Abstract

A quercetina e 2-Metoxiestradiol (2-ME) são promissores anti-câncer substâncias. Nosso anterior

in vitro

estudo mostrou que a quercetina em sinergia com 2-Metoxiestradiol exibindo aumento antiproliferativa e da atividade pró-apoptótica em ambos os LNCaP e andrógeno-independente PC-3 linhas de células cancerosas humanas da próstata andrógeno-dependentes. No presente estudo, verificou-se se a sua combinação pode inibir LNCaP e PC-3 crescimento do tumor xenoenxerto

in vivo

e explorou o mecanismo subjacente. cancro da próstata humano LNCaP e PC-3 de células foram inoculadas por via subcutânea em camundongos machos nus BALB /c. Quando os tumores xenoenxerto atingiu cerca de 100 milímetros

3, os ratos foram alocados aleatoriamente para o controle do veículo, quercetina ou grupos individualmente tratadas e tratamento de combinação 2-Metoxiestradiol. Após a intervenção terapêutica durante 4 semanas, tratamento de combinação de quercetina e 2-ME i) o crescimento do tumor significativamente inibido de próstata xenoenxerto de câncer em 46,8% para LNCaP e 51,3% para o PC-3 em relação ao grupo de controlo do veículo, mais eficaz do que a quercetina (28,4% para LNCaP, 24,8% para o PC3) ou 2-ME (32,1% para LNCaP, 28,9% para o PC3) sozinho; ii) foi bem tolerada pelos ratinhos BALB /c e não há reacções tóxicas óbvias foram observados; iii) conduziu a um aumento /rácio Bax Bcl-2, a expressão da proteína clivada da caspase-3 e a taxa de apoptose; e iv) resultou em menor nível AKT fosforilada (pAKT) proteína, proteína do fator de crescimento endotelial vascular e expressão de mRNA, a densidade microvascular e taxa de proliferação do que o tratamento medicamentoso único. Estes efeitos foram mais notável em relação ao grupo de veículo. Portanto, combinação de quercetina e 2-ME pode servir como um romance regime de tratamento clínico possuir o potencial de melhorar efeito antitumoral sobre o câncer de próstata

in vivo

e diminuir os efeitos de doses e laterais de ambos os quercetina ou 2-me sozinho . Estes

in vivo

resultados irá estabelecer uma nova base sólida para pesquisas posteriores sobre este romance regime terapêutico no cancro da próstata humana

Citation:. Yang F, Song L, Wang H, Wang J, Xu Z, combinação de quercetina e 2-Metoxiestradiol melhora a inibição do cancro da próstata humano LNCaP e PC-3 no Crescimento do Tumor de Xenoenxerto células Xing N (2015). PLoS ONE 10 (5): e0128277. doi: 10.1371 /journal.pone.0128277

Editor do Academic: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, ITALY

Recebido: 09 de dezembro de 2014; Aceito: 23 de abril de 2015; Publicado em: 26 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. o trabalho foi apoiado por Pequim Natural Science Foundation (. sem 7.122.075)

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de mortalidade por câncer em homens, com uma estimativa de 233.000 novos casos e 29,480 mortes no Estados Unidos em 2014 [1]. Embora possa ser curada por prostatectomia radical ou radioterapia em fase inicial, a maioria dos pacientes sofrem de recorrência local e metástases à distância depois [2]. Após o tratamento eficaz de ablação de androgénios nos primeiros 1-3 anos, que geralmente se desenvolve em cancro da próstata resistente à castração (CRPC) caracterizado com elevada antigénio específico da próstata (PSA), mais elevada taxa de metástases, mais agressividade, etc [3]. Combinação de docetaxel e prednisona, a quimioterapia sistémica de primeira linha padrão para CRPC, não é curativa e só prolonga o tempo de sobrevida global por um curto período. Por outro lado, torna os pacientes sofrem de efeitos secundários graves [4]. Portanto, é de necessidade urgente de desenvolver novas terapias medicamentosas que podem superar essas deficiências trabalhando individualmente ou em combinação para CRPC.

A quercetina (3, 3 ‘, 4’, 5, 7-pentahydroxyflavone, Que), um flavonóide bioactivo abundante em vegetais e frutos, especialmente em cebolas, maçãs, chá e vinho tinto, exibiu propriedades anti-tumoral promissora em muitas células de cancro humanas, incluindo cancro da próstata, tanto in vitro como in vivo [5,6]. No entanto, devido a baixa biodisponibilidade, o seu efeito anti-tumoral tem sido restrita a uma grande extensão. A fim de ultrapassar esta deficiência, a quercetina foi combinado com outros medicamentos anti-cancro para aumentar a inibição de vários tumores, incluindo o cancro da próstata [6,7,8].

2-Metoxiestradiol (2-ME), uma derivado endógeno natural do 17β-estradiol (E2) raramente exibe actividade estrogénica, tem sido relatado para demonstrar a acção anti-cancro em uma ampla variedade de tumores [9]. Como para o cancro da próstata, 2-ME podem inibir as células cancerosas tanto andrógeno-dependente e independente de androgénios, in vitro e in vivo [10,11]. No entanto, 2-ME tem a desvantagem da acessibilidade biológica limitada e rápida degradação [12]. De modo a resolver o problema, a combinação de fármacos foi proposto e provocou aumento do efeito anti-cancro com menos efeitos colaterais em comparação com o tratamento da droga única [10,13].

Portanto, apesar de a desvantagem comum de biodisponibilidade para baixo tanto a quercetina e 2-ME, parece optimista quando eles foram combinados com outras substâncias, devido cancro tratado efeito. Anteriormente, foi realizado um uso combinado de quercetina e 2-ME em ambos os PC-3 linhas de andrógeno-dependentes LNCaP e andrógeno-independente da próstata humana de células de câncer e encontraram uma antiproliferativa sinérgica e efeito pró-apoptótica comparação com quercetina ou 2-ME sozinho [14] . O presente estudo foi investigar o efeito combinado de quercetina e 2-ME em LNCaP e PC 3-tumor xenoenxerto in vivo e estudar o mecanismo para a primeira vez.

Materiais e Métodos

Chemical reagentes

A quercetina, 2-Metoxiestradiol, hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPpCD) e carboximetilcelulose (CMC) foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). meio RPMI-1640, 0,25% de tripsina-EDTA e soro fetal de bovino foram obtidos a partir de Hyclone (Logan, UT, EUA), e foi Matrigel da BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EUA).

Linhas Celulares e Cultura celular

o cancro da próstata humano LNCaP dependente de androgénios e linhas celulares de PC-3 independente de androgénios (duas linhas celulares vulgarmente utilizados que foi usado por muitos outros investigadores [15,16,17]), obtido a partir de Pequim União Medical College, foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e colocada numa incubadora contendo 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C.

estudo animal

Todos os procedimentos experimentais relacionadas com animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação animal e ao Comité de Ética da Universidade de Medicina Capital (número de autorização: 2013-X-83). BALB /c nu masculina 4-6 semanas de idade foram fornecidos pelo Ministério de animais experimentais da University Medical Capital e mantidos em ambiente livre de patógenos, com 12 horas de luz /ciclo escuro, umidade e temperatura controlada. Os ratos foram autorizados a se acostumar com novo ambiente para uma semana antes do início do experimento.

Antes do experimento formal, in vivo, foi avaliada a toxicidade de duas drogas combinadas e veículo que iria ser administrados simultaneamente, usando dois grupos de macho ratinhos nus BALB /c (n = 5 cada). Solvente para a quercetina foi de 25% de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPpCD, w /v em DDH

2O) e de 2-Metoxiestradiol foi de 25% de HPpCD contendo 0,5% de carboximetilcelulose (CMC, w /v em DDH

2O ) [10,18]. grupo de drogas foram dadas as duas drogas, a quercetina ou seja dissolvida e 2-ME, e do grupo de controlo de veículo foram dadas dois veículos livres de drogas, ou seja, 25% de HPpCD contendo ou não contendo 0,5% de CMC. Após a operação, a reacção tóxica foi observada nos ratos de ambos os grupos representados estado mental como pobres, levemente torcer o corpo, convulsão e hematúria moderada ocasional que estavam em acordo com a descrição de Ehteda A e pode ser atribuído à elevada concentração de HPpCD [10 ]. Por esta razão, na experiência subsequente, a combinação de quercetina e 2-ME foi levada a cabo da seguinte maneira: a quercetina foi administrado no dia 1, seguido de 2-ME dada no dia 2.

Os ratinhos foram inoculados subcutaneamente com 5 × 10

5 PC-3 células suspensas em 100 � PBS e 2 × 10

8 células LNCaP suspensas em 100 de matrigel e mistura PBS (1: 1) na parte traseira direita. Quando os tumores de xenoenxerto atingiram um volume de cerca de 100 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n = 8 cada grupo) e tratados por via intraperitoneal. esquema terapêutico com base em nossos resultados in vitro, experiências preliminares e estudos de muitos outros dos pesquisadores foi o seguinte: (1) grupo controle Transporte: Veículo da quercetina no dia 1, veículo de 2-ME no dia 2, (2) grupo tratado quercetina : 75mg quercetina /kg no dia 1, veículo de 2-ME no dia 2, o grupo (3) 2-ME tratados: veículo da quercetina no dia 1, 2-ME 150mg /kg no dia 2, (4) grupo de tratamento de combinação : quercetina 75mg /kg no dia 1, 2-ME a 150 mg /kg no dia 2. dois dias era um ciclo de tratamento e durante todo o processo de tratamento durou 4 semanas [13,19,20,21,22,23]. Os tamanhos dos tumores foram calculados foram monitorizados a cada 2 dias, utilizando compasso de calibre e o volume do tumor de acordo com a fórmula: L S ×

2 × 0,5, em que L representa o diâmetro maior e S representa o diâmetro menor de tumores [10]. Os ratinhos foram pesados ​​bem. No final do procedimento de tratamento, no dia 29, os ratinhos foram anestesiados com hidrato de cloral e sacrificados por deslocamento cervical. tumores de xenoenxerto foram rapidamente retirados e pesados. Uma parte dela foi colocada em azoto líquido imediatamente para análise biomarcador futuro ea outra parte foi fixada em formalina a 10% tamponada neutra para análise imuno-histoquímica. parâmetros bioquímicos do soro, como ALT, AST, creatinina e azoto da ureia que refletiram a toxicidade dos medicamentos também foram detectados.

análise de Western blot

Os tecidos tumorais foram misturados com RIPA tampão de lise (Applygen Inc., Pequim , China) contendo mistura de inibidores de protease (Roche, Suíça). Os lisados ​​foram centrifugados e o sobrenadante foi recolhido. Após quantificada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, EUA), 80 ug de proteína foi separada por 6% -12% de SDS-PAGE e transferidos para fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana (Pall, Nova Iorque, EUA), que foi então bloqueada pela 5% de leite desnatado e incubadas com anticorpos primários: Bcl-2 (1: 1000, Cell Signaling, Beverly, MA), Bax (1: 1000, Cell Signaling), caspase-3 (1: 1000, Cell Signaling), AKT e pAKT (1: 1000, Cell Signaling), VEGF (1: 500, Abcam) a 4 ° C durante a noite, GAPDH (1: 10000, Sigma) à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de peroxidase de rábano conjugada com anticorpos secundários (1: 2000, Cell Signaling) incubação durante mais 1 hora à temperatura ambiente. As bandas de complexos antigénio-anticorpo foram detectados por quimioluminescência aumentada kit (ECL-Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA). GAPDH foi usada como controlo de carga.

reversa tempo real de reacção em cadeia da polimerase de transcrição-quantitativa (RT-qPCR)

O ARN total de tecido de tumor foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA) e primeiro -Strand ADNc foi sintetizado utilizando transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Alemanha) com oligo (dT) iniciadores. As sequências de VEGF e iniciadores de p-actina foram como se segue: O VEGF humano: Para a frente: 5′-TCTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ‘, reverso: 5′-GATGATTCTGCCC TCCTCCTT-3’. β-actina: Para a frente: 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3 ‘, reverso: 5′-GTGGCCAT CTCTTGCTCGAA-3’. A precisão dos produtos de PCR foi verificada por sequenciação de ADN.

20 ul total da mistura de reacção consistiu em 10 ul de SYBR verde mistura de PCR Master (Applied Biosystems), 8 uL DDH

2O, 1 ul de ADNc molde e os iniciadores 1 ul reagiu seguindo as condições de ciclos térmicos: um ciclo a 50 ° C durante 2 minutos, seguido por 95 ° C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos e 60 ° C durante 1 minuto, cada amostra foi em triplicado (VIIa 7 Tempo real PCR System, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). nível de mRNA de VEGF foi calculada de acordo com a 2

-. método (ΔΔCt) e, em seguida normalizada para p-actina expressão

Imunohistoquímica

Os tecidos tumorais foram primeiramente fixados em formalina a 10% tamponada neutra . Depois de parafina foi removida utilizando xileno série, as lâminas foram re-hidratadas com uma série de etanol e incubou-se com 3% H

2O

2, a fim de eliminar a actividade da peroxidase endógena. Após a recuperação de antigénios, as lâminas foram incubadas com anticorpo primário CD31 (01:50, Abcam), CD34 (1: 100, Abcam), caspase-3 (1: 500, Cell Signaling) e Ki67 (1: 500, Abcam) a 4 ° C durante a noite. As secções foram lavadas com PBS 3 vezes e incubadas com anticorpo conjugado com peroxidase de rábano-secundário (1: 100, Cell Signaling) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os sinais foram visualizados por reacção diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina. Número de CD31, CD34 vasos corados e caspase-3, as células positivas Ki67 foram analisados ​​a partir de 3 campos de alta potência aleatórios de cada lâmina. Seções com anticorpo primário ausente e a mesma concentração de anticorpo secundário serviu como controle negativo.

A análise estatística

Os dados da experiência foram expressos como média ± SD. SPSS 17.0 e 10.0 Sigma Plot foram usadas para análise estatística e trama. As comparações entre os grupos tratados e controle do veículo foram realizadas utilizando independente de amostras teste t. Valor P 0,05 foi considerado para ser significativamente diferente.

Resultados

combinação de quercetina e 2-ME aumento da inibição de xenotransplante de cancro da próstata crescimento do tumor

Homem camundongos BALB /c nu com PC células -3 e LNCaP tumores de xenoenxerto foram tratados com veículo, Que ou 2-ME e a sua combinação e o procedimento durou 4 semanas. Quando os tumores foram retirados, era óbvio que ambos os tumores de xenoenxerto PC-3 e LNCaP em Que ou grupo de tratamento 2-ME foram menores do que o controle, e a inibição foi mais notável na Que e 2-ME grupo co-tratamento (Figuras 1A e 2A). tumores de xenoenxertos PC-3 em Que, 2-ME e terapia de combinação grupos foram inibidas em 24,8%, 28,9% e 51,3% respectivamente, em comparação com o controlo de veículo (Fig 1B e 1C), e para LNCaP, a taxa de inibição foi de 28,4%, 32,1 % e 46,8%, respectivamente (Figura 2B e 2C). Durante todo o processo de intervenção, Que, 2-ME e suas combinações foram bem tolerados por ratinhos com a dose seleccionada, a perda de peso nos três grupos de tratamento não foi significativamente diferente do controlo (Figs 1D e 2D). Não houve diferença na alimentação diária e o consumo de água entre os grupos bem. Outra reação tóxica relacionada com drogas e veículos como estado de metal pobre, não foram observadas hematúria. Diferenças significativas não foram encontradas nos parâmetros bioquímicos séricos, como ALT, AST, creatinina e azoto da ureia que refletem a toxicidade dos medicamentos no fígado e rim entre antes e depois do tratamento.

(A) PC-3 tumores de xenoenxerto foram menores nos que ou 2-ME grupo de tratamento do que o controle do veículo, e a inibição foi mais notável na que e grupo 2-ME co-tratamento. O peso do tumor (B) e o volume do tumor (C) foram significativamente reduzidos pela terapia de combinação, mais óbvio do que Que ou 2-ME sozinho. Não houve diferença significativa no peso entre os grupos de rato (D). Os dados estão representados como médias ± DP. * P 0,05 comparado com o controle, # P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo 2-ME tratada

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(a) tumores LNCaP xenoenxerto foram menores em que ou 2-ME grupo de tratamento do que o controle do veículo, e a inibição foi mais notável no grupo de tratamento de combinação. Que e 2-ME terapia combinada peso do tumor reduzida (B) e o volume do tumor (C) muito, mais eficaz do que Que ou 2-ME sozinho. Não foi observada influência significativa no peso do rato entre os grupos (D). Os dados estão representados como médias ± DP. * P 0,05 comparado com o controle, # P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo 2-ME tratada

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Efeito da quercetina com 2-ME tratamento de combinação em Bax e expressão da proteína Bcl-2

Western blot mostrou que a combinação dos that e 2-ME reforçada indução de apoptose através da regulação de proteínas pró-apoptótica Bax e anti-apoptótica expressão de proteína Bcl-2. Como mostra a Figura 3A, Bax e aumentada de Bcl-2 diminuiu nos grupos individuais ou combinados tratados com o fármaco de ambos LNCaP tecidos tumorais de xenoenxertos PC-3 e. Efeito da apoptose induzida foi determinada pela proporção de Bax /Bcl-2, a qual foi aumentada em Que ou 2-ME grupo tratado em comparação com o controlo, e a terapia combinada levou a um aumento adicional (Fig 3B e 3C).

(A) Western blot detectado Bax e expressão da proteína Bcl-2. (B, C) rácio Bax /Bcl-2 foi representado como médias ± DP (média em triplicado). * P 0,05 comparado com o controlo não tratado, # P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo 2-me tratado

Efeito da quercetina com 2-ME tratamento de combinação da proporção de caspase-3 /caspase-3

Efeito da quercetina e 2-ME em relação clivada da caspase-3 /caspase-3 foi determinada por western blot. Como mostrado na Fig 4A e 4B, clivado rácio de caspase-3 /caspase-3 elevados em quercetina ou tecido de tumor PC-3 2-me tratado e este efeito foi mais evidente no grupo de co-tratamento. O mesmo fenómeno foi observado em tecido tumoral LNCaP (Fig 4A e 4C).

(A) transferência de Western detectou proteína clivada expressão da caspase-3 e caspase-3. (B, C) Clivada rácio de caspase-3 /caspase-3 foi representada como médias ± DP (média em triplicado). * P 0,05 comparado com o controlo não tratado, # P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo 2-me tratado

Efeito da quercetina com 2-ME tratamento de combinação sobre a proliferação do tumor (Ki67) e apoptose

a análise imunohistoquímica (caspase-3)

mostrou que a taxa de proliferação de PC-3 e LNCaP tumor de tecido foram reduzidas em 36,2 % e 44,5% respectivamente nos grupos de co-tratamento, em comparação com o controlo (p 0,05 e 0,01, respectivamente), mais evidente do que a quercetina (22,6% para PC-3, 27,3% para LNCaP) e 2-ME (26,7% para PC-3 , 32% de LNCaP) sozinho (Figura 5A-5C). Enquanto quercetina ou 2-ME tratamento único em grande parte o aumento da caspase-3 células positivas (quercetina: 1,35 vezes para o PC-3, 1,77 vezes para LNCaP 2-ME:. 1,8 vezes para PC-3, 1,95 vezes para LNCaP, em comparação com o controle) , co-tratamento resultou em mais caspase-3 de células positivas (2,43 dobragem para PC-3, 2,56 de dobragem para LNCaP, em comparação com o controlo) (p 0,01) (Figura 5D-5F). Estes resultados indicaram que a quercetina combinado com 2-ME inibiu a proliferação e promoveu a apoptose de ambos PC-3 e LNCaP de tumores do tecido para um grau maior.

(A, D) de detecção imuno-histoquímica mostrou Ki67 e caspase-3 células positivas em ambos os PC-3 e LNCaP de tumor de xenoenxerto. Número de Ki67 (B, C) e caspase-3 (E, F) células positivas foram representados como meios ± SD, o número era de três altos campos movidos aleatórios por lâmina (microscopia de luz, hpf, 400 ×). * P 0,05 em relação ao controle, # P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo 2-ME tratada

.

Efeito da quercetina com 2-ME tratamento de combinação de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /via de sinalização AKT

Western blot revelaram que não houve diferença significativa na expressão da proteína AKT entre os grupos em ambos os PC-3 e LNCaP tecido tumoral do xenoenxerto (figura 6A, 6D e 6E). Considerando que, a proteína pAKT foi recusado muito em grupos de monoterapia em relação ao grupo tratado com veículo e a inibição foi muito mais notável em quercetina e 2-ME combinação grupo tratado (Fig 6A-6C).

(A) pAKT e a expressão da proteína AKT foram analisados ​​por western blot. Valores de pAKT (B, C) e AKT (D, E) foram representados como médias ± DP (valores de três experiências independentes). * P 0,05 comparado com o controlo não tratado, # P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo 2-me tratado

Efeito da quercetina e 2-ME tratamento combinado na proteína VEGF e a expressão de ARNm

a partir da Figura 7A-7C, ele pode ser visto que a combinação de quercetina e 2-ME significativamente reduzida expressão da proteína VEGF em comparação com tratamento individual, o qual, por sua vez exibiam uma inibição mais forte do que o controlo de veículo. Como para o ARNm de VEGF, Q-PCR mostrou um nível mais baixo em grupos de terapia individuais do que o controlo, e o efeito de supressão foi ainda reforçada no grupo co-tratamento em todos em PC-3 ou tecidos tumorais LNCaP (p 0,01) (Figura 7D e 7E ).

proteína de VEGF (A) e (expressão de ARNm de D, e) foram analisados ​​por western blot e por PCR quantitativo em tempo real. Os valores de proteína VEGF (B, C) e ARNm (D, E) foram representados como médias ± DP (valores de três experiências independentes). * P 0,05 comparado com o controlo não tratado, # P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 indica uma diferença significativa entre o grupo de tratamento combinação e grupo 2-me tratado

efeito da quercetina com 2-ME tratamento de combinação de densidade de microvasos

efeito de inibição sobre a densidade de microvasos representado por CD31 e CD34 no tecido tumoral PC-3 e LNCaP xenotransplante de quercetina e 2-ME foi investigada por imuno-histoquímica. Em tecidos de PC-3 de tumor, o tratamento combinado, resultou numa diminuição notável de CD31 e CD34 (60,87% e 56,1%, respectivamente) expressão em comparação com o grupo tratado com veículo (P 0,01), enquanto a taxa de redução foram 26,09% para CD31, 39.02 % para CD34 em quercetina grupo e 43,38% aplicado para CD31, 36.59% para o CD34 em 2-ME grupo utilizado (Fig 8A, 8B, 8D e 8E). Em tecidos tumorais LNCaP, CD31 e CD34 foram diminuiu em 50% e 49.09%, respectivamente, no grupo de tratamento de combinação em comparação com o controlo de veículo (P 0,01), e, ao mesmo tempo, a quercetina ou 2-me sozinho também provocada regulação negativa de CD31 e CD34 (quercetina: 27,45% para o CD31, 30% para CD34 2-ME:. 29,41% para CD31, 32,73% para CD34). (Fig 8A, 8C, 8D e 8F)

(a, D) exame imuno-histoquímica exibiu CD31 e CD34 vasos positivos tanto em PC-3 e tecido tumoral de xenotransplante LNCaP. Número de CD31 (B, C) e CD34 (E, F) vasos positivos foram representados como meios ± SD, o número era de três altos campos aleatórios amplificados por slide (microscopia de luz, hpf, 400 ×). * P 0,05 em relação ao controle, # P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo quercetina tratada, ※ P 0,05 denota uma diferença significativa entre o grupo de tratamento de combinação e o grupo 2-ME tratada

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Discussão e Conclusões

Com o aumento da incidência e mortalidade por cancro da próstata e com base na actual situação de tratamento desfavoráveis ​​para câncer de próstata resistente à castração (CRPC) [1,4], combinação de drogas tem atraído grande atenção devido à vantagem do aumento do efeito anti-câncer, menos dose do medicamento, efeitos colaterais reduzidos, etc. Aqui, seguindo a nossa pesquisa anterior in vitro [14], foi realizado um estudo da combinação de quercetina com 2-ME para agir sobre o câncer de próstata humana LNCaP e PC-3 xenoenxerto de tumor em ratinho BALB /c nu macho e descobriram que o uso combinado de inibição do crescimento do tumor de xenoenxerto, que foi atribuído à indução da apoptose, a inibição de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) sinal /Akt e angiogénese aumentada.

a quercetina e 2-ME são promissoras substâncias cancerígenas anti-próstata. Como um agente único, a quercetina foi verificado para inibir o crescimento do cancro da próstata, tanto in vitro como in vivo [5,6]. Nosso estudo anterior também descobriu que a quercetina inibiu o crescimento de células LNCaP através de regulação negativa do receptor androgênico e seus genes induzíveis [24]. O que é mais, a quercetina é de muito baixa toxicidade e raramente produz quaisquer efeitos secundários, mesmo em alta dose de 200 mg /kg administrada a ratos e camundongos SCID [19,20], e ensaios clínicos demonstraram que o consumo total de quercetina 1000mg por dia pode ser bem tolerada em seres humanos não associado com quaisquer efeitos secundários [25,26]. 2-ME crescimento também inibida de células de câncer de próstata e tumor xenoenxerto não produz toxicidade hematológica como outros MTAs [10,11,13]. Dose elevada de 150 mg /kg para os animais pré-clínicos em trilhas [13] e 1000 mg ou 1500 mg por via oral quatro vezes ao dia por humano na fase I e fase II pode ser bem tolerado, sem quaisquer efeitos tóxicos evidentes [27,28].

no entanto, apesar destes resultados inspiradores para câncer de próstata, quercetina e 2-ME ambos têm a desvantagem de baixa biodisponibilidade que desconta o seu efeito anti-cancro da próstata. Por isso, eles foram combinados com outros agentes, por exemplo, a quercetina com chá verde, fitoestrogénios na dieta e tamoxifeno [6,20,29,30], 2-ME com albendazol, docetaxel e eugenol [10,13,31], e todos mostraram aumento do efeito anti-cancro da próstata, mesmo em doses baixas, o que muito mad-se a biodisponibilidade insuficiente. Chang et ai relataram que a combinação de quercetina e 2-ME aumento do efeito citotóxico em células de carcinoma hepatocelular (HCC), em comparação com a quercetina ou 2-me sozinho [32]. Especula-se que a utilização simultânea de quercetina e 2-ME criaria maior efeito anti-cancro da próstata com mais segurança e menos toxicidade. A nossa experiência anterior in vitro mostraram que o uso combinado de quercetina e 2-ME exibiram inibição sinérgica da proliferação e indução da apoptose em ambas as PC-3 linhas dependentes de androgénio LNCaP e independente de androgénios humanos de células de cancro da próstata em comparação com a única droga, e isto foi atribuída a prender ciclo celular e diminuição da razão de Bcl-2 /Bax [14]. Mas não se sabe sobre o efeito in vivo sobre o cancro da próstata e em resultados in vitro, não pode ser aplicada directamente ao clínico. Por isso, nós combinamos quercetina com 2-ME a agir em LNCaP e xenoenxerto PC3 tumor e descobriram que o crescimento tratamento de combinação inibiu tumor xenoenxerto de 46,8% para LNCaP e 51,3% para o PC3, em comparação com o controle do veículo, mais eficaz do que a quercetina (28,4% para LNCaP, 24,8% para o PC3) ou 2-ME (32,1% para LNCaP, 28,9% para o PC3) sozinho. Além disso, eles foram bem tolerados e não reacção tóxica óbvia foi observada em todo o processo de tratamento. Verifica-se que a combinação de quercetina e 2-ME poderia inibir o crescimento do câncer de próstata in vivo em um grau maior, com mais eficácia e segurança.

A terapia direcionada tem sido considerado fundamental para efeito quimioterápico de produtos naturais e fitoquímicos [33 ]. A quercetina e 2-ME pode agir em algumas vias de sinalização que conduzem a inibir eficazmente o crescimento do cancro da próstata, especialmente quando eles são combinados.

proteínas Bcl-2, incluindo anti-apoptótica da família Bcl-2 e Bax pró-apoptótica, são importantes mediadores de mitocondrial via de apoptose. Activado Bax ajuda a segunda mitocôndrias derivado activador de caspase (Smac) e a libertação de citocromo-c que, assim, activar a caspase-3 em caspase-3 clivada e levando a célula a apoptose, enquanto que a proteína anti-apoptótica de Bcl-2 previne a activação do Bax por ligação e sequestrando-deixando as células cancerosas escapar apoptose [30,34]. Assim, Bax /Bcl-2 e a relação do nível de caspase-3 clivada indica a resposta terapêutica e são muito importantes na indução de apoptose [33]. A quercetina aumento da relação Bax /Bcl-2 de 1,3 vezes de LAPC-4 do tumor de xenoenxerto de células de cancro da próstata sensível ao androgénio [6]. Kumar et al relataram que a terapia de quercetina aumentou significativamente relação Bax /Bcl-2 e a actividade da caspase-3 em células PC-3 [30]. 2-ME inibiu a proliferação e apoptose induzida de células de LNCaP e PC3, in vitro e in vivo através da fosforilação da proteína Bcl-2 [35,36]. O nosso estudo mostrou que a quercetina e 2-ME utilizado por si só aumentou a proteína pró-apoptótica Bax, diminuição da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e elevados Bax /Bcl-2 rácio conduzindo assim a activação de caspase-3, que por sua vez a apoptose e o crescimento do tumor de xenoenxerto inibida induzida. Estes resultados foram confirmados por análise de imunohistoquímica de células positivas Ki67 caspase-3 e. Além disso, todos estes efeitos foram aumentadas por combinação de quercetina e 2-ME resultando na inibição do tumor para uma extensão maior.

AKT, uma proteína quinase de serina /treonina que pertence a via PI3K /AKT sobrevivência, desempenha um papel importante na sobrevivência celular e apoptose quando é activado em AKT fosforilada (pAKT). pAKT é regulada positivamente e desempenha um papel importante na sobrevivência e proliferação de células de cancro da próstata humanos [37]. Alto nível de pAKT está relacionado com alta qualidade e alta pontuação de Gleason de tumores de próstata e serve como um preditor independente de recorrência bioquímica [38]. Portanto, AKT tem sido considerada como um alvo terapêutico promissor para o cancro da próstata. Kim et al mostraram que a quercetina reduzida proteína de pAkt facilitando a apoptose induzida TRAIL- em linhas celulares LNCaP e DU145 [39]. Lee et ai revelaram que a quercetina reduzido nível de pAKT resultando na supressão de Bad fosforilada e influenciando a relação entre a Bcl-xL e Bax, a qual, em seguida, o aumento da actividade da Bax e, finalmente, conduzido a apoptose de células LNCaP [40]. 2-ME sensibilizados células PC-3 de FAS apoptose mediada através da inibição de pAKT [41]. Em nosso experimento, quercetina e 2-ME podem, respectivamente, diminuiu a expressão da proteína pAKT tanto LNCaP e PC-3 tecido tumoral de xenotransplante, mas pAKT diminuiu muito mais, obviamente, quando o tratamento combinado foi aplicado. Através da inibição da via de sinal pAKT, o crescimento do tumor foi suprimido de forma mais eficaz.

A angiogénese refere-se a geração de novos vasos sanguíneos a partir de pré-existente sistema vascular assegurar tumores obter suficiente oxigénio e nutrientes, e é regulada por vários factores angiogénicos, entre os quais factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é o mais importante [42]. As drogas anti-cancro pode inibir a angiogénese através da regulação negativa de VEGF através da qual o crescimento do tumor é inibido. Pratheeshkumar et ai descobriram que a quercetina reduziu os níveis de VEGF em células PC-3 e inibiu a formação de vasos sanguíneos, tanto in vitro como in vivo. Desta forma, as células PC-3 e tumores de xenoenxerto foram inibidas [43]. A quercetina também significativamente reduzida excreção de VEGF em células LNCaP [44]. Mabjeesh et ai iluminado que a 2-ME notavelmente diminuição do nível de VEGF de um modo dependente da dose em células PC-3, e em seguida o crescimento do tumor e angiogese foram inibidas [45].