Sumário
phloridzin (florizina ou floretina 2 ‘-
O
-glucoside) é conhecida por bloquear a absorção de glicose intestinal. Nós investigamos o efeito anticancerígeno de phloridzin e seus novos derivados utilizando linhas celulares de cancro humano. Nós sintetizaram novos derivados acilados de floridzina com seis ácidos gordos de cadeia longa diferentes por acilação enzimática utilizando regiosselectiva
Candida antarctica
lipase B. Os efeitos antiproliferativos dos novos compostos foram investigados em comparação com os compostos originais, floridzina, aglicona floretina, as seis ácidos gordos livres e fármacos quimioterapêuticos (sorafenib, doxorrubicina e daunorrubicina) utilizando carcinoma hepatocelular humano HepG2, células de adenocarcinoma da mama humano células MDA-MB-231 e células de leucemia monocítica aguda THP-1, juntamente com os hepatócitos humanos e de ratos normais. Os ésteres de ácidos gordos de floridzina inibiu significativamente o crescimento das duas células de carcinoma de leucemia e ao mesmo tempo as doses de tratamento eram semelhantes não tóxicos para os hepatócitos humanos ou de ratos normais. A potência antiproliferativa de ésteres gordos de floridzina era comparável com a potência dos fármacos quimioterapêuticos. Os ésteres de ácidos gordos de floridzina inibida topoisomerases de ADN IIα actividade que possa induzir L
0 /L
1 prisão de fase, induzida apoptose através da activação de caspase-3, e redução do nível de ATP e o potencial de membrana mitocondrial em células HepG2. Com base na alta seletividade em células cancerosas, ácido decosahexaenoic (DHA) éster de phloridzin foi selecionado para análise de expressão gênica utilizando RT
2PCR matriz de destino droga contra o câncer humano. efeito anti-proliferativo de éster de DHA de phloridzin poderia estar relacionada com a regulação negativa do gene anti-apoptótica (BCL2), receptores do fator de crescimento (família EBFR, IGF1R /IGF2, PDGFR) e seus parceiros de sinalização a jusante (PI3K /AKT /mTOR, Ras /Raf /MAPK), maquinaria do ciclo celular (CDKs, TERT, TOP2A, TOP2B), bem como epigenética reguladores (HDACs). Estes resultados sugerem que os ésteres gordos de floridzina têm potenciais efeitos quimioterapêuticos mediadas através da expressão atenuada de várias proteínas-chave envolvidas na regulação do ciclo celular, as topoisomerases de ADN IIα actividade e mecanismos epigenética seguido de paragem do ciclo celular e apoptose
citação.: Nair SVG, Ziaullah, Rupasinghe HPV (2014) de ácidos graxos Ésteres de phloridzin induzir a apoptose de células cancerígenas do fígado através da expressão gene alterado. PLoS ONE 9 (9): e107149. doi: 10.1371 /journal.pone.0107149
editor: Gnanasekar Munirathinam, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América
Recebido: 21 de março, 2014; Aceito: 12 de agosto de 2014; Publicação: 17 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Nair et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento: HPVR:. Descoberta programa Grant das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho (NSERC; Grant número 327056; https://www.nserc-crsng.gc.ca) de (; Grant número 192020; https://www.acoa-apeca.gc.ca ACOA) o programa Atlantic Inovação fundos (FIA) da Agência de Oportunidades do Canadá Atlântico Canadá e. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o carcinoma hepatocelular (HCC), a forma mais comum de câncer de fígado, representam o quinto tumor maligno no mundo e terceira causa de mortalidade entre a morte relacionada com câncer [1]. No Canadá, a incidência de HCC tem vindo a aumentar ao longo dos últimos várias décadas [2]. HCC é responsável por 71,9% dos casos de câncer de fígado em homens e mulheres no Canadá. De acordo com a Canadian Cancer Statistics, em 2013, a taxa de incidência de câncer de fígado no Canadá aumentou em 3,6% ao ano, ea taxa de mortalidade aumentou em 2,2% ao ano. Os fatores que contribuem para HCC incluem contato com hepatocarcinogens especialmente aflatoxina [3], hepática infecção e fígado viral cirrose [4]. Os potenciais opções de tratamento curativos são ressecção cirúrgica, transplante de fígado, e ablação ou embolização transarterial [1]. A quimioterapia, sorafenib inibidor multiquinase oral (Nexavar) é a droga mais utilizada para o tratamento HCC mas o ganho na sobrevida é modesto [5]. Indisponibilidade de tratamentos eficazes e alta taxa de prevalência tem levado à busca de novas abordagens adequadas para prevenção e tratamento de câncer de fígado. Como resultado, muitos fitoquímicos têm sido explorados como potenciais agentes quimiopreventivos que podem reverter ou suprimir a progressão hepatocarcinogénico.
Os flavonóides, uma das principais classes de polifenóis, têm mostrado algumas propriedades quimiopreventivos contra HCC em um vasto número de na vitro [6], [7] e em estudos in vivo [1], [8]. Phloridzin (florizina floretina ou 2 ‘-
O
-glucoside), um di-hidrocalcona, é um dos principais fenólicos glucósidos flavonóides encontrados na maçã [9]. A principal acção farmacológica do phloridzin é a inibição da glicose ligada transportadores dependentes de sódio (SGLT1 e SGLT2) que bloqueia a absorção de glicose intestinal e produzir glicosúria renal [9]. Em adição às suas propriedades anti-diabético, floridzina tem outras actividades biológicas, tais como a inibição da peroxidação lipídica [10], a prevenção da perda óssea em ratos [11] e melhoramento da memória em ratos [12]. Phloridzin estimular a melanogénese por aumento da expressão do gene da tirosinase através da via de sinalização de cAMP [13]. Floretina, a aglicona da floridzina, tem sido relatado como tendo actividade antioxidante potente na eliminação de peroxinitrito e a inibição da peroxidação lipídica [14]. A glicosilação em 2-OH diminuiu as actividades antioxidantes dos floridzina por 18 vezes em comparação com a floretina [14]. Phloretin nas concentrações de 100 uM aumentada relacionada com o TNFa ligando indutor de apoptose (TRAIL) induzida por apoptose e a citotoxicidade em células de cancro de próstata LNCaP [15]. No entanto, não há nenhum relatório sobre o câncer efeito quimiopreventivo de phloridzin. Num estudo de polifenóis maçã actividade antitumoral, floridzina não afectou a proliferação de qualquer das células transplantadas de melanoma B16 de rato ou células de tumor mamário de ratinho Balb-MC.E12 [16].
No nosso laboratório, foi floridzina regiosselectivamente acilados com uma série de cadeia longa, saturados, ácidos gordos, mono- e poli-insaturados usando imobilizada da lipase B, a partir de
Cândida antárctica
(Novozyme 435) [17]. Lipase catalisada esterificação e transesterificação de glicosidos flavonóides foram relatados para aumentar a lipofilicidade e melhorado efeito anti-cancro do composto progenitor [18]. Portanto, no presente estudo, investigámos o potencial citotóxico de ésteres de ácidos gordos de floridzina na proliferação de células de tumores sólidos tais como células de carcinoma hepatocelular HepG2 e células de adenocarcinoma da mama MDA-MB-231, bem como células de leucemia aguda monócitos THP-1. Hepatócitos humanos normais HP-F e hepatócitos de rato RTCP10 também foram utilizadas para determinar a especificidade dos ésteres em células cancerosas. Esta é a primeira vez que estes ésteres de ácidos gordos de novos floridzina foram testados para o efeito anti-proliferativo de células cancerosas. Além disso para elucidar os mecanismos celulares e moleculares de ésteres de ácidos gordos de floridzina em células HepG2, as topoisomerases de ADN actividade IIα, paragem do ciclo celular, permeabilidade da membrana mitocondrial, a actividade da caspase 3 e processos apoptóticos associados também foram investigados. Além disso, analisamos o efeito do éster decosahexaenoic ácido (DHA) de phloridzin na expressão de 84 genes que os objectivos de terapias anticâncer e desenvolvimento de medicamentos. Nossos resultados fornecidos evidência experimental para apoiar uma investigação mais aprofundada de ésteres de ácidos gordos de phloridzin especialmente DHA éster de phloridzin como um candidato quimioterápico eficaz e segura.
Materiais e Métodos
compostos
Teste e produtos químicos
ésteres de ácidos gordos de phloridzin (Pz) viz. éster de ácido esteárico de Pz (ácido Pz-esteárico), éster do ácido oleico de Pz (ácido Pz-oleico), éster de ácido linoleico de Pz (ácido Pz-linoleico), éster de ácido α-linolénico de Pz (PZ-α-linolénico ), éster de DHA de Pz (PZ-DHA) e éster de ácido eicosapentaenóico (EPA) de Pz (PZ-EPA) foram sintetizados no nosso laboratório, como descrito anteriormente [17].
floridzina, a floretina, a caspase 3 colorimétrico kit de ensaio, iodeto de propídio, os ácidos gordos ácido oleico, ou seja, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico-α, EPA e DHA foram adquiridos da Sigma-Aldrich Canadá. Celular Titer 96 Aqueous ensaio de uma solução a proliferação celular (MTS), CytoTox 96 citotoxicidade não radioactivo (LDH) e de ensaio CellTiter-Glo luminescentes kits de ensaio foram adquiridos a partir de Promega, Madison, WI, EUA. Estéril dimetilsulfóxido (DMSO) (ATCC), kit de detecção de apoptose /necrose certificada-GFP para microscopia de Enzo Life Sciences, Brockville, ON, Canadá; ApoTarget rápida apoptose DNA kit de detecção de Escada de Invitrogen, Burlington, ON, Canadá; DCFDA-Cellular reativa forma de kit ensaio de detecção Oxygen Species Abcam, Toronto, ON, Canada; e 5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC-1) a partir de Cayman Chemicals, Burlington, ON, Canadá foram também usados para o estudo.
as linhas de células e condições de cultura
células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e as células THP-1 de leucemia monocítica aguda foram compradas na American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA (número de certificado Dalhousie Universidade de Segurança Biológica utilização de linhas de células é de 2013-10). As células HepG2 foram cultivadas em meio de Eagle modificado mínimo essencial (EMEM) suplementado com 10% de FBS (ATCC) e 1% de penicilina-estreptomicina (ATCC). As células THP-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado mM de 2-mercaptoetanol e 10% de soro fetal de bovino a 0,05 a uma concentração final de 10%. MDA-MB-231 de cancro da mama (ATCC HTB-26) foram obtidas a partir de Cedarlane, Berlington, ON, Canadá) e foram mantidas em meio DMEM (Sigma-Aldrich Canadá) suplementado com 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina , 2 mM de L-glutamina, HEPES 5 mM (pH 7,4) e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá). Criopreservadas hepatócitos humanos normais (HP-F), chapeamento de meio de manutenção de hepatócitos médio e hepatócitos foram adquiridos de Bio-Zen, Investigação Tiangle Park, NC, EUA. hepatócitos humanos normais plaqueadas em 96 placas de cultura de colagénio 1 célula poços revestidas (Life Technologies) e mantidas em meio de manutenção de hepatócitos durante 24 h para permitir a recuperação das células e do acessório. hepatócitos de rato (RTCP10), meios de descongelamento e meios de incubação foram adquiridos da Life Technologies. hepatócitos de rato foram cultivadas em colágeno 1 revestidas placas de 96 poços (Life Technologies, Burlington, ON, Canadá) usando a mídia descongelamento e mantidos em meio de incubação. Todos os tipos de células foram mantidas a 37 ° C num incubador sob 5% de CO
2/95% de ar a uma humidade constante.
As células foram contadas utilizando um hemocitómetro (Bright-Linha hemocitómetro, Sigma-Aldrich Canadá) e foram plaqueadas de acordo com o número de células para cada experimento em 6, 24 ou formato de 96 poços, durante 24 h antes da adição de amostras de teste. Todas as amostras de teste foram solubilizados em DMSO filtrada esterilizada ( 0,5% no meio de cultura) antes da adição ao meio de cultura. As células de controlo foram também executados em paralelo e sujeito às mesmas alterações em meios com 0,5% de DMSO
celular Ensaio de Proliferação
A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTS.. Em, células HepG2 breves (5 × 10
3 células /100 uL /poço), MDA-MB-231 (5 × 10
3 células /100 uL /poço), THP-1 (25 × 10
3/100 ul /poço), os hepatócitos humanos e de ratos normais (1 × 10
4 células /100 uL /poço) foram plaqueadas em triplicado, em placas de cultura de 96 um tecido de fundo plano estéreis bem. Após 24 h de incubação, ésteres gordos floridzina, floridzina, a floretina, foram preparados os ácidos gordos livres dos respectivos ésteres ou sorafenib em meio e 100 uL de cada tratamento foi adicionada a cada poço, em cada tratamento três repetições. Deste modo, as células foram expostas a várias concentrações (0,1, 1, 10, 25, 50, 75, 100 uM) de cada tratamento. Os controlos consistem de células com meio contendo DMSO ( 0,5%), ensaio em branco poços continha o composto teste em meio sem células e poços brancos continham meios sem células. Decorridas mais 3, 6, 12, 18 ou 24 h, 20 uL do reagente de MTS em combinação com o agente de acoplamento electrónico, metosulfato de fenazina foram adicionados aos poços e as células foram incubadas num incubador humidif içado, durante 3 h. A absorvância a 490 nm (OD490) foi medida utilizando um leitor de microplacas Flurostar Optima (BMG Labtech, Cary, NC, EUA) para se obter o número de células viáveis em relação à população de controlo. Percentagem de viabilidade das células tratadas composto teste são expressos como uma percentagem em comparação com o controlo ( 0,5% de DMSO). CE
50 valores (concentração requerida para reduzir a viabilidade das células em 50% em comparação com células de controlo) para cada composto de ensaio foi analisada utilizando o software Graphpad Prism, La Jolla, CA, EUA. O índice selectivo (SI) do ácido gordo de ésteres de floridzina é definida como a proporção de citotoxicidade (CE
50 valores) em células normais HP-F para o cancro sólido HepG2, as células MDA-MB-231 (SI = CE
50 em células HP-F /CE
50 em células de câncer sólidos). As amostras com SI valores maiores que três foram considerados como tendo alta seletividade para células cancerosas.
Ensaio de citotoxicidade
lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima citosólica estável, que é liberado após dano à membrana em apoptótica /células necróticas. A actividade da LDH foi medida utilizando CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI, EUA), em que a LDH libertada no sobrenadante da cultura é medida com um ensaio enzimático acoplado, resultando em conversão de um sal de tetrazólio num produto de formazano vermelho. As células HepG2 (5000/100 uL /poço) foram semeadas e tratadas com 100 uM de ésteres de ácidos gordos, floridzina floridzina, a floretina, ácidos gordos livres dos respectivos ésteres ou sorafenib preparadas em meio livre de soro e incubadas (37 ° C, 5% de CO
2) durante 6 h. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido para uma placa de ensaio, e a LDH libertada a partir das células em meio de cultura foi medido. A libertação máxima foi obtida após o tratamento de células de controlo com 1% de Triton X-100 durante 30 min à temperatura ambiente. A /percentagem necrótico apoptótica foi expresso utilizando a fórmula: (valor da amostra /libertação máxima) × 100%. Estudos anteriores realizados pelo fornecedor tinha claramente que em células HepG2, a actividade da LDH concentração máxima é de 1 a 6 h, porque as incubações actividade LDH libertada a partir de células tem uma meia-vida de cerca de 9 h [19]. MTS resultados do ensaio mostraram que todos os ésteres de ácidos gordos de floridzina inibidas 70-80% a proliferação celular em 6 h, por conseguinte, analisamos a actividade de LDH após 6 horas de incubação.
observação morfológica da apoptose em células HepG2
2.5.1. observação morfológica sob microscópio invertido de contraste de fase.
células HepG2 foram igualmente semeadas em 24 cavidades de cultura de tecidos tratados placas planas inferior (BD Biosciences), e, em seguida, tratada com 100 uM de ésteres de ácidos gordos de floridzina, floridzina, a floretina , sorafenib e DMSO ( 0,5%) de controlo. Após 24 h de tratamento, foi observada a morfologia das células HepG2 sob um microscópio de contraste de fase invertida (Nikon Eclipse E 100, Nikon, Mississauga, ON, Canadá) e foram capturados em aumento de 400X usando Infinito câmera microscópio digital (Lumenera corporação, Ottawa, ON, Canadá).
2.5.2. Determinação da apoptose /necrose por microscopia de fluorescência.
células HepG2 foram semeadas em Nunc Lab-Tek dois slides câmara (Sigma-Aldrich Canadá) a uma densidade de 1 × 10
6 células /câmara. As células fixadas foram então tratadas ou com ésteres de ácidos gordos de 100 um de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib ou veículo DMSO (como controlo) durante 24 h. As lâminas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato diluída. Após a remoção da câmara, cada lâmina foi adicionada com 50 mL de Reagente de Detecção dupla contendo o reagente de detecção de apoptose (anexina V-EnzoGold) e reagente de detecção de necrose (7-AAD) em 1X tampão de ligação. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min no escuro. Após a coloração, as células foram lavadas com tampão de ligação e coberta com uma lamela de vidro. As células coradas foram observadas sob uma fluorescência Zeiss Axiovert 200 m microscópio invertido (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canada) com uma ampliação de × 40 com um conjunto de filtros para a Anexina V-EnzoGold (Ex /Em: 550/570 nm) e 7 -Aad (Ex /em: 546/647 nm).
Análise da apoptose por ADN a fragmentação
HepG2 (1 × 10
5) As células foram semeadas em placas de cultura de 24 poços e foram autorizados a aderir durante a noite. Após isto, as células foram tratadas com ambos os ésteres de ácidos gordos de 100 um de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib ou veículo DMSO (como controlo). As placas foram re-incubadas durante mais 24 h. fragmentação do ADN foi detectada utilizando ApoTarget Breve apoptótica DNA Ladder Detection Kit (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) de acordo com o protocolo do fabricante. O princípio envolve a detecção dos fragmentos de ADN internucleosomal formados durante a apoptose. Resumidamente, as células mortas e as células aderentes foram tripsinizadas flutuante recolhido e centrifugado a 1000 rpm durante 10 min. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato diluída, as células foram lisadas com tampão de lise de 35 ul de TE (um componente do kit). Para o lisado, foram adicionados 5 uL de enzima A (um componente do kit) e incubou-se a 37 ° C durante 10 min. Depois, 5 uL da enzima B (um componente do kit) foi adicionado, misturado suavemente e incubado a 50 ° C durante 30 min. O DNA foi precipitado com acetato de amónio e etanol absoluto a -20 ° C. Após centrifugação (10 min a 12000 rpm) e secagem ao ar, o sedimento de DNA foi dissolvido em 30 ul de tampão de suspensão de ADN. Para detectar a escada de DNA, as amostras de DNA extraídas foram corridos num gel de agarose a 1,2% contendo 0,5 ug /mL de gel vermelho em Tris-Borato-EDTA (TBE) de tampão. Após a electroforese, o gel de imagem foi capturada usando Gel Doc sistema 100 (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canadá).
Ensaio de Caspase-3 Actividade
A actividade do enzima de caspase 3 foi medido utilizando caspase 3 estojo de ensaio colorimétrico adquiridos da Sigma-Aldrich. As células HepG2 (2 × 10
6 células /poço) cultivadas em placas de 6 poços, foram tratados quer com 100? M ésteres de ácidos gordos de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib ou veículo DMSO (como controlo). As células foram lisadas e o teor de proteína de lisado celular foi quantificado pelo ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Ottawa, ON, Canadá). a actividade da caspase-3 foi medida em 200 ug de lisado celular utilizando o substrato peptídico específico-caspase, DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), conjugado com repórter de p-nitroanilina (ρ-NA) moléculas. A clivagem de caspase por este péptido liberta o cromóforo que é medido colorimetricamente a um comprimento de onda de 405 nm como descrito no protocolo do fornecedor.
Análise do Ciclo Celular
células HepG2 foram colocadas em placa a 5 x 10
5 células por ml numa placa de seis poços. Após 24 h de incubação (37 ° C, 5% de CO
2), as células foram tratadas com 100 uM ésteres de ácidos gordos de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib ou DMSO ( 0,5%) Controlo preparadas nos meios e incubadas durante mais 24 h. Após tripsinização, as células foram lavadas e centrifugadas a 2000 x g durante 10 min e o sedimento ressuspenso em 0,5 mL de PBS. A fixação foi terminada por adição de 1,2 ml de etanol frio a 70% durante 2 h. As células fixadas foram lavadas com PBS e centrifugada a 2000 × g durante 10 min. Após as células em 0,3 mL de PBS suspensão, 8 ul de ADNase ARNase livre foi adicionado (10 mg /mL) e incubou-se durante 1 h. Após a adição, a 15 ul de iodeto de propídio (0,5 mg /ml), as células foram incubadas em 4 ° C durante 30 min. As células foram analisadas por ciclo celular usando citometria de fluxo FACS Calibur (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA) com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão a 670 nm. conteúdo de DNA foi determinada por ModFit software (Verity Software House, Topsham, ME, EUA), que forneceu os histogramas para avaliar a distribuição do ciclo celular.
mitocondrial metabolismo energético Ensaios
ensaio de nível ATP.
os níveis de ATP celular foram medidos com o kit de ensaio luminescente CellTiter-Glo obtido da Promega de acordo com as instruções do fabricante. As células HepG2 plaqueadas em um preto paredes placa de 96 poços de fundo claro foram incubadas com ésteres de ácidos gordos de 100 um de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib, ácidos gordos livres ou DMSO ( 0,5%) em meio de controlo. Após 24 h, CellTiter-Glo Reagente igual ao volume do meio de cultura de células presentes em cada poço, e misturados conteúdo durante 2 minutos num agitador orbital, para induzir lise celular. A luminescência foi gravado em Flurostar Optima leitor de microplacas (BMG Labtech) depois de incubação à temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal luminescente. O nível de ATP em uma amostra foi apresentado como percentual em relação ao controle sem tratamento.
potencial de membrana mitocondrial (MMP).
células HepG2 foram semeadas em um preto com paredes claras 96 poços de fundo estéril plana placas de cultura de tecido de fundo (BD Biosciences, EUA) a uma densidade de 5 x 10
4 células /poço (100 ul) e incubou-se em um de CO
2 incubadora durante 24 h a 37 ° C. As células foram tratadas com ésteres de ácidos gordos de 100 um de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib, ácidos gordos livres ou DMSO ( 0,5%) de controle preparados em meio e incubadas por 24 h. A solução de coloração de JC-1 foi preparado com PBS e 5 uM foi adicionada a cada poço. As células foram adicionalmente incubadas numa CO
2 incubadora a 37 ° C durante 1 h. Depois de lavar a placa duas vezes com PBS, a fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas Fluostar Optima (BMG Labtech) a 535 nm para o JC-1 monómeros e a 590 nm para o JC-1 agregados.
topoisomerase I humana IIα ( Topo IIα) actividade catalítica
A actividade catalítica topo IIα foi monitorizada por meio de electroforese usando a topoisomerase II kit de rastreio de drogas (TopoGEN, Inc., Columbus, OH, EUA). Resumidamente, 20 uL das misturas de reacção continham 0,5 M de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 1,5 M, MgCl 100 mM de
2, ATP 20 mM, BSA a 300 jig /mL e 5 mM de ditiotreitol. ADN super-enrolado (ADN pHOT1), super-enrolado fornecido com o kit foi determinada como sendo ideal para este ensaio porque é pequeno e fácil de manusear e tem um grande número de elementos de reconhecimento do topo IIα. Depois de 2 ul (0,25 ug) de ADN pHOT1 foi adicionado, seguido pela adição de 100 uM ésteres de ácidos gordos de floridzina, floridzina, a floretina, sorafenib ou DMSO ( 0,5%) Controlo no solvente, a reacção foi iniciada pela adição de 4 unidades (2 ul) de DNA humano IIα topo e realizada a 37 ° C durante 30 min. A reacção foi terminada pela adição de 2 ul de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS), seguido de digestão com 2 ul de proteinase K (50 ug /ml) a 37 ° C durante 15 minutos para degradar a enzima. Após a adição de 2 ul de tampão de carregamento (0,25% de azul de bromofenol e glicerol a 50%) foi adicionado à mistura, as amostras foram carregadas em gel de agarose a 1%. A electroforese foi conduzida a 66 V (2 V /cm) durante 5 h em tampão TBE usando Biorad electroforética Sistema de gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). ADN super-enrolado (ADN pHOT1) e ADN relaxado foram incluídos na electroforese como marcadores para executar a topologia do ADN. Os géis foram depois corados em 0,5 ug /mL de gel de vermelho na TBE durante 30 minutos e descorados durante 15 minutos em água destilada antes da aquisição de imagem digital utilizando Gel Doc sistema 100 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).
Uma unidade de actividade de topoisomerase II foi definida como a quantidade mínima de enzima necessária para se obter o relaxamento completo de 0,5 mg de ADN pHOT1 superhelical em 30 min a 37 ° C. A inibição da actividade de relaxamento da topoisomerase II foi investigado através do mesmo procedimento utilizando quatro unidades de enzima e 100 uM compostos de teste. A percentagem de inibição foi calculada pela seguinte fórmula: em que S
controle é a percentagem de ADN super-enrolado na pista de controlo (sem compostos enzimáticos e de teste), S
0 é a percentagem de ADN super-enrolado na pista sem compostos de teste e S é a percentagem de ADN super-enrolado na pista, com os compostos de teste e enzima.
análise Tempo real de RT-PCR
perfis de expressão de genes foram obtidos a partir de células HepG2 tratadas com ésteres de DHA floridzina ou sorafenib ou a células de controlo tratadas de DMSO. extracção de RNA total foi realizado usando RNA total Aro minikit (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). a concentração e a pureza do RNA foi determinada medindo a absorvância usando um NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EUA). a integridade de ARN foi avaliada por electroforese em gel de agarose formaldeído. De ARN (400 ng) foi utilizado para sintetizar ADNc utilizando RT
2 First Strand kit (SABiosciences, Frederick, MD, EUA). RT
2 matrizes RNA QC PCR (SABiosciences, Frederick, MD, EUA) foi utilizado para avaliar a qualidade das amostras de cDNA antes caracterização das metas de drogas câncer humano RT
2 profiler matriz PCR (SABiosciences, Frederick, MD, EUA). perfis dos 84 genes de expressão gênica foram investigados usando os alvos de drogas câncer humano RT
2 profiler matriz PCR (HAP-507ZD) em um Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), utilizando RT
2 em tempo real SYBR green PCR mestre mistura (SABiosciences, Frederick, MD, EUA). A matriz também tem cinco genes de referência (beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforibosiltransferase 1 (HPRT1), proteína ribossomal L13a (RPL13A), da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), e beta-actina (ACTB), três reversa controles de transcrição (RTCs), três controles de PCR positivos (PPCs) e um controlo de ADN genómico (GDC), fazendo até 96 ensaios. Após a normalização com gene de referência RPL13A, os níveis de expressão de genes foram avaliados individualmente, usando o ciclo limiar (Ct) valores usando RT
(programa baseado Excel da Microsoft de SABiosciences, Mississauga, ON, Canadá) 2 profiler PCR software de análise de dados de matriz Ele calcula: 1) ΔCt de cada gene = Ct do gene de interesse – Ct médio de referência escolhido. genes 2) ΔΔCt para cada gene em dois grupos; ΔΔCt = ΔCt (éster ou sorafenib Pz-DHA) – ΔCt (controle) 3) dobra-change para cada gene do grupo de controlo para grupo tratado éster de Pz-DHA como 2
(- ΔΔCt). RT
2 dados ARN QC PCR mostrou nenhuma contaminação do ADN genómico (Ct 35 irá indicar menos GDC) ou a presença de impurezas em amostras de ARN com base no valor de Ct de PPC (Ct deve ser de 20 ± 2 em cada matriz) e não mostraram inibição da transcrição reversa com base nos valores do Ct de RTC e PPC. A reprodutibilidade foi mantido usando três repetições biológicas a partir de três experiências individuais.
Análise estatística
CE
50 valores foram calculados utilizando Graphpad Prism 6 software (GraphPad Software Inc., San Diego CA, EUA). A análise estatística foi realizada utilizando Statistical Analysis System (SAS, versão 9.2). One-way ANOVA com comparações post hoc de Tukey, a P 0,001 foi utilizado para comparações estatísticas. Todos os dados são apresentados como um valor médio com o seu desvio padrão indicado (Média ± SD).
Resultados
Efeito antiproliferativo de ésteres de ácidos gordos de phloridzin em várias células cancerosas e normais
no presente estudo, os potenciais efeitos citotóxicos de ésteres de ácidos graxos de phloridzin, phloridzin, ácidos graxos livres e floretina, bem como medicamentos contra o câncer comerciais normais foram investigados em hepatocarcinoma humano (HepG2), adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) linhas e leucemia monocítica aguda (THP-1) celulares, hepatócitos humanos normais primárias e hepatócitos de rato usando ensaio MTS. O ensaio mostrou que os ésteres de ácidos gordos de floridzina mata HepG2, MDA-MB-231 e as células THP-1 com uma extensão semelhante e em uma dose (Figura 1) e forma dependente do tempo (Tabela 1). Após 24 h de incubação, em células HepG2, antiproliferação CE
50 para o ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido α-linolénico, EPA e DHA ésteres de floridzina foram 37,8, 31,5, 29,2, 53,1, 51,9 e 26,8 uM, respectivamente . CE
50 foram de 35,2, 37,9, 32,3, 63,8, 55,5, e 26,5 uM em células MDA-MB-231. CE
50 valores destes ésteres em células THP-1 foram 40,7, 2,1, 6,2, 35,7, 27,3, e 14,8 uM. Embora os ésteres de ácidos gordos de floridzina mostraram alta potência como agente antiproliferativo, nenhum dos ácidos molécula progenitora, floridzina e gordos individuais mostrou qualquer efeito sobre a viabilidade celular (CE
50 100? M) de HepG2, MDA-MB-231 ou THP células -1. Curiosamente, a floretina aglicona mostrou um efeito antiproliferativo significativo (CE
50 39,6 mM) em células THP-1 (Tabela 1).
carcinoma hepático (células HepG2) e hepatócitos humanos normais (HP-F) e hepatócitos de rato (células RTCP10) foram expostas aos compostos de teste a 1, 10, 50, 100 ^ M durante 24 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTS. Os dados apresentados como a percentagem de viabilidade em relação ao veículo só grupo de controlo tratado. Os dados são apresentados como a média ± SD (n = 3) são representativos de pelo menos três experiências independentes e separados. * P 0,05 significativamente diferente do veículo único grupo (HSD de Tukey, P 0,01) controlar.
Para avaliar a especificidade de ésteres de ácidos gordos de floridzina às células cancerosas, do efeito do fármaco sobre a viabilidade das células nos hepatócitos normais foi quantificado por ensaio de citotoxicidade em ambos os hepatócitos humano normal (HP-F) e de rato (RTCP10). células HP-F foram tratadas com 100 uM e concentrações mais baixas de todos os ésteres de ácidos gordos de floridzina, floridzina, ácido gordo, sorafenib e floretina, durante 24 h (Tabela 1). ésteres de ácidos gordos de floridzina não afectou a viabilidade dos hepatócitos humanos normais com CE
50 100? M e são mais específicos de linhas celulares de cancro (Tabela 1, Figura 1). No tratamento de 100 uM de ésteres de ácidos gordos de floridzina durante 24 h, ésteres de ácidos gordos de floridzina mostrou menos toxicidade ( 90% de viabilidade) em hepatócitos de rato também (Figura 1). As actividades citotóxicas mais promissoras e mais seletivos foram detectados em ésteres de Pz-DHA e Pz-EPA. Ésteres de ácidos gordos de ácido floridzina excepto Pz-esteárico (cerca de 50% de viabilidade) também mostraram muito menos actividade na inibição da viabilidade celular ( 80% de viabilidade) de hepatócitos de ratos do que a de linhas celulares de cancro. Estes resultados sugerem que os ésteres de ácidos gordos de floridzina pode ter moderado a efeitos colaterais mínimos. As actividades citotóxicas mais promissoras e mais seletivos foram detectados com éster de Pz-DHA. A CE
50 (iM) e os valores de SI de Pz-DHA em HepG2, MDA-MB-231, células THP-1 foram 51,9 (SI = 11,2), 55,5 (SI = 10,5), e 27,3 (SI = 21,38) , respectivamente (Tabela 1). DHA é um ácido gordo alimentar comum omega-3 e também possui propriedades antiproliferativas [20]. Portanto, éster Pz-DHA foi seleccionada para estudo de expressão de genes utilizando RT
matriz 2-PCR fármaco alvo humano, uma vez que mostrou o efeito citotóxico mais forte em células cancerosas e era o menos tóxico sobre as células normais em comparação com outros ésteres de ácidos gordos de floridzina