Abstract

Introdução

Nós avaliamos a expressão de p85 e subunidades PI3K p110α em cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) amostras e a associação com a expressão de mTOR e efeitos estudados de segmentação da AKT /PI3K /mTOR em linhas celulares de NSCLC.

Métodos

Usando Automated Quantitative análise nós quantificamos a expressão de subunidades PI3K em duas coortes de 190 e 168 amostras de NSCLC e correlacionados com a expressão mTOR. Foram estudados os efeitos de dois inibidores de PI3K LY294002, e NVP-BKM120, isoladamente e em combinação com rapamicina, em 6 linhas de células NSCLC. Foram avaliadas a atividade de uma PI3K inibidor duplo /mTOR, NVP-BEZ235 sozinho e com um inibidor EGFR

Resultados

p85 e p110α tendem a ser co-expressos (p 0,001).; expressão p85 foi maior em adenocarcinomas do que carcinomas de células escamosas. a alta expressão de p85 foi associada com estágio avançado e baixa sobrevida. expressão p110α correlacionada com mTOR (ρ = 0,276). Em seis linhas celulares de NSCLC, a adição de rapamicina para LY294002 ou NVP-BKM120 era sinérgica. Até mesmo concentrações muito baixas de rapamicina (1 nM) resultou na sensibilização de inibidores de PI3K. NVP-BEZ235 foi altamente ativa em linhas celulares de NSCLC com IC

50s na faixa nanomolar e consequente regulação negativa dos pAKT e pP70S6K. Adicionando Erlotinib para NVP-BEZ235 resultou na inibição do crescimento sinérgico.

Conclusões

A associação entre a expressão PI3K, estágio avançado e sobrevivência em NSCLC sugere que poderia ser um alvo da droga valiosa. inibição concomitante de PI3K e mTOR é sinérgica

in vitro

e um duplo inibidor PI3K /mTOR foi altamente ativa. Adição de inibição de EGFR resultou em mais de inibição do crescimento. Segmentação do /mTOR PI3K AKT /em vários níveis deve ser testado em ensaios clínicos para NSCLC

Citation:. Zito CR, Jilăveanu LB, Anagnostou V, Rimm D, Bepler G, Maira S-M, et al. (2012) Multi-Nível Segmentação do fosfatidilinositol-3-quinase Caminho no Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (2): e31331. doi: 10.1371 /journal.pone.0031331

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de junho de 2011; Aceito: 06 de janeiro de 2012; Publicado: February 15, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Prémio Carreira de Desenvolvimento da Associação Americana para Pesquisa do Câncer com o Dr. Chao. Dr. Kluger é apoiada pela Yale SPORE em Câncer da Pele, 1 P50 CA121974 (a R. Halaban). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Drs. Rimm e Camp são co-fundadores, acionistas e consultores para uma empresa chamada HistoRx que licenciou a tecnologia para análise de tecido automático utilizado neste estudo. Drs. Maira e Hackl são funcionários da Novartis Company. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Nos Estados Unidos sozinho, cerca de 222.520 novos casos foram diagnosticados e cerca de 157.300 mortes ocorreram devido a câncer de pulmão em 2010 [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) representa cerca de 80% de todos os cânceres de pulmão. Os histológicos mais comuns são o adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e carcinoma de grandes células. A maioria dos doentes com NSCLC são diagnosticados em fase avançada em que a quimioterapia pode melhorar a sobrevivência e paliativo de sintomas. No entanto, a quimioterapia convencional não fornece nenhuma cura para NSCLC avançado e atingiu um patamar em termos de eficácia com uma sobrevida média de 8-10 [2] meses. A adição de novas terapias direcionadas, tais como bevacizumab e cetuximab à quimioterapia convencional tem melhorado a sobrevida média para cerca de 12 meses em pacientes com bom estado geral [3], [4]. abordagens terapêuticas inovadoras são urgentemente necessários para esta doença comum.

A fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /AKT /mTOR sinalização impactos da via muitos aspectos do crescimento e sobrevivência celular [5]. As alterações de componentes no AKT /via PI3K /mTOR pode ocorrer em diversos níveis e resultar em activação constitutiva desta via e transformação maligna.

As PI3K são uma família de enzimas que fosforilam o fosfatidilinositol bifosfato de trifosfato de fosfatidilinositol. PI3K são na maioria das vezes activado pela tirosina-quinase receptora (RTK) de sinalização, tal como através de EGFR, IGF1-R e HER2 /neu [6] – [9]. Existem três classes de PI3K [10], [11]. Classe I

Um PI3K é o tipo mais amplamente implicado no cancro e será referido como “PI3K” no restante deste manuscrito. PI3K é um heterodímero constituído por uma p85 reguladora e uma subunidade catalítica p110.

trifosfato de fosfatidilinositol medeia a activação da AKT [11]. AKT, por sua vez, activa muitas proteínas celulares envolvidas na síntese proteica, o crescimento e sobrevivência celular, incluindo mTOR [11] – [13]. mTOR regula a tradução por fosforilar componentes da maquinaria de síntese de proteínas, incluindo as proteínas cinases ribossomal S6 (P70

S6K) e proteína de ligação a 4E (4E-BP). A fosforilação de 4E-BP conduz à libertação do factor de eIF4E de iniciação da tradução que tem sido demonstrado para expor transformar e actividades anti-apoptóticos

in vitro

[13], [14]. PTEN inverte sinalização PI3K por desfosforilando fosfatidilinositol trifosfato [15].

Em NSCLC, PI3K /AKT de sinalização /mTOR é frequentemente desregulada devido a mutações que afectam um dos seus reguladores a montante, o receptor EGFR e outros componentes dentro da via [16]. componentes da via mTOR foram encontrados para ser mutado em 17 genes e em mais de 30% dos tumores de 188 adenocarcinomas do pulmão em que exome sequenciação foi realizada [16]. Aumentos no gene número de cópias de

PIK3CA

, o gene que codifica p110α, e mudanças na AKT fosforilado (pAKT) expressão foram descritas em células epiteliais brônquicas pré-malignas e NSCLC [17] – [22]. Enquanto mutações no

PIK3CA Quais são relativamente pouco frequentes no câncer de pulmão,

PIK3CA

copiar ganho número foi relatada em 33,1% de câncer de pulmão de células escamosas e no câncer de pulmão adeno 6,2% em uma série grande [ ,,,0],23]. sinalização PI3K foi mostrado para mediar a expansão de células estaminais broncoalveolar iniciada por oncogénica

K-RAS

[24]. Tumorais associadas mutações de p110α são oncogênicos

in vivo

em um modelo de rato com NSCLC [25]. A sobre-expressão de p85 e p110 α tem sido demonstrada estar correlacionada com fraca diferenciação dos cancros primários de pulmão em uma coorte que incluiu 73 casos de NSCLC [26]. Nosso grupo tem estudado anteriormente a expressão de mTOR em coortes NSCLC e encontrou uma associação com melhor evolução [27].

A inibição da PI3K /AKT /mTOR sinalização através farmacológicos e genéticos abordagens induz efeitos antiproliferativos em linhas celulares certa NSCLC [17] – [21] e em modelos do rato do cancro do pulmão [25], [28]. Um certo número de inibidores de PI3K estão disponíveis para investigação pré-clínica. compostos mais antigos, como LY294002 ou wortmanina tem actividade anti-tumoral em modelos pré-clínicos, mas a sua fraca solubilidade, o índice terapêutico estreito e cruzado inibição de outras quinases têm limitado a sua aplicação clínica. inibidores de PI3K mais recentes entraram ensaios clínicos de fase precoce, e a atividade desses agentes devem ser avaliados em doenças que exigem novas abordagens, como NSCLC.

O objetivo do nosso estudo foi caracterizar a expressão da p85 e p110 subunidades a de Classe I

a PI3K em dois grandes independentes coortes de amostras de NSCLC e avaliar a associação com variáveis ​​clínicas e patológicas, incluindo expressão de mTOR publicado anteriormente. Para obter, medidas expressão objetiva mais precisos, foi utilizado um método recentemente desenvolvido de automatizada, análise quantitativa (AQUA) de microarrays de tecido [29]. Como ativadores redundantes da via de sinalização PI3K /AKT e retroalimentação negativa [5] limitar a eficácia de terapias de agente único, o nosso próximo objetivo foi estudar os efeitos da segmentação da PI3K /AKT via de sinalização em vários níveis em linhas celulares de NSCLC. Descobrimos que a maior expressão da p85 correlacionados com pior sobrevida e estágio avançado. Expressão de p110α correlacionada com a de mTOR. inibição concomitante de PI3K e mTOR resultou na supressão do crescimento sinérgico. Adicionando inibição EGFR reforçado os efeitos inibidores do crescimento de um duplo inibidor PI3K /mTOR.

Materiais e Métodos

Tissue Microarray (TMA) Construção

A NSCLC coorte foi obtida do H. Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, FL). A coorte Moffitt Cancer Center (MTMA) contém núcleos de tumores NSCLC primárias de pacientes diagnosticados entre 1991 e 2001. O tempo de seguimento variou entre 0,8 meses e 146,4 meses, o tempo médio de seguimento de 52,3 meses. A idade ao diagnóstico variou 40,8-84,4 (idade média de 69 anos). A coorte incluiu 54,5% do sexo masculino e 45,5% do sexo feminino.

O grupo da Universidade de Yale (YTMA) foi construído a partir de blocos de tecido, fixados em formalina e embebidos em parafina obtidos a partir do Departamento de Patologia Arquivos da Universidade de Yale. Os espécimes foram ressecados entre 1995 e 2003, com uma gama de acompanhamento entre 0,1 meses e 182.25 meses, e um tempo médio de acompanhamento de 41 meses. A idade ao diagnóstico variou de 21 a 90 (média de idade de 65 anos). O estudo incluiu 51% do sexo masculino e 49% do sexo feminino.

TMA foram construídos como descrito anteriormente [27]. Dois núcleos de 0,6 mm foram obtidos a partir de diferentes áreas, representativos de cada amostra NSCLC primária e espaçadas 0,8 mm de distância em lâminas de vidro. pelotas linha de células que consistem em SW480, HT29, A431, MB435, MCF7, BT474, SKBR3 e foram utilizados como controlos e foram embebidos na matriz, como previamente descrito [30]. As coortes para MTMA e YTMA foram coletados com a aprovação dos conselhos de revisão institucionais e têm sido utilizados em publicações anteriores [27], [31].

coloração de imunofluorescência

Slides de TMA foram coradas para cada dos dois marcadores, p85 alvo PI3K e subunidades p110α. A coloração foi realizada por AQUA como descrito anteriormente [29] – [31]. As lâminas foram incubadas com anticorpo primário diluído em solução salina tamponada com Tris contendo 0,3% de albumina de soro bovino a 4 ° C. Os anticorpos primários utilizados para as respectivas incubações foram monoclonal de ratinho anti-humano de PI3K p85, clone 4 /PI3-quinase (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ou de coelho anti-humano do clone de PI3K p110α C73F8 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), em 1:200 ou 1:50 diluições, respectivamente. Quer de cabra anti-rato ou de cabra anti-coelho de rábano espinha dorsal do polímero decorado com peroxidase (Envision, América do Norte Dako, Carpinteria, CA) foi utilizada para visualizar a proteína alvo. Para criar uma máscara de tumor, as lâminas foram simultaneamente incubados com o mouse ou o coelho anti-citoqueratina na 1:100. Para a visualização de coloração citoqueratina um anticorpo de cabra anti-rato ou IgG anti-coelho conjugada com Alexa 546 (Molecular Probes, Inc.) a 1:200 foi utilizado. O marcador de alvo foi visualizado com Cy5-tiramida (NED Life Science Products). Lamelas foram montadas com o reagente Prolongar ouro com 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen).

Imagem automatizada Aquisição e Análise (AQUA)

As imagens foram analisadas usando algoritmos que foram descritos [29]. Tumor foi distinguido a partir de elementos do estroma por sinal citoqueratina. Coalescência de citoqueratina à superfície da célula foi usada para localizar o compartimento membrana celular citoplasmática e /ou no interior da máscara do tumor, e DAPI foi utilizado para identificar o compartimento nuclear na máscara do tumor. Metas foram visualizadas com Cy5; este comprimento de onda é utilizado para a marcação alvo porque está fora da gama de autofluorescência tecido. Multiple monocromática de alta resolução (1024 × 1024 pixels, 0,5 mm) imagens em tons de cinza foram obtidos para cada histospot usando o objectivo de um microscópio de epifluorescência Olympus AX-51 com estágio do microscópio automatizado e aquisição de imagem digital impulsionado por um programa personalizado e 10 × macrobased interfaces de software com IPLabs (Scanalytics, Inc.). Imagens para cada histospot foram analisados ​​individualmente. Duas imagens foram capturadas para cada histospot e para cada canal fluorescente, DAPI, Alexa-546, e Cy5; uma imagem no plano de foco e uma ìm 8 abaixo. A compartimentalização e quantificação do sinal da proteína alvo dentro de cada compartimento pré-definida para cada histospot foi realizada como se segue. Em primeiro lugar, o sinal Alexa-546 representando a coloração citoqueratina foi utilizado para gerar uma máscara de células epiteliais que exclui todos os outros elementos do estroma. Este sinal é gated binária, a fim de identificar se um pixel está dentro da máscara do tumor (a) ou não (OFF); todos os pixels brancos são parte dessa máscara e todos os pixels pretos não fazem parte deste compartimento. Da mesma forma, o compartimento nuclear é definido como pixels que demonstram a coloração DAPI dentro do plano do foco e dentro da região definida pela máscara de tumor. A imagem DAPI também é binarizadas para gerar uma máscara de todos os núcleos dentro da amostra, subtraindo-out pixels sobrepostos com a máscara citoplasmática; todos os pixels brancos são parte desta máscara enquanto todos os pixels pretos não são. Para garantir que apenas o sinal de destino a partir do tumor e não os elementos que cercam é analisado, os algoritmos RESA /local foram utilizados. O algoritmo de RESA fornece um sistema de limiar adaptativo. Em geral, os tecidos fixados com formalina e podem exibir autofluorescência e, por vezes, a análise pode dar vários picos de fundo. O algoritmo de RESA estabelece o pico predominante e, em seguida, define um limiar de máscara binária a um nível de intensidade ligeiramente mais elevado. RESA elimina todas as informações fora do foco, subtraindo uma percentagem da imagem fora do foco da imagem em foco, com base numa análise de pixel-por-pixel de uma das duas imagens. Isto eventualmente permite a atribuição mais precisa dos pixels de compartimentos adjacentes. Finalmente, nós utilizamos o algoritmo LUGAR para atribuir cada pixel de cada imagem para um compartimento subcelular específico. Todos os pixels que não podem ser atribuídos com precisão a um compartimento com um grau de confiança de 95% são finalmente excluídos. Além disso, todos os pixels para os quais as intensidades são muito semelhantes nos compartimentos nucleares e de membrana e, portanto, não pode ser atribuído com precisão também são excluídos. expressão de PI3K foi determinado automaticamente a partir de imagens do canal Cy5 para obter intensidade de pixel em relação ao sinal que emana a partir do plano de foco. Em primeiro lugar, cada pixel é atribuído a um compartimento subcelular ou é excluído como descrito acima. Uma pontuação de aqua para quaisquer compartimentos sub-celulares é geralmente calculado como a contagem média AQUA de cada um dos pixels individuais incluídos no compartimento seleccionado; o sinal de alvo (p85 ou P110α) a partir dos pixels dentro do citoplasma foi normalizado para a área da máscara e do tumor pontuada numa escala de 0-255 (a pontuação AQUA). Histospots foram excluídos se a máscara tumor representava menos de 5% da área total histospot.

Análise Estatística

Versão JMP 5.0 foi utilizado o software (SAS Institute, Cary, NC). O significado prognóstico de parâmetros foi avaliada utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox com a sobrevivência livre de progressão ea sobrevida global como um ponto final. análises de sobrevivência univariadas foram descritos pelo método de Kaplan-Meier. A associação entre a pontuação AQUA contínuos e outros parâmetros clínicos /patológicas foi avaliada através da análise de variância. Todos os valores p relatados são baseados em testes de significância dois lados. Análise de variância e teste t foram usados ​​para comparar medições contínuas.

linhas celulares e Western Blot

escamosas linha de células de carcinoma H2170 e celulares adenocarcinoma linhas H1650, HCC2935 e HCC827 foram gentilmente cedidas pelos Drs. John Minna e Michael Peyton (Southwestern University). linhas celulares de carcinoma escamoso SK-MES-1 e SW900 foram obtidas de American Tissue Type Culture. As características de cada linha de células, incluindo estado mutacional de

PIK3CA

,

K-RAS Comprar e

EGFR

são apresentados na Tabela S1. As linhas celulares de adenocarcinoma H1650, HCC2935 e HCC827 têm de tipo selvagem

PIK3CA

e

K-RAS

mas mutante

EGFR

. Todas as linhas celulares de carcinoma epidermóide SK-MES-1, H2170 e SW900 tem de tipo selvagem

EGFR Comprar e do tipo selvagem

PIK3CA

. SK-MES-1 e H2170 tem de tipo selvagem

K-RAS

. SW900 tem mutante

K-RAS

. Nós estávamos interessados ​​em comparar os efeitos da inibição de PI3K em adenocarcinoma de linhas de células de carcinoma escamoso e comparando com o

EGFR

mutante para

EGFR

linhas de células do tipo selvagem. Todas as linhas celulares de cancro do pulmão humanas foram cultivadas sob condições padrão (37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera) e cultivadas em meio RPMI (Gibco ™, Invitrogen Corp, Grand Island, NY) suplementado com 10% de FBS. A linha celular HBE135-E6E7, uma linha de células não-transformadas broncoalveolar, foi adquirido a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em queratinócitos-meio isento de soro suplementado com 5 ng /EGF humano recombinante ml, 0,05 mg /ml de bovino extracto de pituitária, 0,005 mg /ml de insulina e 500 ng /ml de hidrocortisona.

ensaio de concentrações de proteína de lisados ​​de células foram calculadas pelo BCA (ácido bicinconínico) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). As proteínas (50 ^ g) foram diluídas em tampão de amostra [2,5% de SDS, 10% glicerol, 5% β-mercapto-etanol, 50 mM de Tris (pH = 6,8) e 0,1% de azul de bromofenol] e submeteu-se dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida electroforese em gel (SDS-PAGE). Western blot foi realizada por métodos convencionais, utilizando os seguintes anticorpos anti-humanos de coelho principal: AKT phosporylated (Ser

473), fosforilada p70S6K (Thr

389), PI3K p110α, fosforilada proteína S6 ribossomal (Ser

235 /236), PARP (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) a 1:1000, e anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano p85 de PI3K ou anti-caspase-2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 1:1000. Um rato monoclonal β-actina (A2066 ou A5441, Sigma, 1:200 ou 1:5000 respectivamente) foi utilizado como um controle para padronizar o carregamento da amostra. Detecção de proteínas foi feito com anti-ratinho ou anti-coelho IgG anticorpos secundários conjugados com peroxidase (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) e ECL (PerkinElmer).

Antineoplásicos e viabilidade celular Ensaios

para os ensaios de viabilidade celular, uma × 10

3 células foram plaqueadas em triplicado numa placa de microtitulação de 96 poços (BD Bioscience) e deixou-se crescer durante 24 horas a uma confluência aproximada de 30%. Para estudos de inibição de droga, NVP-BEZ235 e NVP-BKM120 (Novartis Pharmaceuticals, Basileia, Suíça) e LY294002 (LC Laboratories, Woburn MA) foram usados ​​para tratar as células do pulmão em várias concentrações. Para as experiências de combinação, o inibidor mTORC1, foram utilizados rapamicina e inibidor de EGFR erlotinib (LC Laboratories).

A viabilidade celular foi avaliada às 72 horas utilizando o celular CellTiter-Glo Luminescent ™ Viabilidade Ensaio, de acordo com as instruções do fabricante ( Promega, EUA); um volume igual da Célula Titer-Glo ™ reagente foi adicionada aos poços e após uma incubação de 10 minutos, de luminescência foi registada utilizando um leitor de placas Victor multilabel X ™ (Perkin Elmer). O

50 valores IC foram determinados pelo software XLfit (MathIQ versão 2.2.2, IDBS).

sinérgica Drogas Effect Analysis

O método de análise índice de combinação Chou e Talalay foi utilizado para analisar os resultados de experimentos com drogas combinatórias [32]. NVP-BKM120 e LY294002 foram usadas em combinação com o inibidor de mTOR, rapamicina. NVP-BEZ235 foi combinado com erlotinib, pelo respectivo fármaco único IC

50 ou IC

25 concentrações. O IC

50 e IC

25 valores de cada droga foram pela primeira vez obtida a partir de ensaios de viabilidade de um único medicamento e, em seguida, utilizada para projetar experimentos combinação de drogas. O nível de sinergismo foi avaliada ao longo de uma vasta gama de concentrações de fármaco, concentrando-se em concentrações abaixo ou no ic

50 para o fármaco, quer isoladamente. Os resultados foram analisados ​​por sinérgico, aditivo, ou efeitos antagonistas utilizando software CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, Missouri, EUA). Efeito sinérgico é indicado por um Índice de combinação (IC) de menos de 0,9, o efeito aditivo por um IC entre 0,9 e 1,1, e por efeito antagonista CI superior a 1,1.

Resultados

Expressão de p85 PI3K e subunidades p110á em amostras de câncer de pulmão humanos

para o MTMA, 166 e 190 espécimes foram totalmente avaliável em relação ao p85 PI3K e expressão subunidade p110α, respectivamente. PI3K não mostraram coloração nuclear significativa para qualquer subunidade, e, portanto, analisou apenas o compartimento citoplasmático. Os padrões de coloração dentro do tumor dentro de uma máscara histospot eram altamente homogénea para ambas as subunidades. pontuações AQUA variou 7,12-127,04 (média, 37,68; mediana, 33.47) para a subunidade p85, e 5,43-138,56 (média, 24,35; mediana, 20.26) para a subunidade p110α. Um exemplo de Aqua coloração de histospots P85 e expressão p110α é mostrado na Figura 1 e Tabela S2. Histospots foram considerados un-interpretável se tivessem células tumorais insuficientes, a perda de tecido no local, ou uma abundância de tecido necrótico. As amostras com área de tumor inferior a 5% ao local não foram incluídos na análise Aqua.

Anti-PI3K conjugado com Cy5 é usado para medir níveis de subunidade de PI3K (inferiores quadrantes esquerdos, ampliação x 10). Anti-citoqueratina conjugados com Cy3 é utilizado para identificar as células tumorais dentro do histospot quadrantes (superior direito). Os furos são preenchidos para criar uma máscara de tumor (direita quadrantes inferiores). DAPI é usado para identificar os núcleos (quadrantes superior esquerdo). O compartimento nuclear na máscara do tumor é então subtraída da máscara para criar um compartimento citoplasmático (não mostrado). Os painéis direitos são 40 × ampliações de p85 PI3K e coloração positiva e negativa subunidade p110α, respectivamente.

Foram avaliadas as associações entre a expressão da subunidade PI3K e subtipo histológico, por testes t desemparelhados. A expressão de ambos os p85 e as subunidades p110α foram significativamente maiores do que em adenocarcinomas em carcinomas de células escamosas (

P

0,0001 P85 e

P = 0,0356 para

p110α), como mostrado na figura 2, painel A B.

Significativamente maior expressão da subunidade p85 PI3K é visto em tumores de adenocarcinoma, na Cancer Cohort Moffitt e da Coorte Universidade de Yale, respectivamente (Painel A C). Significativamente maior expressão da subunidade p110α PI3K em tumores de adenocarcinoma é visto no cancro Coorte Moffitt e a coorte Universidade de Yale, respectivamente (Painel B D). As curvas de Kaplan-Meier que mostram uma associação entre a expressão da subunidade PI3K e diminuição da sobrevivência para p85 (Painel E), mas não para p110α (Painel F).

Para validar a associação entre as subunidades de PI3K e adenocarcinoma, o YTMA estava empregado. Ao contrário do MTMA que foi fase actual, principalmente I cancro do pulmão (92%) (A e B), o YTMA incluiu 55% a fase I, e 45% a fase II-IV (17%, 19% e 9% a fase II, III , IV, respectivamente) câncer de pulmão. Para a p85 e a subunidade de PI3K p110α expressão YTMA foi interpretável para 163 e 168 amostras, respectivamente. As pontuações AQUA para esta coorte variou 4,18-120,73 (média, 35,31; mediana, 32,70) para a subunidade p85, e 9,17-86,91 (média, 38,12; mediana, 35,17) para a subunidade p110α. Teste t não emparelhado confirmou as conclusões do MTMA; expressão da subunidade p85 e a subunidade p110α foram significativamente maiores do que em adenocarcinomas em carcinomas de células escamosas (

P

0,0002 P85 e

P = 0,0266 para

p110α), como mostrado na figura 2, painel C D. alta p85 e expressão subunidade p110α correlacionada com estágio avançado da doença da doença (

P

= 0,0075,

P

= 0,0093, respectivamente), mas não com a idade e sexo (não mostrado).

por Cox análises de sobrevida univariada das pontuações AQUA contínuas, descobrimos que a alta expressão de p85 correlacionada com a diminuição da sobrevida (

P

= 0,0198). AQUA proporciona pontuações de saída contínua, em vez de categorias de “alto” ou “baixo”, tal como determinado por imuno-histoquímica patologistas interpretação padrão. Para visualizar a associação entre os escores de PI3K contínuas e sobrevivência, pontuações AQUA foram dicotomizados pela mediana, refletindo o uso de divisões estatísticas de rotina na ausência de justificação subjacente a uma divisão de expressão. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram gerados para a expressão da subunidade p85 de PI3K e sobrevivência e

P

-Valores foram obtidos pelo método de log-rank de Mantel-Cox. Como mostrado na Figura 2, painel E F, encontramos uma associação significativa entre a alta expressão de p85 e pobres sobrevivência (

P

= 0,0075). Não foi encontrada associação entre a expressão p110α e sobrevivência.

Na expressão análise de p85 multivariada não manter o seu valor preditivo independente, presumivelmente devido à sua associação com o subtipo histológico e estágio. A única variável associada com a sobrevivência por meio de análise multivariada foi Stage (

P

= 0,0000). Sem essa associação entre a expressão da subunidade p110α e sobrevivência foi anotada.

co-expressão de p85 PI3K ou p110á com mTOR em tumores de pulmão humanos

A associação entre a expressão publicado anteriormente mTOR [27] e p85 e p110α subunidades de PI3K foi avaliada. Utilizando o teste de correlação de Spearman, expressão mTOR foi associada com a expressão p110α (ρ = 0,276,

p

= 0,0006), enquanto que não foi encontrada associação entre os níveis de mTOR e subunidade p85.

In vitro

atividade de NVP-BKM120 e LY294002 em linhas de células pulmonares

Devido à associação entre PI3K e estágio avançado e baixa sobrevida, o

in vitro

atividade de inibidores de PI3K foi estudado em seis linhas celulares de cancro do pulmão humano. Dois inibidores de PI3K foram utilizados; estudámos NVP-BKM-120, um inibidor de PI3K de qualidade clínica a ser desenvolvido pela Novartis, e LY294002, um composto disponível comercialmente que tem sido amplamente utilizado para estudar a inibição de PI3K na configuração pré-clínico. As células foram tratadas com quer NVP-BKM120 em concentrações que variam desde 0,01 nM a 8200 nM ou LY294002 em concentrações variando de 6,4 nM a 20000 nM. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Após 72 horas de incubação, a viabilidade celular foi avaliada, e o IC

50 foi calculada para cada linha de células, e em médias de experiências repetidas. Como mostrado na Tabela 1, o IC

50 para NVP-BKM120 e LY294002 inibição variaram de 716 nM a 1265 nM e 4123 nM a 11925 nM, respectivamente.

Para testar se a inibição do crescimento infligidos pela NVP-BKM120 e LY294002 são específicos ou, pelo menos, reforçada em maligna em comparação com as células normais, usamos uma linha imortalizada, não transformada bronchoaveolar celular, HBE135-E6E7. Estas células foram derivadas de epitélio brônquico normal, tomada a partir de uma lobectomia homem passando para o carcinoma de células escamosas [33]. NVP-BKM120 LY294002 e teve pouco efeito sobre as células normais em concentrações bronchoaveolar aproximadamente 10 e 5 vezes a IC média

50 destas duas drogas, respectivamente, em células NSCLC. inibição do crescimento de 13% foi observada em 10 mM NVP-BKM120 mas um IC

50 não pôde ser encontrado em concentrações mais elevadas, e uma mera inibição do crescimento de 25% foi obtida com 50 mM tratamento LY294002.

Tendo em conta que os níveis de droga metas de expressão, por vezes, prever a sensibilidade de drogas, foi estudada a associação entre o grau de sensibilidade /resistência a níveis LY294002 e PI3K NVP-BKM120 e. Foram avaliadas as duas subunidades PI3K e AKT total e fosforilada por immunoblotting. Nenhuma associação clara foi encontrada entre os níveis de pré-tratamento de PI3K (p85 ou p110α) ou AKT total e fosforilada e sensibilidade /resistência a NVP-BKM120 ou LY294002 (Figura S1).

A sinergia entre a PI3K e mTOR inibidores

a resistência à inibição de PI3K foi observado em diferentes doenças e atribuída a numerosos mecanismos. Constitutiva PI3K ativação da via poderia resultar de activação AKT por mTOR-C2 ou ativação de mTOR por membros da via de MAP quinase apesar da inibição específica PI3K de drogas. Devido à co-expressão entre p110α e mTOR visto nas nossas amostras clínicas, estudamos sinergismo entre a rapamicina e mTOR inbitor NVP-BKM120 e rapamicina e LY294002. As concentrações de 1000 e 500 nM de NVP-BKM120 foram combinadas com uma gama de concentrações de rapamicina (1, 10 e 100 nM) em seis linhas celulares de NSCLC. A sinergia foi observada em cinco das seis linhas celulares em todas as concentrações de NVP-BKM120 com todas as três concentrações de rapamicina, e na sexta linha celular (H1650), a sinergia foi observada com concentrações mais elevadas de NVP-BKM120 (Figura 3 e tabelas S3 e S4). Em seguida, estudou sinergismo entre LY294002 e rapamicina. As concentrações de 5000 e 2500 nM de LY294002, foram combinadas com uma gama de concentrações de rapamicina (1, 10 e 100 nM) em seis linhas celulares de pulmão. A sinergia foi observada em todas as seis linhas celulares em todas as concentrações de LY294002 com todas as três concentrações de rapamicina, como mostrado na Tabela S3. A Figura 3 mostra o sinergismo graficamente, utilizando H2170 e SW900 como um exemplo. Notavelmente, as diferenças visto na viabilidade quando a adição de 1 nM, 10 nM ou 100 nM rapamcyin eram bastante semelhantes.

As células foram tratadas com concentrações nanomolares descendente do inibidor PI3K NVP-BKM120 ou LY294002, sozinho ou combinado com 1 nM, 10 nM ou 100 nM rapamicina durante 72 horas e viabilidade foi medida com o ensaio Titer Glo celular. As barras mostram a viabilidade como uma percentagem de células viáveis ​​em relação às células não tratadas. Três experiências separadas foram realizadas e cada condição foi medida em três cavidades replicadas.

Atividade de um duplo inibidor da PI3K /mTOR em linhas celulares de NSCLC

Dada a sinergia observada entre inibidores de PI3K e rapamicina em linhas celulares de cancro do pulmão, um duplo inibidor de PI3K /mTOR que tem sido dada a doentes com tumores sólidos na fase I de ensaios clínicos, NVP-BEZ235, foi estudada. Em todas as linhas celulares de cancro de seis pulmonares IC

50s para o composto NVP-BEZ235 estavam na gama nM, enquanto nenhum efeito foi observado em células HBE135-E6E7, mesmo a concentrações tão elevadas como 1000 nM ou vinte vezes superior à média IC

50 observada em linhas celulares de NSCLC (Tabela 1). Estes resultados sugerem que o crescimento NSCLC e sobrevivência mediada por uma ampla gama de factores moleculares são selectivamente sensível à inibição de PI3K por NVP-BEZ235. Alvos de NVP-BEZ235 (pAKT, pP70S6K e PS6) foram determinados por análise de imunotransferência de células com exposição à droga até 24 horas. Qualquer exposição à droga além de 24 horas resultou em significativa quantidade de células mortas e detritos e teria limitado a capacidade de interpretação.