada). a expressão da proteína e localização de Gal-4 em células não tratadas Patu-T e Patu-S, Patu-T /Gal-4 e Patu-T /simulada foi analisado por western blot (WB), ICC e citometria de fluxo.
Para determinar o nível de Gal-4 expressão nas linhas celulares, as células e o meio foram colhidos após 4 dias de cultura. Proteínas presentes no extractos de células e do meio foram separados por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Após a coloração as manchas utilizando anticorpo de cabra anti-Gal-4 Abs, bandas a 36 kDa correspondentes à massa aparente de Gal-4 foram observados em Patu-t /Gl-4 extracto de células e meio, em quantidades semelhantes tal como observado no Patu-S extracto de células e meio, respectivamente (Figura 4A). Como esperado, Patu-T /simulada não apresentaram bandas detectáveis a 36 kDa. Estes resultados indicam que a Gal-4 é expressa em Patu-t /Gl-4 em níveis semelhantes em comparação com células Patu-S. Além disso, quantidades semelhantes de Gal-4 são secretadas por células Gl-4-S e Patu Patu-T /.
Usando ICC, nós demonstramos que a distribuição intracelular de Gal-4 dentro do PaTuT /Gal-4 células é semelhante à distribuição em células Patu-S, ao passo que nenhum Gal-4 foi detectada em PaTuT /células simuladas (Figura 4B). A distribuição de Gal-4 nessas células no citosol é semelhante à distribuição em células Patu-S. Gal-4 está presente ao longo de toda a célula, excepto para o núcleo, semelhante ao observado para Patu-S. No entanto, ao passo que Gl-4 está presente na membrana plasmática de células Patu-S, dificilmente qualquer Gal-4 é detectada na membrana de células permeabilizadas Patu-t /Gl-4. Em conclusão, estes resultados indicam que Patu-T /Gal-4 expressa e segrega Gal-4 em quantidades semelhantes às células Patu-S.
Além disso, determinou-se endógena, e /ou adicionado Gal- recombinante 4-se ligada à superfície celular de Patu-t /Gl-4 por citometria de fluxo utilizando anticorpo anti-Gal-4 Abs. A ligação do anti-Gal-4 abs para a superfície da célula não diferiram entre Patu-t /Gl-4 e Patu-T /Mock (dados não mostrados). Assim, a capacidade de /Gal-4 células Patu-T para ligar Gal-4 extracelularmente é inalterado em comparação com a linha de células-T Patu não tratada.
A superexpressão de Gal-4 diminui a capacidade de migração de Patu-T células
Para examinar se a Gal-4 influências do comportamento migratório das células Patu-T, um ensaio de zero foi realizada utilizando Patu-T e Patu-T /Gal-4 células (Figura 5A-B).
Um arranhão ensaio (cicatrização de feridas) foi realizada com Patu-T, Patu-T /Gal-4 e Patu-T /células simulados. Patu-T /simulada e células-T Patu /Gal-4 foram semeadas numa placa de 24 poços e riscado na superfície com uma ponta de pipeta de 200 uL. Os valores relativos foram fixadas em 100% da largura da abertura no momento da zero.