Abstract

Independentemente das remissões exequíveis com terapia hormonal primeira linha em pacientes com câncer de próstata (PAC), a doença escapa do estágio dependente de hormonas para um estado mais agressivo em que a quimioterapia é o único tratamento eficaz e nenhum tratamento é curativo. Isto faz com que seja muito importante para identificar novos alvos que podem melhorar o resultado do tratamento. ATM e DNA-PK são as duas cinases responsáveis ​​pela sinalização e reparação de rupturas dos filamentos duplos (DSB). Assim, ambas as cinases são alvos relevantes no tratamento da tampa para melhorar a actividade da ADN DSB numerosos agentes utilizados no tratamento da PAC, como radiação (IR) ionizante indução. ensaio de formação de colónias foi utilizado para avaliar a sensibilidade de hormona dependente, p53 wt (LNCaP) e a hormona mutante p53 independente (PC3) linhas celulares de tampa para o efeito citotóxico de IR e doxorrubicina na presença ou ausência de Ku55933 e NU7441 que são pequena molécula inibidores da ATM e ADN-PK, respectivamente. Fluxo de métodos baseados em citometria foram utilizados para avaliar o efeito dos dois inibidores de ciclo celular, apoptose e a formação de focos H2AX. comet assay neutro foi utilizada para avaliar a indução de DSB de ADN. Ku55933 ou NU7441 sozinho aumentou a sensibilidade de linhas celulares tampão aos agentes que danificam o DNA, no entanto, combinando ambos inibidores juntos resultaram em reforçar ainda mais a sensibilidade. O perfil de ciclo celular de ambas as linhas celulares foi alterada, com aumento da morte celular, DSB de ADN e a formação de focos H2AX. Este estudo justifica uma avaliação mais aprofundada dos inibidores de ATM e DNA-PK para aplicação clínica em pacientes com PAC. Além disso, o efeito aumentada resultante da combinação de ambos os inibidores podem ter uma implicação significativa para o tratamento de pacientes com PAC que possuem um defeito em uma das duas vias de reparação de DSB

citação:. Shaheen FS, Znojek P, Uma Fisher , Webster H, R Plummer, Gaughan L, et ai. (2011) Segmentação do Machinery Ruptura Reparo do DNA dupla vertente no câncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e20311. doi: 10.1371 /journal.pone.0020311

editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 18 Janeiro, 2011; Aceite: 28 de abril de 2011; Publicado em: 23 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Shaheen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Aga Khan, www.akdn.org/AKF, CRUK, CancerResearchUK.org, MRC, www.mrc.ac.uk e AICR, www.aicr.org.uk. . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: um dos autores, Graeme C. M. Smith, é empregado por uma empresa comercial, Kudos Pharmaceuticals Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, Reino Unido. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais.

Introdução

De acordo com os U.S National Institutes of Health, a taxa de incidência ajustadas por idade de câncer de próstata 2003-2007 foi 156,9 por 100.000 homens por ano. Embora altas taxas de resposta pode ser conseguida por terapia de primeira linha com cirurgia, radioterapia, anti-androgénio ou as suas combinações; o progresso natural da doença é para o estado refractário a hormonas [1], em que a quimioterapia é o tratamento mais eficaz, mas ainda não curativa [2]. Esta resistência destaca a importância da identificação de novos alvos que podem aumentar a sensibilidade das células PAC e, portanto, as taxas de resposta e sobrevida global dos pacientes. Ataxia Telangiectasia mutada (ATM), e a subunidade catalítica da proteína quinase dependente de ADN (DNA-PKcs) são membros das cinases de fosfatidilinositol 3-quinase relacionada (pikk) superfamília. Os membros desta família são caracterizados pelo seu peso molecular e sequência de elevada similaridade com a subunidade p110 lípido quinase PI3-quinase [3]. Em células de mamíferos, ATM e DNA-PK desempenham papéis fundamentais na resposta DNA dupla interrupção fio (DSB), através de recombinação homóloga (HR) e no final não homóloga juntar (NHEJ), respectivamente [4], [5]. fosforilação rápida de ambos ATM e ADN-PK ocorre em resposta à DSB seguinte insultos endógenas ou exógenas. Uma vez activado, o ATM e o sinal de ADN-PK a uma ampla gama de alvos a jusante que estão envolvidos no processo de reparação, regulação do ciclo celular e apoptose [6]. A escolha de qual reparos da via do DSB é dependente do ciclo celular fase, com NHEJ sendo a via dominante na G0 e G1 e HR domina em S e G2 /M fases [7]. ATM e ADN-PK são clivados por caspase 3, uma vez a decisão de activar a apoptose é feita na célula e este evento de clivagem é pensado para facilitar a apoptose, desactivando a maquinaria de sinalização e reparação do ADN [8], [9]. inibidor PI3K tradicional, vortmanina geralmente com baixa seletividade contra diferentes classes e /ou isoformas de Pikk tem sido amplamente utilizada para estudar ATM e vias de sinalização DNA-PK [10]. Ku55933 foi identificado como um inibidor competitivo do ATP potente e específico da ATM (IC

50 13 nmol /L) no que diz respeito à inibição de outros membros da família pikk. Ku55933 aumentou a sensibilidade das células de cancro da mama de IR, alterou o perfil do ciclo celular e inibiu a fosforilação de um painel de alvos ATM. As células A-T não apresentaram estes efeitos, quando tratados com Ku55933 [11]. NU7441 foi identificado como um inibidor competitivo do ATP potente e específica de ADN-PK (IC

50 14 nmol /L) com selectividade de 100 vezes para o DNA-PK em relação a outros membros da família PI3KK. NU7441 aumentou a sensibilidade das células cancerígenas do cólon para IR e inibidores da topoisomerase II, e alterou o seu perfil do ciclo celular. DNA-PK células V3 deficiente não apresentaram estes efeitos quando tratados com NU7441 [12]. Este estudo foi concebido como uma avaliação pré-clínica de ambos os inibidores da ATM e DNA-PK para investigar se esses inibidores podem melhorar a eficácia de agentes indutores de DSB de ADN para o tratamento da PAC.

Materiais e Métodos

Chemicals

Todos os produtos químicos de rotina foram a compra de Sigma, salvo indicação contrária. NU7441 foi sintetizado no Instituto Norte para Pesquisa do Câncer da Universidade de Newcastle (Newcastle upon Tyne, Reino Unido), em colaboração com Kudos Pharmaceuticals (Cambridge, UK). KU-55933 foi um presente amável da Kudos Pharmaceuticals. Ambos os inibidores foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de caldo de 2000 x a concentração final desejada para o experimento. A doxorrubicina foi dissolvido em água a uma concentração de estoque de 1000 x a concentração final desejada para o experimento. Todos os compostos foram armazenados em alíquotas a -20 ° C.

cultura celular

insensíveis nulos (p53) linhas celulares de LNCaP sensíveis CaP hormonais (p53 do tipo selvagem) e de hormonas PC3 foram adquiridas a partir da ATCC e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% (v /v) de FCS. Ambas as linhas celulares foram rotineiramente para Mycoplasma.

Colony ensaio de formação de

As células foram semeadas em placas de 6 poços em diferentes densidades. Depois de se deixar anexar, as células foram incubadas com Ku55933 (10 uM), isoladamente ou em combinação com NU7441 (1 uM) durante 1 h antes de irradiação quer (0-2 Gy), ou tratamento com doxorrubicina (0-75 nM). 24 h mais tarde, os poços foram lavados suavemente duas vezes com PBS quente antes de se adicionar meio fresco e voltou para a incubadora durante 7-10 dias para as células PC3 e 12-14 dias para células LNCaP para formar colónias. As colónias foram fixadas com fixador de Carnoy, secas, coradas com 0,4% de violeta de cristal e contadas manualmente. O factor de redução de sobrevivência foi calculada como a fracção sobrevivente de células na ausência de inibidores, dividida pela fracção sobrevivente de células na presença de inibidores para qualquer dada dose ou concentração do agente citotóxico.

método de fluxo baseado citometria para ciclo celular

As células foram semeadas em placas de 6 cavidades. 24 h mais tarde, as células foram tratadas com 1 uM NU7441 e /ou 10 fiM Ku55933 antes do tratamento de IV ou doxorrubicina. 48 h mais tarde, as células foram recolhidas em tubos de FACS (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido), mantendo o meio de crescimento antes de serem coradas com iodeto de propídio (PI). As amostras foram analisadas directamente num FACScan (Becton Dickinson)., Intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias foi representada graficamente em histogramas, e as fases do ciclo celular foram determinados utilizando WinMDI versão 2.8 (O Instituto de Pesquisa Scrrips, EUA)

Fluxo método baseado citometria para a caspase activa 3

as células foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com os inibidores e /ou agente de danificação do ADN tal como anteriormente descrito e recolhidas em tubos de FACS, mantendo o meio de crescimento. As células foram coradas com anticorpo conjugado com FITC activo da caspase 3, de acordo com as instruções do fabricante (Becton Dickinson, Oxford, UK) e analisadas directamente num FACScan. A intensidade da fluorescência em unidades arbitrárias foi plotada em gráficos de pontos, ea intensidade de fluorescência média foi calculada utilizando WinMDI version2.8.

Fluxo método baseado citometria de γ-H2AX formação de focos

As células foram semeadas em placas de 6 cavidades, tratadas com os inibidores e /ou agente de danificação do ADN tal como anteriormente descrito e recolhidas em tubos de FACS. As células foram coradas utilizando o anticorpo γH2AX conjugado com FITC, como descrito anteriormente [13]. As amostras foram analisadas num FACScan directamente. A intensidade da fluorescência em unidades arbitrárias foi plotada em histogramas, ea intensidade de fluorescência média foi calculada utilizando WinMDI version2.8.

foram preparados ocidentais blotting

Os extractos celulares totais 6 h após 1? M doxorrubicina e 1 h após 10 Gy de IV na presença e ausência de inibidores. Quantidades equivalentes de lisado celular foram carregadas 4,5, 6, 12 e 15% de gel juntamente com um marcador de proteína pré-SeeBlue® padrão manchado (Invitrogen, EUA). Os géis foram submetidos a electroforese e proteínas foram transferidas para membrana Hybond-C. ECL-sistema (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) foi utilizada para detectar proteínas conjugadas com anticorpo de acordo com as instruções do fabricante e visualizados por exposição a filme de raios X (Kodak, Herts, Reino Unido). Anti-DNA-PK, ATM anti, anti ADN-PK

Ser2056 e anti ADN-PK

Thr2906 foram adquiridos a partir de (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Anti ATM

Ser1981, anti H2AX

Ser139 e anti p53

Ser15 foram adquiridos a partir de (Gene Tex, EUA), (Upstate, Reino Unido) e (sinalização celular, Reino Unido), respectivamente.

neutro cometa ensaio

PC3 foram submetidos ao teste do cometa neutro de acordo com as instruções do fabricante (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD, EUA). Duas modificações principais foram aplicados, as células foram lisadas durante 1 h e submetidas a electroforese durante 30 minutos a 30 V. cometas foram visualizados por fluorescência Leica DMR microscópio e analisados ​​utilizando Komet 5,5 (imagiologia cinética Ltd, Nottingham, Reino Unido).

A análise estatística

A análise estatística foi aplicado utilizando version4 software Prism (GraphPad Prism, San Diego, EUA).

resultados

Ku55933 e NU7441 inibir a ATM e DNA-PK quinase atividade, respectivamente em células CaP IR e doxorrubicina tratada

ATM-dependente ATM

Ser1981, foram induzidos p53

Ser15, H2AX

Ser139 e DNA-PK

Thr2609 fosforilação 1 h após 10 Gy e 6 h após 1 pM doxorrubicina e foram inibidas por Ku55933. IR induzida por ADN-PK

Ser2056 fosforilação (reportado como local autofosforilação de ADN-PK) foi inibida por NU7441 (como esperado) e surpreendentemente doxorrubicina induzida por ADN-PK

Ser2056 fosforilação foi também inibida por Ku55933. NU7441 não inibiu ATM

Ser1981, p53

Ser15, H2AX

Ser139 e a DNA-PK

Thr2609 fosforilação (Figura 1).

Os extractos celulares totais foram preparados LNCaP 1 h depois 10 Gy e 6 h depois de 1 uM doxorrubicina ± NU7441 10 uM ou 1 uM Ku55933. Os extractos foram analisados ​​por transferência de Western e sondados com os anticorpos indicados. Dados é uma representativos de três experiências independentes.

Ku55933 e NU7441 são citotóxicos minimamente às células CaP

A fim de determinar a citotoxicidade intrínseca de Ku55933 e NU7441 em relação à quimio e radiossensibilização , as células foram expostas a concentrações crescentes de Ku55933 ou NU7441 com a concentração citotóxica mínima de IV (1 Gy) ou doxorrubicina (10 nM). Ambos Ku55933 (10 uM) e NU7441 (1 | iM) causou pouca ou nenhuma citotoxicidade em células LNCaP (figura 2A B) e PC3 (Figura 2C D). Cada inibidor aumentou significativamente IR e citotoxicidade doxorrubicina em ambas as linhas celulares PAC em uma maneira dependente da dose do inibidor. Estas duas concentrações (10 uM Ku55933 ou 1 uM NU7441) foram utilizados em experiências subsequentes

LNCaP (A B). Ou PC3 (C D) As células foram semeadas em placas de diferentes densidades e deixado a fixar antes de 1 h a incubação com concentrações variáveis ​​de Ku55933 ou NU7441 antes da irradiação 1 Gy ou 10 nM tratamento com doxorrubicina durante 24 h (

P

0,001). LNCaP (E F) ou PC3 (G H), as células foram semeadas em placas de diferentes densidades e deixado a fixar antes de 1 h de incubação com Ku55933 (10 uM) ou NU7441 (1 uM) antes do tratamento com doses variáveis ​​de IV ou concentração de doxorrubicina para 24 h (

P Art 0,001). Todos os resultados são a média de três experimentos independentes ± SEM.

Ku55933 e NU7441 reduzida linhas de células CaP sobrevivência celular em resposta a IR ou doxorrubicina

Tendo demonstrado a quimioterapia dependente da concentração e radiossensibilização em ambas as linhas de células, que, em seguida, investigou a resposta a uma concentração fixa de cada inibidor com o aumento das concentrações de doxorrubicina ou de dose IV. Houve uma diminuição dependente da dose, da sobrevivência das células em resposta a RI. células PC3 exibido resistência ao IR em comparação com LNCaP, combinando NU7441 ou Ku55933 com IR reduziu significativamente a sobrevivência de células de LNCaP (Figura 2E) e substancialmente para o PC3 (Figura 2G). Da mesma forma, a doxorrubicina reduziu a sobrevivência das células em ambas as linhas celulares, mais quimio-sensibilização resultou da combinação NU7441 ou Ku55933 em LNCaP (Figura 2F) e PC3 (Figura 2H). Combinando ambos inibidores significativamente aumentada a quimio-radiossensibilização e NU7441 combinação foi mais eficaz na indução chemosensitisation em LNCaP enquanto combinação Ku55933 teve mais efeito na indução radiossensibilização no PC3 sugerindo um papel avançada para ATM no modelo hormônio refratário.

Ku55933 e NU7441 ciclo e celular alterada aumentaram a sua apoptose em resposta a danos no DNA em linhas celulares de CaP

a seguir, determinar se o aumento da sensibilidade de linhas celulares PAC é acompanhado por aumento da apoptose ou alterações no perfil de ciclo celular. IR causada mínimo /nenhum aumento em LNCaP (Figura 3A) em comparação com um aumento dependente da dose na acumulação G2 no PC3 (figura 3B). Além disso, a combinação de ambos os inibidores teve um efeito aditivo sobre a acumulação G2, em dose baixa (2 Gy), mas não na dose mais elevada (10 Gy). Doxorrubicina tratamento causou a acumular células em G2 /M, especialmente em doses elevadas. Em geral, a combinação quer um inibidor com baixa dose de doxorubicina (20 nM) aumentou G2 /M acumulação embora NU7441 teve apenas um efeito modesto nas células LNCaP (Figura 3C). Considerando que a combinação de inibidor único a doxorrubicina dose elevada (200 nM) resultou em um aumento marcante em subG1 em LNCaP (Figura 3C) em comparação com um aumento interessante em G1 em células PC3 (Figura 3D). Um efeito aditivo foi observada quando se combinam ambos os inibidores

LNCaP (A C). E PC3 (B D), as células foram incubadas com Ku55933 (10? M) e /ou NU7441 (1 uM) antes de ser exposto a as doses indicadas de IR ou de doxorrubicina durante 48 h e, em seguida, coradas com PI e analisados ​​directamente no FACscan. Dados é um representante três experimentos independentes. células LNCaP (E) e PC3 (F) foram tratados como descrito acima e coradas com anticorpo conjugado com FITC anti caspase 3 antes da análise directa no FACScan. Os resultados são a média de três experiências independentes ± DP.

IR induziu morte celular dependente da dose em ambas as linhas celulares. LNCaP apoptose foi reforçada quando se combina Ku55933 e /ou NU7441 (Figura 3E). No entanto, a morte celular PC3 (Figura 3F) foi aumentada em resposta às combinações de inibidor a dose baixa única. O aumento da apoptose causada pela combinação de ambos os inibidores é consistente com os dados de sobrevivência mostrando radio-sensibilização foi mais pronunciada para ambas as linhas de células tratadas com ambos os inibidores em conjunto. Além disso, Ku55933 induzida uma maior morte celular em células PC3 em comparação com NU7441 que foi observado um efeito de forma consistente Ku55933 sobre a sobrevivência de células PC3 irradiados. Doxorrubicina causou um aumento dependente da dose na actividade da caspase 3 em ambas as linhas celulares. Combinando Ku55933 e /ou NU7441 com 20 nM de doxorubicina aumentou a morte celular de LNCaP (Figura 3E) e células PC3 (Figura 3F). Um grande aumento na apoptose LNCaP resultou de Ku55933 e /ou NU7441 combinado com 200 nM de doxorubicina, 95-99% das células foram positivas para caspase3 activo, ao passo que não foi detectado aumento nos PC3 sob as mesmas condições.

Finalmente , os dados de apoptose é consistente com os dados de sobrevivência como a indução de apoptose massiva correlaciona-se com grave redução na sobrevivência celular em altas doses de doxorrubicina. Além disso, NU7441 foi superior ao Ku55933 na indução de apoptose em células LNCaP. Considerando que, Ku55933 teve maior efeito em células PC3 que é consistente com os dados de sobrevivência.

Ku55933 e NU7441 aumentar a indução de DNA DSB em linhas celulares de CaP

Nós investigamos se o aumento de células CaP sensibilidade linhas em resposta à ATM e /ou inibição de ADN-PK é resultado do aumento do número de DSB de ADN por uma medida directa do sinal de H2AX e uma medida directa de ADN DSB (comet assay neutro). Como antecipado γ-H2AX sinal aumentou 0,5 h após IR em ambas as linhas de células e voltaram aos níveis normais no prazo de 4 h em células LNCaP (Figura 4A), ao passo que só foi reduzido em 50% em células PC3 (Figura 4b) o que sugere uma maior capacidade de reparação LNCaP em comparação com PC3. tratamento com doxorrubicina provocou um aumento dependente do tempo em γ-H2AX em LNCaP (Figura 4C) e PC3 (Figura 4D). Combinando tanto Ku55933 ou ambos os inibidores, quer com IR ou doxorrubicina reduziu o sinal γ-H2AX em ambas as linhas celulares, em todos os pontos de tempo examinados, que é consistente com ATM sendo a maior quinase responsável pela fosforilação da H2AX e a incapacidade de ADN-PK para fosforilar H2AX em a presença de inibido ATM. NU7441 inibida modestamente a indução γ-H2AX inicial em ambas as linhas celulares seguintes IR e doxorrubicina. No entanto, em momentos posteriores inibir DNA-PK resultou no aumento do sinal γ-H2AX reflectindo o aumento LAP DNA destacadas por γ-H2AX, uma consequência da fosforilação pela ATM ativa. Notável, em experimentos onde ambas as quinases foram inibidas não houve aumento no sinal de H2AX. células PC3 mostrou um pequeno aumento do cometa momento da cauda 24 h após IR ou doxorrubicina reflectindo a sua alta capacidade de reparar as suas lesões danos no DNA. Entretanto, a combinação quer inibidor ou com DNA agente prejudicial causado aumento modesto no momento da cauda. Combinando ambos inibidores havia um aumento aditivo no momento da cauda (Figura 4E)

LNCaP (A C). E PC3 (B D) As células foram tratadas com 10 Gy ou 1? M doxorrubicina seguinte 1 h de incubação com Ku55933 (10? M) e /ou NU7441 (1 uM) e coradas com anticorpo conjugado com FITC H2AX antes de ser analisada directamente no FACscan. Os resultados são a média de pelo menos 5 experiências independentes ± SEM. células PC3 (E) foram tratados como acima durante 24 h e analisados ​​utilizando teste do cometa, 50 células foram contadas por tratamento braço. Os resultados são a média de 3 experimentos independentes ± SEM

Notável, o aumento resultante do tratamento doxorrubicina foi maior em comparação ao que resulta do IR.; este poderia ser, em parte, relacionado com o facto de IR induz principalmente maior nível de rupturas dos filamentos individuais.

Discussão

Ku55933 e NU7441 são potentes inibidores da ATM e DNA-PK, respectivamente. Cada inibidor aboliu a autofosforilação da sua própria proteína alvo em ambas as linhas celulares CaP seguinte IR. Os dados com o tratamento com doxorrubicina foi similar entre as duas linhas celulares, mas a fosforilação de ADN-PK

Ser2056 não parece ser inibida por NU7441. Notavelmente, a fosforilação dos alvos a jusante H2AX

Ser139 e p53

Ser15 que são regulados principalmente por ATM foi abolida quando ambos os inibidores foram combinados. Além disso, um novo evento de fosforilação é relatado aqui que a fosforilação de Ser2056 de ADN-PKcs, acredita-se ser um local de autofosforilação verdadeiro para o DNA-PK [14], foi reduzida após tratamento Ku55933 (não NU7441) em resposta a doxorrubicina, mas não IR tratamento sugerindo que este local pode ser alvejado pelo ATM, dependendo do agente de indução de dano do ADN. Um controle relevante seria a esgotar nativa ATM e substituí-lo com um ATM cinase morta.

A combinação de ambos os inibidor com IR ou doxorrubicina resultou em um aumento enorme e significativa na sensibilidade das células LNCaP e PC3 ao citotóxico efeito de ambos RI e doxorrubicina. Além disso, a combinação dos dois inibidores em conjunto com agentes de ADN danificar resultou em aumento adicional na citotoxicidade em relação ao inibidor de combinação única. Isto coincide com a literatura relatou que a segmentação ATM e DNA-PK utilizando metodologia siRNA revelou aumento da sensibilidade ao IR e à quimioterapia em linhas celulares de CaP diferentes [15]. O aumento da sensibilidade resultante da combinação de inibidores de ambos pode ter uma implicação significativa para o tratamento de pacientes com CaP em um defeito nos RH ou NHEJ vias, tais como portadores da mutação BRCA [16]. Os doentes com um defeito na via de reparação pode potencialmente ser tratada com o inibidor da outra via e beneficiar de tratamento resultado máximo com um mínimo de toxicidade.

Aqui, uma característica importante do ciclo celular PC3, a falta da função de p53, conduziu a um aumento da acumulação na fase G2 /M do ciclo celular na presença de ATM, de ADN-PK ou de ambos os inibidores em especial em combinação com tratamento IV. No entanto, quer inibindo ATM ou de ADN-PK ou ambos em combinação com o tratamento com doxorrubicina dose elevada aumentou a acumulação de fase G1, sugerindo activação da barreira G1 por outras vias, tais como a p38MAPK /MK2 [17]. Na presença de p53 funcional (células LNCaP), as células acumuladas na fase G2 /M-fase quando ATM foi inibida enquanto eles acumulada em G1 quando o DNA-PK foi inibida. Isso poderia explicar os dados de sobrevivência desde a acumulação no G2 permitiria mais de reparo do DNA NHEJ mediada. Estes dados apoiam relatórios anteriores que sugerem que o efeito de ADN-PK em p53 contribui para o processo de apoptose, em vez de para o controlo do ciclo celular. É interessante que a inibição ATM conduz à acumulação G2, que pode ser explicado pelo efeito de quinase ATR activa na ausência de ATM quinase activa [18]. Curiosamente, combinando qualquer inibidor ou a combinação inibidor duplo com doxorrubicina dose elevada (danos no ADN excessiva) resultaram em um aumento dramático na população subG1, uma indicação de apoptose. Isto sugere que a presença de p53 pode desencadear a morte celular quando o dano no DNA é muito substancial para ser reparado. Nossos dados são consistentes com um papel para a ATM e ADN-PK na regulação do ciclo celular através do seu efeito nas proteínas diferentes [19].

Neste estudo, o efeito de inibir a ATM ou de ADN-PK sobre a morte celular linhas celulares de CaP revelou que, independente do estado de p53 ou a dependência da hormona, esta inibição aumentou a morte celular programada induzida por baixas doses de doxorrubicina ou IR. No entanto, a presença de p53 (células LNCaP) aumentou muito a população apoptótica com doses elevadas de doxorrubicina. Considerando que, na ausência de p53 (células PC3) havia ou nenhum ou um pequeno aumento na morte celular com elevada dose de doxorrubicina, que é consistente com o aumento observado na paragem do ciclo celular. A apoptose mais pronunciada em comparação com PC3 LNCaP em baixas doses de dano no DNA pode ser explicado pelo período mais curto de tratamento (48 h) por comparação com células LNCaP (96 h) para as células PC3.

Observamos que a indução primária de focos H2AX foi substancialmente reduzida através da combinação de um ou ambos os inibidores com agentes que danificam o DNA. Em pontos de tempo posteriores, formação de H2AX focos ainda foram inibidos nos braços de combinação de inibidor de ATM, enquanto aumentou nos braços inibidor de ADN-PK. Isto implica que a inibio de ADN-PK aumenta as DSB de ADN que estão destacadas por aumento do número de focos H2AX formado no local de dano. No entanto, diminuição da formação de focos H2AX na braços inibidor da ATM não é uma consequência de menos LAP a ser gerados como demonstramos o aumento LAP DNA usando o ensaio cometa neutro. Isto é consistente com os dados que sugerem que a ATM é a principal cinase que induz focos H2AX e que o DNA-PK pode fosforilar H2AX apenas na ausência de ATM, mas não na presença de inibido quimicamente ATM [20]. Estes dados são consistentes com um relatório usando outros métodos para a detecção de H2AX [21] onde a formação de focos H2AX inicial (30 minutos a seguir IR) foi abolido quando se combina ATM e /ou inibidores de ADN-PK. Outro relatório contradiz com os nossos dados [22], onde eles demonstraram DNA-PK desempenha papel dominante na H2AX formação de focos na ausência de função de ATM; No entanto, este relatório usado linhas celulares que não possuem qualquer ATM ou ADN-PK que não é o caso nas nossas linhas celulares. Para além disso, inibindo a ATM e ADN-PK não resultou num aumento do sinal H2AX em todos os pontos de tempo. Isto sugere que a ATR (a terceira quinase implicada na fosforilação H2AX) é incapaz de levar a cabo esta função de fosforilação na presença de ATM e ADN-PK, mesmo quando ambos são inibidas. Uma abordagem interessante seria investigar o efeito sobre Rad51 formação de focos quando essas quinases são inibidas.

O papel chave da ATM e DNA-PK na reparação de DSB de ADN em células de mamíferos sugere que derrubar a função de um ou ambas as proteínas devem aumentar o número de DSB de ADN na sequência de um tratamento de indução. Utilizando o ensaio de cometa neutro que mostrou que a inibição da ATM e /ou ADN-PK resultou no aumento do número de DSB de ADN seguinte IR ou tratamento com doxorrubicina. Foi observado um efeito aditivo nos braços de tratamento em que ambas as quinases foram inibidas. É interessante que as caudas de cometa são quase iguais aos braços de inibidor único apesar de que seria de esperar que o inibidor de ADN-PK deveria causar mais aumento da LAP como NHEJ é a principal via para a reparação de DSB de ADN. Isso pode ser porque nós realizou o teste do cometa, às 24h, que é mais fisiologicamente significativa para as células, mas não necessariamente reflete a cinética de reparação. A maioria dos LAP são reparados rapidamente por NHEJ e depois cinética mais lenta pelo RH para LAP e LAP francas residuais resultantes de forquilha de replicação parado. impactos ATM no HR, portanto, KU55933 deve diminuir esta fase lenta ainda mais e, portanto, um maior número de quebras às 24 horas, em comparação com quando o RH não é inibida (controle e inibidores de DNA-PK braços).

Em resumo, este estudo relata um novo tratamento para câncer de próstata, visando o DNA máquinas LAP reparo. Mostra-se que a segmentação reparação de DSB confere uma quimio- reforçada e rádio-sensibilidade de linhas de células sensíveis e insensíveis CaP hormonais associadas com aumento da morte celular programada. Uma avaliação mais aprofundada dos inibidores específicos precisa ser conduzida em modelos animais, incluindo a avaliação da disponibilidade de plasma, toxicidade e eficácia antes de avançar para qualquer ensaio clínico.