Abstract

Fundo

O topotecano produz danos ao DNA que induz a autofagia em células cancerosas . Neste estudo, sensibilizando topotecano com as células cancerígenas do cólon com status P53 diferente através da modulação da autofagia foi examinada.

Metodologia /Principais Achados

O dano ao DNA induzido por tratamento com topotecano resultaram em autofagia citoprotetora no cólon as células cancerosas com o tipo selvagem p53. No entanto, em células com p53 mutante ou knockout de p53, o tratamento com a morte celular associada a autofagia induzida topotecano. Em células de cancro do cólon de p53 do tipo selvagem, topotecano tratamento p53 activada, regulada positivamente a expressão de sestrin 2, induziu a fosforilação da subunidade AMPKα em Thr172, e inibiu a via mTORC1. Além disso, a inibição da autofagia aumentou o efeito anti-tumoral do tratamento com topotecano em células de cancro do cólon de p53 de tipo selvagem, mas atenuado o efeito anti-tumoral do tratamento com topotecano em células p53 knockout in vivo.

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem que a indução dependente de p53 de tipo selvagem de autofagia citoprotector é uma das respostas celulares que determinam a sensibilidade celular para o topotecano de drogas que danificam o ADN. Por isso, o nosso estudo fornece uma estratégia terapêutica potencial que utiliza uma combinação de agentes que danificam o ADN e inibidores da autofagia para o tratamento de cancro do cólon com o tipo selvagem p53

citação:. Li DD, Sol t, Wu XQ, Chen SP, Deng R, S Jiang, et al. (2012) A inibição da autofagia sensibiliza células cancerígenas do cólon com wild-Type p53, mas não mutante p53 ao topotecano tratamento. PLoS ONE 7 (9): e45058. doi: 10.1371 /journal.pone.0045058

editor: Gian Maria Fimia, Istituto Nazionale per le Malattie Infettive, Itália |

Recebido: 13 de fevereiro de 2012; Aceito: 15 de agosto de 2012; Publicado: 14 de Setembro 2012 |

Direitos de autor: © Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (30873085, 30972882, 81101670) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), o Projeto principal Ciência e Tecnologia da Pesquisa Nacional básica programa (973 programa) da China (2011CB504300) eo Natural Science Foundation de Guangdong, na China (S2011020002759). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O topotecano, um inibidor da topoisomerase I que induz danos no DNA, é usado para tratar o câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de pulmão e câncer cervical avançado [1], [2]. Enquanto os agentes que danificam o DNA têm sido utilizados ao longo dos últimos 50 anos, a razão que alguns pacientes apresentam diferentes sensibilidades a uma droga que danificam o DNA permanece obscuro. Portanto, uma visão sobre as respostas celulares desencadeadas por fármacos que danificam o ADN e os mecanismos que determinam a sensibilidade ao fármaco é crítica para expandir a utilidade dos fármacos de ADN -damaging para o tratamento de cancros.

Autophagy é um mecanismo envolvido na catabólico a reciclagem e de rotação dos componentes citoplasmáticos [3], [4]. Autophagy podem facilitar a sobrevivência celular ou a morte em resposta a diferentes estímulos de stress [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Autophagy também desempenha um papel essencial na manutenção da estabilidade genómica [13], [14], [15], através da manutenção do metabolismo e sobrevivência durante o stress (por exemplo, danos no ADN) para benefício de sobrevivência de células [16]. Muitos estudos têm demonstrado que a autofagia está associada com um número de estados patológicos, incluindo o cancro [10], as doenças infecciosas, as miopatias e doenças neurodegenerativas [17], [18], [19]. Porque a função da autofagia em cânceres é complicado e pode ter consequências opostas [7], muitas hipóteses têm sido propostas sobre o papel da autofagia no câncer. Uma dessas hipóteses sugere que o papel dos autofagia depende da fase de desenvolvimento do tumor [20]. Numa fase inicial de desenvolvimento do tumor, a evidência genética indica firmemente que a autofagia suprime iniciação do tumor. No entanto, os dados também convincente sugere que as células de tumor estabelecidas, mas não iniciar células de tumor, exigem autofagia como uma via de sobrevivência essencial em fases avançadas do desenvolvimento do tumor. Os tumores frequentemente residir num ambiente privado de nutrientes, factores de crescimento, e oxigénio. Assim, autofagia está localizada nas regiões hipóxicas de tumores que são os mais distantes dos vasos sanguíneos com fornecimento de nutrientes em que sustenta a sobrevivência das células de tumor. Outra hipótese é a de que o cancro autofagia regula de forma específica células e dos tecidos [21], [22]. Muitas células cancerosas sofrem morte celular autofágica depois de terapias contra o câncer; No entanto, autofagia também protege algumas células cancerosas contra os tratamentos anti-cancerígenos através do bloqueio da via apoptótica.

O supressor de tumores p53 é uma molécula-chave na resposta a danos no ADN. Em resposta a condições adversas, incluindo genotóxico, hipóxica, e /ou a tensão oncogénica, p53 sofre rapidamente reversível modificações pós-traducionais que facilitam a sua estabilização [23]. No núcleo, p53 activa pode ligar-se para as regiões promotoras e transactivar uma multiplicidade de genes alvo que participam na progressão do ciclo celular, apoptose, e /ou metabolismo [24]. p53 também medeia as funções de supressão de tumor independente de transcrição do lado de fora do núcleo [25]. Por exemplo, p53 citoplasmática pode relocalise para a mitocôndria e provocar permeabilização mitocondrial membrana [26], [27].

No câncer, existem muitas ligações entre autofagia e p53, que ainda têm de ser plenamente compreendido [28]. Um estudo relatou que P53 promovido autofagia através AMP-quinase (AMPK) ativação e alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) inibição [29]. No entanto, acumular evidência indica que o supressor de tumor p53 pode modular autofagia em várias maneiras, dependendo da sua localização subcelular [25]. Por um lado, a p53 é um factor de transcrição que responde ao stress celular e transactiva os genes, tais como a DRAM, sestrins1 e sestrins2 que induzem morte celular ou autofagia autophagic [30], [31], [32]. No entanto, por outro lado, p53 nuclear citoplasmática mas não pode activar a mTOR e reprimir autofagia [33]. Além disso, a p53 também pode induzir a autofagia pela regulação da LC3 [34]. No entanto, a compreensão de como esses efeitos são alcançados permanece indefinida.

No presente estudo, relatamos que o tipo selvagem p53 pode ativar a AMPK, inibem mTORC1 e promover cólon células cancerosas de sobrevivência, permitindo que a autofagia citoprotetora em resposta ao tratamento com topotecano . Além disso, a inibição da autofagia sensibiliza células cancerígenas do cólon com p53 de tipo selvagem para o tratamento de topotecano. Em contraste, a inibição da autofagia aliviou o efeito anti-tumoral de tratamento topotecano em mutantes de p53 ou células do cancro do cólon knockout tanto in vitro como in vivo. Portanto, nosso estudo indica que uma combinação de agentes que danificam o ADN e inibidores da autofagia poderia servir como uma nova abordagem quimioterápicos para o tratamento de células cancerígenas do cólon com o tipo selvagem p53.

Resultados

topotecano tratamento induziu autophagy no cancro do cólon linhas celulares

um padrão de coloração LC3 punctata foi identificado como um marcador biológico da autofagia [35], [36]. Para estudar se o agente de topotecano-danificar DNA poderia induzir autofagia, as células HCT116, LS-174T e HT29 expressam LC3 fundido com a proteína fluorescente amarela (YFP-LC3) foram criados. Como mostrado na Fig. 1A, em que as células não tratadas, a YFP-LC3 estava uniformemente distribuída no citosol. No entanto, o tratamento com topotecano induziu uma acumulação potente de focos YFP-LC3 nestas células. LC3 é convertido para a LC3 lipidada (LC3-II) mediante a formação de uma autophagosome, e LC3-II migra mais rapidamente em comparação com o nonlipidated LC3-I sobre um gel de SDS /PAGE [37]. Utilizou-se esta diferença na migração para controlar ainda mais os níveis LC3-II após tratamento com topotecano e descobriu que a aparência de LC3-II foi induzida a um nível elevado por tratamento com topotecano em uma variedade de linhas celulares de cancro do cólon (Fig. 1B e a Fig. S1). Maduras auto-lisossomas são submetidas a proteólise autophagic, o que leva a um nível reduzido de substratos autofágicos, bem como a redução dos níveis de autophagosome e componentes auto-lisossoma, tais como p62 /SQSTM1 [38], [39]. Para confirmar adicionalmente que o processo de autophagic foi induzida por tratamento com topotecano, foi detectada a proteína P62 por Western blotting. Os resultados revelaram que P62 foi degradada após tratamento com topotecano, o que indica autofagia foi induzido nestas células de cancro do cólon (Fig. 1B e a Fig. S1).

. HCT116, LS-174T e células HT29 foram transfectadas durante 24 horas, com uma construção de expressão que codifica LC3 fundida à proteína fluorescente amarela (YFP-LC3). Em seguida, as células foram tratadas com ou sem um ug /ml de topotecano (TPT), durante 24 h e visualizados sob um microscópio confocal. B. A indicado as células foram tratadas com as concentrações indicadas de topotecano durante 24 h. Os lisados ​​foram analisados ​​por immunoblotting com os anticorpos LC3 e P62.

A inibição da autofagia aumentou a sensibilidade de células de cólon humano com o tipo selvagem p53 mas não mutante p53 ou p53 células nocaute para topotecano Tratamento

para estudar a autofagia induzida pelo topotecano em maior detalhe, a interferência de ARN foi utilizado para esgotar duas proteínas principais autophagy conhecidos, beclin1 e Atg5 (Fig. 2A e Fig. S2A). Como mostrado na Fig. 2B e Fig. S2B, a depleção de uma ou beclin Atg5 por tratamento siARN bloqueou eficazmente a acumulação de LC3-II após tratamento com topotecano, o que indica a inibição da autofagia. Além disso, a inibição da autofagia pela depleção de uma ou beclin Atg5 aumento da morte celular induzida pelo topotecano na HCT116 e linhas de células LS-174T, que são p53 de tipo selvagem células de cancro do cólon humano (Fig. 2C). Estes resultados foram também confirmados por ensaio de SRB (Fig. S3A). Estes resultados indicam que o tratamento com topotecano induzida autofagia funcional e citoprotectora nestas células p53 de tipo selvagem. Para confirmar ainda mais nossos resultados, também inibiu a via autofágica com inibidores farmacológicos. Verificou-se que um co-tratamento de topotecano com cloroquina (CQ), um inibidor da função lisossómica que impede a realização de autofagia no passo final, bloqueou eficazmente a degradação induzida pelo topotecano de P62. Importante, a inibição da autofagia por CQ também sensibilizados células HCT116 a morte celular induzida pelo topotecano (Fig. 2D e Fig. S2C).

. Os lisados ​​de células transfectadas com HCT116 o beclin um siRNA ou Atg5- shRNA foram analisados ​​por imunotransf erência. B. Uma análise imunotransferência mostrou nenhuma acumulação de LC3-II em (, beclin um siRNA ou shRNA Atg5-i.e. tratados) células autophagy-defeituosa após o tratamento com 1 ug /mL TPT. As células de controlo C. HCT116 e LS-174T, sibeclin 1-células, e shAtg5 células foram cultivadas a 6000 células por poço numa placa de 96 poços e expostas a diferentes concentrações de topotecano (0,039-1,25 g /ml) durante 72 h. O nível de inibição do crescimento foi detectada utilizando o ensaio de MTT. Dados em C são médias ± S.D. (

n

= 3).

P Art 0,05, teste t de Student. D. células HCT116 foram incubadas com 1 ug /mL de topotecano e /ou 10 ug /mL CQ durante 24 h. Os lisatos foram analisados ​​por imunotransferência com os anticorpos P62. As células HCT116 foram incubadas com as concentrações indicadas de topotecano ou uma combinação de topotecan e 10 ug /mL CQ durante 24 h. A quantidade de morte celular foi quantificada utilizando o ensaio de coloração de PI por citometria de fluxo. Dados em D são médias ± DP (

n

= 3). *

P Art 0,05, **

P

. 0,01,

t

Student

Curiosamente, em contraste com o células com p53 de tipo selvagem, a inibição da autofagia por CQ p53 em células mutantes bloqueou a morte celular induzida por tratamento com topotecano (Fig. 3A). Além disso, em células em que o gene da p53 tinha sido eliminado somaticamente (HCT116 p53

– /-), a inibição da autofagia por tratamento CQ também bloqueou a morte celular induzida pelo topotecano (Fig 3B.). Da mesma forma, a inibição da autofagia pela depleção Atg5 não sensibilizam a p53 HCT116 – /- ao topotecano células induzida morte celular (Figura 3C e Fig S3B..). Em resumo, a inibição da autofagia sensibilizados células de cancro do cólon com p53 de tipo selvagem para o tratamento topotecano; no entanto, a morte celular induzida pelo topotecano foi atenuada nas células p53 knockout da inibição da autofagia.

O HT29, SW480, SW620 e células foram incubadas com as concentrações indicadas de topotecano ou uma combinação de topotecan e 10 ug /mL CQ durante 24 h. A quantidade de morte celular foi quantificada utilizando o ensaio de coloração de PI por citometria de fluxo. Dados em um são médias ± DP (

n

= 3). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, de Student

t

teste B. HCT116 p53

+ /+ e HCT116 p53

– /- células foram cultivadas a 6000 células por poço numa placa de 96 poços e expostas a diferentes concentrações de TPT (0,0625-2 ug /ml) e /ou 10 ug /mL CQ durante 72 h. O nível de inibição do crescimento foi detectada utilizando o ensaio de MTT. C. Os lisados ​​de p53 HCT116

– /- células transfectadas com o vector ou Atg5 shRNA foram analisados ​​por imunotransf erência. O ensaio MTT foi utilizado para analisar o nível de inibição de crescimento celular. Dados em B, C são médias ± DP (

n

= 3).

P

. 0,05,

t

teste

Student topotecano induzida por autofagia foi mediada por p53 através da ativação de Sestrin 2 e AMPK em células de cancro do cólon com p53 de tipo selvagem

o supressor de tumores p53 é activada por vários tipos de danos no DNA e, por sua vez, inibe a proliferação celular através da indução de genes alvo específicos [40]. Assim, na próxima tentativa para investigar se P53 e seus genes alvo foram envolvidos em topotecano-induzida por autofagia. Como esperado, o tratamento com topotecano estimulou um aumento do nível de P53 em uma maneira dependente da dose nas linhas celulares HCT116 e LS174T. Além disso, o tratamento com topotecano também aumentou a expressão do gene alvo P53, sestrin 2. A fosforilação da AMPK também foi aumentada após a exposição topotecano (Fig. 4A e Fig. S4A). Além disso, o tratamento com ARNsi de segmentação p53 ou sestrin 2 revogada eficazmente a activação da AMPK induzida pelo topotecano e acumulação LC3-II (Fig. 4B e Fig. S4B). Estes achados sugerem que P53 medeia autofagia induzida pelo topotecano através da ativação de sestrin 2 e AMPK em células de cancro do cólon com o tipo selvagem p53.

A. As células HCT-116 e LS-174T foram tratados com várias concentrações de TPT durante 24 h. Os níveis de p53, sestrin2 e p-AMPK foram analisados ​​por imunotransf erência. B. células HCT116 foram transfectadas com p53 ou sestrin 2 siRNAs durante 24 h, tratadas com ou sem 1 ^ g /mL TPT durante mais 24 h, e as proteínas indicadas foram então analisados ​​por imunotransferência. C. As células HCT116 foram transfectadas com a LKB1 ou CaMKKβ siRNAs, tratados com ou sem 1 ^ g /mL TPT por um adicional de 24 h, e as proteínas foram indicados detectada por imunotransferência.

Ca

2 β quinase + /dependente de calmodulina-(CaMKKβ) pode fosforilar e activar AMPK em resposta ao aumento dos níveis de cálcio [41], [42]. Os estudos mostraram também que a LKB1 serina-treonina-quinase é necessário para a activação da AMPK em resposta ao stress [43]. AMPK pode ser fosforilada por factor de crescimento transformante-β-quinase activada 1 (TAK1), o qual activa a AMPK TRAIL após tratamento [14]. Para investigar se esses ativadores de AMPK conhecidos foram envolvidos neste processo, a expressão de LKB1 e CaMKKβ foram derrubados usando siRNA. Os resultados demonstraram que, mesmo após o esgotamento eficaz do LKB1 e CaMKKβ, nem a activação induzida por AMPK topotecano nem a acumulação LC3-II foram afectados (Fig. 4C e a Fig. S4C).

Topotecano tratamento induziu Autophagy Através a inibição mediada pelo AMPK de mTORC1 no tipo selvagem p53 Câncer Cells cólon

AMPK desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase da energia e activação autofagia [44]. Para examinar o efeito do tratamento com topotecano na atividade AMPK, células HCT-116 e LS-174T foram expostos ao topotecano de uma maneira dose e dependente do tempo. Topotecano tratamento noteably activado AMPK nas duas linhas de células testadas com a p53 de tipo selvagem, que foi demonstrado pela fosforilação da AMPKα ao resíduo do sítio activo Thr172 (Fig. 5A e a Fig. S5A). Além disso, o tratamento com topotecano induzida uma activação rápida e sustentada de AMPK, que foi evidente pelo aumento na fosforilação de acetil-CoA-carboxilase (ACC), um substrato de AMPK bem conhecido, a Ser79 (Fig. 5B Fig. S5B). Estudos têm mostrado que mTOR pode perceber as alterações no estado de energia celular através da proteína cinase activada por AMP (AMPK), e a inibição da mTORC1 por AMPK pode aumentar autofagia [45]. Consistente com estes resultados, verificou-se que o tratamento com topotecano inibida a via mTORC1, que era evidente por uma fosforilação reduzida de proteína ribossomal S6 quinase 1 (p70S6K), um substrato mTORC1 directa (Fig. 5A e a Fig. S5A).

HCT116 e LS-174T foram tratados com TPT durante 24 h. Os níveis de expressão das proteínas indicadas foram analisados ​​por imunotransf erência. B. células HCT116 foram tratadas com 1 ng /mL TPT durante os tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos fosfo-ACC. C. As células foram tratadas com 1 ng /mL TPT e /ou 20? M do composto C durante 24 h, e os níveis de expressão das proteínas indicadas foram analisados ​​por imunotransf erência. D. células HCT116 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou AMPKα durante 48 h, tratadas com ou sem 1 ^ g /mL TPT, e o nível das proteínas indicadas foram subsequentemente analisados ​​por imunotransferência.

Para determinar se atividade AMPK era essencial para autofagia induzida por topotecano, que inibiu a actividade da AMPK usando um inibidor farmacológico ou interferência de ARN. O pré-tratamento das células cancerosas com 20 pM do composto C, um inibidor potente e selectivo da AMPK, prevenida eficazmente a activação induzida pelo topotecano AMPK. Ao mesmo tempo, a acumulação de LC3-II induzida por topotecano também foi bloqueada por tratamento do composto C. Estes resultados indicam que a autofagia foi inibida mediante a inibição da AMPK (Fig. 5C e a Fig. S5C). O esgotamento do catalítica α1 subunidade da AMPK usando siRNA também confirmou estes resultados. A inibição da actividade da AMPK, de facto bloqueada a indução de autofagia, o que se tornou evidente pelo nível de LC3-II (Fig. 5D e a Fig. S5D). Além disso, a depleção de AMPKα restaurado actividade p70S6K, que indicaram que a inibição da mTORC1 foi aliviada (Fig. 5D e a Fig. S5D). Estes dados sugerem que a autofagia induzida pelo agente que danificam o ADN, topotecano, depende da inibição mediada por AMPK de mTORC1.

A inibição da AMPK activação aumentou a sensibilidade das células cancerígenas do cólon humano com o tipo selvagem p53 mas não mutante p53 para o tratamento com topotecano

de forma a confirmar se a atividade AMPK era essencial para a viabilidade celular após tratamento com topotecano em células cancerosas com o tipo selvagem ou mutante p53, células de cancro do cólon humano foram tratadas com várias concentrações de topotecano na presença ou ausência do inibidor de AMPK, composto C. Tal como mostrado na Fig. 6, o tratamento combinado com o composto de topotecano C resultou em um aumento do nível de citotoxicidade em células do cancro do cólon humanos com p53 de tipo selvagem (HCT116 e linhas de células LS174-T). No entanto, o tratamento com Composto C não sensibilizar células com p53 mutante (linhas de células HT29, SW480 e SW620) o tratamento com topotecano. Com base nestes resultados, conclui-se que a activação de AMPK serve como um mediador central na indução de autofagia citoprotector em resposta a danos no ADN em células de cancro do cólon contendo p53 do tipo selvagem, mas não o mutante p53.

Várias células foram cultivadas a 6000-8000 células por poço numa placa de 96 poços e expostas a diferentes concentrações de TPT (0,15-2,5 ug /ml) e /ou 10? M do composto C durante 72 h. O nível de inibição do crescimento foi detectada utilizando o ensaio de MTT. Os dados são médias ± S.D. (

n

= 3).

P Art 0,05, de Student

t

teste

A actividade anti-tumoral de topotecano em associação com a autofagia Inhibitor em um HCT116 do cólon humano Cancer Xenoenxerto. modelo

para explorar a eficácia in vivo do inibidor autofagia CQ sensibilizar de tipo selvagem p53 células de cancro de cólon humano para tratamento topotecano, foi gerado um modelo de xenoenxerto em ratinhos nus. ratinhos nus atímicos foram injectados subcutaneamente com 4 × 10

6 p53 HCT116

+ /+ ou HCT116 p53

– células cancerosas, e os tumores resultantes foram deixados crescer para aproximadamente 5 d para produzir uma média – /volume de tumor de 40 mm

3 antes de tratamento com drogas. Os efeitos anti-tumorais de topotecano, CQ, ou um tratamento de combinação das duas drogas foram avaliadas no p53 HCT116

+ /+ e HCT116 p53

– /- xenoenxertos. Topotecano foi administrado intraperitonealmente uma vez cada 4 d (2 mg /kg), e CQ foi administrada por via intraperitoneal uma vez por dia (10 mg /kg). Como mostrado na Fig. 7, um atraso no crescimento do tumor foi observada com o tratamento com topotecano sozinho, e a combinação de CQ tratamento com topotecano aumentou o efeito anti-tumor no p53 HCT116

+ /+ modelo de xenoenxerto. No entanto, o efeito anti-tumoral de CQ não foi melhorada pelo tratamento de combinação com topotecano no p53 HCT116

– /- modelo de xenoenxerto. Pelo contrário, o tratamento de combinação de drogas parece diminuir a actividade anti-tumoral de topotecano neste modelo.

ratinhos nus atímicos foram injectados subcutaneamente com 4 × 10

6 HCT116 p53

+ /+ ou HCT116 p53

– células cancerosas – /. Seis ratos foram distribuídos em cada um dos grupos de tratamento. Os tumores foram deixados crescer para aproximadamente 5 d para produzir um volume médio do tumor de 40 mm

3 antes de tratamento com drogas. Topotecano foi administrado intraperitonealmente uma vez cada 4 d (2 mg /kg), e CQ foi administrada por via intraperitoneal a cada dia (10 mg /kg). O crescimento do tumor foi medido a cada 4 dias de acordo com o método descrito na secção “Materiais e Métodos”. Os resultados são apresentados como médias ± S.D. (

n

= 6). *

P

. 0,05,

t

Student

Além disso, o efeito do inibidor da AMPK composto C em combinação com topotecano no modelo de xenotransplante era examinado. Tendo estabelecido a eficácia in vitro para a AMPK quimiossensibilização induzida por inibidor de topotecano em células de cancro do cólon humano de p53 do tipo selvagem, o modelo de xenoenxerto em ratinhos nus foi gerado para explorar se a inibição da AMPK foi envolvido em quimiossensibilização ao topotecano in vivo. Como mostrado na Fig. S6, composto C desempenhou um papel semelhante ao CQ em combinação com tratamento com topotecano. Composto C pode aumentar o efeito anti-tumor em combinação com topotecano em HCT116 p53 + /+ mas não de p53 – /-. Modelo de xenoenxerto

Por isso, os nossos resultados sugerem que a inibição da autofagia sensibiliza células cancerígenas do cólon com o tipo selvagem p53 ADN prejudiciais drogas. Uma vez que a AMPK serve como um mediador central na indução de autofagia citoprotector em resposta a danos no ADN, a inibição da AMPK também pode aumentar o efeito de drogas que danificam o ADN para as células de cancro do cólon com p53 de tipo selvagem.

Discussão

a autofagia é um processo de auto-digestão lisossômico evolutivamente conservada. Os efeitos da autofagia em tumorigênese e terapia do câncer são paradoxais. Tem sido relatado que a autofagia é capaz de suprimir a tumorigénese através da manutenção da estabilidade e eliminação de p62 genómico. No entanto, utilizando a autofagia como um mecanismo citoprotetora, as células tumorais conseguem sobreviver no microambiente dura. Em resposta a muitas terapias anti-cancro, autofagia é induzido como uma estratégia de pró-sobrevivência em células de cancro humano ou um efeito antitumoral contribuindo. Portanto, uma grande quantidade de esforço deve ser feito para aumentar o que decide funções citoprotetoras e citocida do autofagia, que é essencial na segmentação nas vias de sinalização autofágicos certas que torna o tratamento do câncer mais promissor. Nisto, verificou-se que o tipo selvagem p53 mediada por activação AMPK resultou em autofagia citoprotector em resposta ao topotecano drogas que danificam o ADN em células de cancro do cólon humano. A inibição da autofagia sensibilizados células de cancro do cólon com p53 de tipo selvagem para o tratamento topotecano; No entanto, a inibição autofagia atenuou o efeito anti-tumoral do tratamento com topotecano em mutantes de p53 ou células do cancro do cólon knockout tanto in vitro como in vivo. Além de mecanismos conhecidos, sugerimos que p53 pode modular a autofagia e propôs que o estado de p53 poderia determinar o destino celular após DNA-danos droga autofagia induzida pelo topotecano e ajudam a manter autofágica homeostase.

No que diz respeito ao câncer, existem muitas ligações entre autofagia e p53. No presente estudo, nós nos concentramos sobre o destino das células cancerosas autofagia em resposta a um agente de danos no DNA sob o status de p53 diferente. Primeiro, mostramos que várias linhas celulares de cancro do cólon, incluindo p53 do tipo selvagem e mutante p53 /células cancerígenas do cólon humano knockout, morfológica para exposições e características bioquímicas característica de células submetidos a autofagia após o tratamento com o topotecano de drogas que danificam o DNA. Além disso, o bloqueio de autofagia pela depleção de Atg5 ou beclin uma interferência por RNA ou por tratamento com cloroquina, mas que aliviou a citotoxicidade de topotecano em células cancerosas com p53 mutante ou knockout p53. Como sabemos, o topotecano não só deve fazer danos no DNA, mas também reter as células ao G1 prisão /S ou G2 /M prisão dependendo de linhas celulares distintas. Para explorar se a paragem do ciclo celular é suficiente para induzir a morte de células potenciada após autofagia inibição, utilizou-se a vincristina (VCR) na forma de um tipo diferente de fármacos anti-cancro para confirmar as nossas descobertas. VCR liga-se a dímeros de tubulina, inibindo a montagem de estruturas de microtúbulos. Ruptura dos microtúbulos prende a mitose na metáfase. No nosso estudo, comparando com o tratamento só VCR, combinação com inibidor autofagia não faz grande diferença em células cancerígenas do cólon qualquer que seja o estado da p53 (Fig. S7). Os resultados sugeriram que a morte celular mediada pelo topotecano e autofagia citoprotetora poderia ser associado a danos no DNA em células de câncer de cólon. Os nossos estudos anteriores mostraram que a autofagia contribui para a morte celular em células CNE2 com p53 mutante e células Hep3B, que são deficientes em p53 [46], [47], [48]. Embora pareça racional para ver p53 por suas atividades pró-apoptóticos, mostramos que a extensão da sobrevivência celular através da indução de autofagia também era uma característica inerente do tipo selvagem p53. Tal função citoprotectora pode estar relacionado com o papel da p53 de tipo selvagem e autofagia na manutenção da homeostase metabólica intracelular. No entanto, algumas células cancerosas com p53 mutante ou knockout p53 perdeu esse recurso prosurvival de autofagia. De facto, o bloqueio da autofagia podem promover a morte de células de cancro nestas condições. Nossas descobertas se juntou a um número crescente de exemplos qual é a função da autofagia na terapia do câncer eo que decide o destino das células cancerosas autofágicos.

Os mecanismos através dos quais do tipo selvagem p53 induz a autofagia citoprotetora parecem surgir principalmente a partir da transcrição controle de reguladores da via mTOR. De facto, vários genes alvo, tais como p53, AMPK, TSC2, e PTEN, são todos conhecidos os reguladores negativos da mTORC1. Notavelmente, dois genes alvo p53, sestrin1 e sestrin2, foram identificados como um elo crítico entre a ativação p53 ea atividade mTORC1 [31], [49], [50]. Nesta base, nós a hipótese de que p53 de tipo selvagem e o seu alvo, sestrin 2, pode ativar a AMPK, inibir mTORC1 e promover a sobrevivência celular, permitindo uma autofagia citoprotector em resposta ao topotecano. Com base nos dados mostrados neste estudo, esta hipótese parece correcto. No entanto, dois activadores de AMPK bem conhecidas, LKB1 e CaMKKβ, não eram responsáveis ​​pela activação induzida por topotecano de AMPK e a autofagia resultante. Como esperado, a activação e a inibição da AMPK fosfo-p70S6K não foram observados após tratamento com topotecano em células p53 mutante (Fig. S8). Além disso, os nossos dados mostram que a inibição da AMPK aumento da sensibilidade celular para o tratamento de topotecano em células de cancro da p53 de tipo selvagem, mas não em células mutantes de p53. Os nossos resultados sugerem que no tipo selvagem p53 células cancerígenas do cólon, mas não de células de p53 mutantes, o p53-activated AMPK serve como um mediador central na indução de autofagia citoprotector em resposta a danos no ADN.

Colectivamente, o destino das células cancerosas autofágicos provável difere entre as células com status de p53 diferente. No caso de células cancerosas com o tipo selvagem p53, p53 promove a AMPK factor de sobrevivência. Como resultado, a AMPK activo pode promover autofagia para proteger as células cancerosas para neutralizar a citotoxicidade causada pelo agente danificador de ADN. Inversamente, o mutante p53 ou perda não pode ativar a AMPK, mas pode promover outros “proteína cinase activada pelo stress”, tais como c-Jun quinases NH2-terminais, forçar a altas taxas autophagy, e, eventualmente, causar a morte das células autophagic. Além disso, podemos confirmar que a inibição da autofagia sensibilizados células de cancro do cólon com p53 do tipo selvagem, que em contraste inibiram efeito antitumoral in aqueles com p53 nocaute para tratamento in vivo de ADN danos. Por isso, o nosso estudo proporcionou uma estratégia potencial tratamento em que a combinação de agentes de danos no ADN com inibidor autofagia foi utilizado em células cancerosas com p53 do tipo selvagem, no entanto, a combinação de ADN danificar drogas e indutores autophagy pode ser desenvolvido em uma estratégia útil para tratar cancros que expressam mutante p53 ou p53 nocaute.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal de Sun Yat- Sen University com o número de autorização 11002A.

Cultura celular

HCT116, LS174-T, SW480, SW620 e células HT29 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS (inactivado pelo calor a 56 ° C durante 30 minutos) e as quantidades apropriadas de penicilina e estreptomicina, em uma incubadora a 37 ° C com atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. O p53 HCT116

– /- linha celular foi gentilmente cedido pelo Professor Jing-Xuan Pan (Universidade Sen Sun-Yat, China)

microscopia confocal e Imunofluorescência Indireta

As células foram. transientemente transfectadas com um vector de expressão de proteína fluorescente amarela (YFP) LC3 tagged utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, 11668019). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com topotecano. Depois de um 24 h tratamento com topotecano, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e examinadas sob um microscópio de varredura a laser confocal (Olympus, FV-1000).

RNA Interferência

As células foram transfectadas