Abstract

produtos finais da glicação avançada (AGEs) são produzidos em uma reação não enzimática irreversível de carboidratos e proteínas. Pacientes com diabetes mellitus (DM) são conhecidos por terem níveis elevados de idade, o que é visto como um fator de risco de complicações relacionadas com a diabetes. Num cenário clínico, tem sido demonstrado que os pacientes com cancro oral em conjunto com o DM tem uma maior probabilidade de metástases de cancro e as taxas de sobrevivência mais baixas do cancro. AGE-RAGE (um receptor de AGEs) também está correlacionada com metástase e angiogênese. Estudos recentes têm sugerido que a malignidade do cancro pode ser aumentada por produtos FGA derivados gliceraldeído-; No entanto, o mecanismo subjacente permanece obscura. Este estudo examinou a correlação aparentemente estreita entre AGE-RAGE e da malignidade de linha de células de câncer bucal SAS. Neste estudo, os AGEs aumento da fosforilação ERK, migração celular melhorada, e promoveu a expressão de RAGE, MMP2 e MMP9. Usando PD98059, anticorpo RAGE e RAGE ARNi para bloquear a via de RAGE resultou na inibição da fosforilação de ERK. A migração celular, MMP2 e MMP9 expressão também foram reduzidos por este tratamento. Nossos resultados demonstram a importância da AGE-RAGE no que respeita à malignidade do câncer oral, e ajudam a explicar o mau prognóstico dos indivíduos com DM com câncer oral

Citation:. Ko SY, Ko HA, Shieh TM, Chang WC, Chen HI, Chang SS, et al. (2014) Migração celular é regulada pela interação AGE-RAGE em células humanas cancro oral

In Vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110542. doi: 10.1371 /journal.pone.0110542

editor: Barry I. Hudson, Universidade de Miami, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril de 2014; Aceito: 16 de setembro de 2014; Publicação: 16 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ko et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC 100-2314-B-309-002-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

avançada produtos finais de glicação (AGEs) são o resultado de uma reacção de Maillard entre as proteínas e hidratos de carbono. Envelhecimento e função metabólica reduzida têm sido mostrados para aumentar a formação de AGEs [1] – [5]. O aumento da acumulação de AGE também foi observado em pacientes com doença de Alzheimer (AD) e diabetes mellitus (DM) [6] – [8]. Além disso, os AGEs têm sido mostrados para desempenhar um papel na patogénese da MS, de tal modo que a acumulação de AGE é considerado como um factor de risco de várias complicações da doença [9] – [14].

Estudos recentes demonstraram que envelhece e se enfurece (receptores de AGEs) regulam a migração de células [15] – [17]. superexpressão RAGE tem sido associada a cancros do cólon, laringe, língua, estômago, e boca [18] – [20], através de carcinogénese [21], a proliferação celular, metástase, invasão e angiogénese [22] – [25]. Em um estudo clínico que incluiu pacientes que sofrem de câncer oral, bem como DM, o câncer tornou-se cada vez mais invasiva, resultando em um declínio nas taxas de sobrevivência [26]. Esse estudo identificou ainda uma correlação entre o câncer oral e DM [27]. RAGE foi mostrado para ser estreitamente associado com a invasão no câncer oral [15], e a malignidade do câncer pode ser reforçada por AGEs derivado de gliceraldeído [17]. No entanto, o mecanismo subjacente responsável por esses efeitos ainda não está claro.

Este estudo investigou a aparentemente forte correlação entre AGEs e a malignidade do câncer bucal. Nossos resultados demonstram que AGEs melhorar a migração celular e também aumentar a fosforilação ERK e a expressão de RAGE, MMP2 e MMP9. O pré-tratamento com PD98059 (um inibidor de ERK) foi encontrado para suprimir os efeitos de produtos FGA; Contudo, a expressão não foi inibida RAGE. RAGE anticorpos também foram usadas para bloquear a conjugação de produtos FGA, que resultou na fosforilação de ERK reduzido, a expressão de MMP2, MMP9, e a migração celular. Além disso, RAGE RNAi parece regular estes efeitos, sugerindo que o sistema AGE-RAGE altera a migração de células através da fosforilação ERK e a regulação das vias a jusante. Nossos resultados fornecem uma prova de que AGE-RAGE desempenha um papel importante na determinação da malignidade do câncer bucal.

Materiais e Métodos

Reagentes

fenilmetilsulfonilo fluoretos (PMSF), bovina albumina de soro (BSA), DL-gliceraldeído, PD98059 e foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). meio DMEM, soro de bovino fetal (FBS), penicilina, estreptomicina, Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS), azul de tripano, e Lipofectamina RNAiMAX foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). GAPDH (Cat No .: MAB374) foi adquirido da Chemicon (Temecula, CA, EUA). ERK (Cat No .: SC-94), p-ERK (Cat No .: SC-7383), RAGE (Cat No .: SC-94), e Rage siRNA (Cat No .: SC-36374) foram adquiridos de Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). MMP2 (Cat No .: 2763-S) e MMP9 (Cat No .: 2551-S) foram adquiridos a Epitomics (Burlingame, CA, EUA). membranas de nitrocelulose foram adquiridos a Corp PALL. (Ann Arbor, MI, EUA). quimioluminescência aumentada (ECL) foi adquirido a partir da Millipore (Billerica, MA, EUA). WST-1 Kit foi adquirido a Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA, EUA). Cultura-Insert foi comprado de Ibidi (Verona, WI, EUA).

Preparação de AGEs

AGEs foram preparados por incubação de BSA (pH = 7,4) em PBS com 20 mM DL-gliceraldeído em 37 ° C durante 1 semana. O produto foi dialisado em PBS a 4 ° C durante 2 horas, e este ciclo foi repetido 5 vezes. O produto foi, em seguida, concentrou-se a 4 ° C utilizando um tubo de concentração Amicon Ultra proteínas (Millipore) e centrifugada a 3000 rpm durante 30 minutos, antes de ser armazenado a -80 ° C [28].

Cultura celular e tratamento

A linha de células de câncer bucal SAS (Coleção japonesa dos recursos biológicos de pesquisa Cell Bank [JCRB], Japão) foi cultivada a 37 ° C sob uma CO 5%

2 atmosfera. A cultura foi mantida em meio DMEM (Invitrogen) suplementado rotineiramente com 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina, 2 mM de L-glutamina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram incubadas sem soro durante 24 horas antes do tratamento.

tripano de corante azul de exclusão ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma concentração de 10

5 por poço e cultivadas durante 24 horas. A viabilidade das células foi determinada de acordo com a sua capacidade para excluir azul de tripano a 0,5% (Invitrogen) seguindo o tratamento com 100-400 ng /ml para os produtos FGA 24 e 48 horas, respectivamente. Um volume igual de solução de azul de tripano de corante (0,1%, w /v), de HBSS, e suspensão de células foram combinadas e mantida à temperatura ambiente durante cinco minutos. As amostras foram, em seguida, carregou-se um hemocitómetro para categorizar como células vivas ou mortas de acordo com a absorção de corante. Todos os números apresentados neste estudo são os valores médios de experiências em triplicado.

WST-1 de ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de 5 × 10

3 por poços e cultivadas durante 24 horas. A proliferação celular foi detectado por o WST-1 Kit (Clontech) em meio condicionado. As amostras foram preparadas de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. Resumidamente, após o tratamento com idades (0-400 ug /ml), o meio condicionado foi centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi em seguida transferida para placas de 96 poços (100 ul /poço). Mistura de reacção (100 uL) foi adicionada a cada poço, seguido de incubação durante 30 minutos. Durante o período de incubação, as amostras foram mantidas à temperatura ambiente (TA) e protegida da luz. A absorvância das amostras foi medida a 490 nm. comprimento de onda de referência deve ser superior a 600 nm. Todos os números apresentados neste estudo são os valores médios obtidos em experiências realizadas em triplicado.

RNA de interferência Experimentos

As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma concentração de 2 × 10

5 células por poço e cultivadas durante 24 horas. As células foram então transfectadas com ARNsi de RAGE (a piscina de alvo específico do marco 19-25 nt siARN; Santa Cruz) ou a sequência de cadeia de sentido do ARNi como um controlo negativo (5′-UUCUCCGCCCGUGUCACGU-3 ‘) [29]. As transfecções foram realizadas com Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Especificamente, diluir 40 pmol de RNAi duplex em 250 ul Opti-MEM I reduzida meio de soro sem soro. Em seguida, misture delicadamente o Lipofectamine RNAiMAX e diluída 4 ul da mistura em 50 mL Opti-MEM I reduzida meio de soro. O duplex de ARNi diluído foi combinado com Lipofectamina diluído RNAiMAX e incubou-se durante 20 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, os complexos lipofectamina RNAiMAX o ARNi Duplex foram adicionados a cada poço. Isto resultou num volume final de 600 ul e uma concentração de siRNA final de 20 nM. As células foram incubadas durante 48 horas antes de serem utilizados nas experiências.

Western blot

Proteínas (30 ug) foram resolvidas usando 10% de gel SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose (PALL Corp .). As membranas foram bloqueadas com leite não gordo e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários seguintes: anti-p-ERK (diluição de 1:1,000); anti-ERK (diluição de 1:1,000); anti-MMP2 (diluição de 1:1,000); anti-MMP9 (diluição de 1:1,000); anti-RAGE (diluição de 1:1,000;.. anti-GAPDH (diluição de 1:40,000) Os anticorpos primários foram, então, removido e as membranas foram lavadas com tampão PBST, durante 30 minutos, as membranas foram subsequentemente incubadas durante 45 minutos à TA com o seguinte anticorpos secundários:. peroxidase de rábano silvestre conjugado anti-ratinho (diluição de 1:4,000) e anti-coelho (diluição de 1:4,000) (Chemicon) Finalmente, os anticorpos secundários foram removidos e as membranas foram lavadas duas vezes com tampão PBST durante 30 minutos. os sinais foram detectados utilizando o kit Ocidental Iluminação quimioluminescência Reagente Plus (Millipore). as densidades dos sinais foram medidos utilizando um sistema de imagem, e os sinais foram quantificados após ser normalizados contra os de GAPDH. Todos os valores apresentados neste trabalho são os valores médios a partir de experiências realizadas em triplicado.

a migração celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços utilizando Cultura-Inserir (Ibidi) a uma concentração de 6 x 10

5 células por poço e em seguida cultivadas durante 24 horas. Após um período de 24 horas em condições isentas de soro, a cultura-inserções foram removidas e as células foram lavadas com HBSS, antes de ser tratada com os produtos FGA por análise de migração celular.

Zymorgraphy ensaio

a seguir ao tratamento com 200-400 ng /ml para os produtos FGA 4 ou 24 horas, as células foram semeadas em 7 cm pratos a uma concentração de 1 × 10

6 células. Zimografia foi utilizado para detectar a função de MMP2 e MMP9 em meio condicional. Para alcançar este objectivo, utilizou-se 7,5% de gel de SDS-PAGE contendo 0,1% de gelatina (J.T.Baker, Center Valley, PA, EUA). O gel foi então lavada com 2,5% de Triton X 100, durante 30 minutos à TA. Triton X 100 foi removida e o gel foi lavado com H RO

2O. Adicionou-se então tampão de renaturação (50 mM de Tris-HCl, pH 7.2,20% glicerina) durante 30 minutos à TA. tampão de renaturação foi removida e o gel foi lavado com H RO

2O. Em seguida, adicionou-se tampão de desenvolvimento (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 5 mM de CaCl2, 1 mM ZnCl2) durante 24 horas a 37 ° C. Desenvolvendo tampão foi removida e o gel foi lavado com H RO

2O. coloração de gel foi realizada durante 1 hora à temperatura ambiente usando PageBlue Proteína de coloração (Fermentas, Lafayette, CO, EUA). descoloração em gel foi realizado utilizando RO H

2O à TA. . (Fig S1)

Análise estatística

Foi realizada uma estudante testes t, ANOVA one-way, e valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados.

influência de AGEs em células de câncer bucal

em primeiro lugar, avaliaram a influência de AGEs sobre a viabilidade celular. SAS células foram tratadas com os produtos FGA (0-400 ug /ml) ou de BSA (0-400 ug /ml) durante 24 ou 48 horas, após o que o número de células e taxa de proliferação foram determinados de acordo com exclusão de corante azul de tripano (Fig. 1A ensaios) e WST-1 (Fig. 1B). Em comparação com células de controlo, idade células tratadas mostraram uma redução significativa no número de células (24 horas AGEs 100: 2,88 ± 0,16,

P

= 0,006; AGEs 200: 2,6 ± 0,25,

P

= 0,008; AGEs 400: 1,85 ± 0,05,

P Art 0,0001; 48 horas AGEs 100: 3,1 ± 0,18,

P

= 0,05; AGEs 200: 2,57 ± 0,17,

P

= 0,01; AGEs 400: 2,03 ± 0,08,

P

= 0,003). Em contraste, a BSA foi demonstrado que o aumento do número de células (como um controlo negativo, 24 horas: 4,77 ± 0,32, NS; 48 horas: 9,25 ± 0,35,

P

= 0,0004) (Fig. 1A). Além disso, a proliferação de células foi demonstrado ser inibida por idades (Fig. 1B). Finalmente, o tratamento de células com idades (400 ug /ml; 0-4 horas) reforçada migração; no entanto, a BSA não tem qualquer efeito sobre a migração (Fig. 1C).

células SAS foram tratados com idades (0-400 ug /ml) ou BSA (0-400 ug /ml) por 24 a 48 horas. O número de células e proliferação foram detectadas utilizando o corante azul de tripano exclusão (A) e um ensaio de WST-1 (B). AGEs reduziu significativamente o número de células; BSA (como um controlo negativo) aumento da viabilidade (A). AGEs também inibiu a proliferação de células (B). O tratamento com idades (400 ug /ml; 0-4 horas). Migração celular reforçada, enquanto o tratamento com BSA não (C)

AGEs regulação do RAGE, MMP2 e MMP9

As células foram tratadas com os produtos FGA (200 e 400 ug /ml) ou de BSA (400 ug /ml) durante 24 horas. Em seguida, usamos análise de Western blot para detectar RAGE, MMP2 e MMP9. Em comparação com células de controlo, o resultado mostrou que as células AGEs tratados apresentaram um aumento significativo na RAGE (AGEs 400: 1,3 ± 0,03,

P

= 0,0007), MMP2 (AGEs 200: 1,28 ± 0,04,

P

= 0,002; AGEs 400: 1,47 ± 0,04,

P

= 0,004), e MMP9 (AGEs 400: 1,24 ± 0,03,

P

= 0,0008) (Figura 2).. Além disso, a funcionalidade de MMP2 e MMP9 foi aumentada após o tratamento com as idades para 4 ou 24 horas (Fig S2).

Depois de tratar as células com as idades (200 e 400 ug /ml) ou de BSA (400 ug /ml de ) durante 24 horas, a raiva, MMP2, MMP9 e foram detectados por análise de western blot (a). AGEs aumentou significativamente a expressão de RAGE, MMP2 e MMP9 (B).

Regulamento da fosforilação ERK por AGEs

A fim de identificar a via de AGEs, as células foram tratadas SAS com idades ou BSA durante 24 horas. ERK fosforilação foi então detectada utilizando análise de Western blot. Nossos resultados mostram que o tratamento com idade aumentou significativamente ERK fosforilação (AGEs 400: 1,26 ± 0,06,

P

= 0,01) (Fig 3A.). ERK fosforilação foi reforçada após 4 horas de tratamento AGEs (Fig S2); no entanto, pré-tratamento de células com PD98059 durante 1 hora resultou numa redução na expressão de MMP2 e MMP9 (Fig. 3B e C). Afigura-se que o pré-tratamento PD98059 bloqueou os efeitos de AGEs sobre a migração de células (Fig 3D.); no entanto, a expressão RAGE não foi afetada (AGEs 400: 1,27 ± 0,04,

P

= 0,003) (Fig 3E).

A análise Western blot mostrando que o tratamento de células SAS, com idades de 24 horas. resultou no aumento da fosforilação de ERK (a). O pré-tratamento com PD98059 durante 1 hora reduzida fosforilação de ERK, MMP2 e MMP9 (B e C), bem como migração de células (D); no entanto os níveis de RAGE ainda aumentou (E).

Regulamento do ERK por AGEs via RAGE

anticorpos Rage (10 ng /ml de pré-tratamento durante 1 hora) foram usados ​​para bloquear AGE conjugação. O tratamento com AGEs resultou em um aumento significativo da fosforilação ERK e a expressão de MMP2 e MMP9 (ERK: 1,31 ± 0,03,

P

= 0,0008; MMP2: 1,38 ± 0,04,

P

= 0,0005; MMP9: 1,32 ± 0,09,

P

= 0,02). Em comparação com as células tratadas com os produtos FGA por si só, as células tratadas com ambas as idades e anticorpo RAGE demonstrado fosforilação de ERK inibiu significativamente (

P

= 0,009) assim como a expressão reduzida de MMP2 (

P

= 0,05) , e MMP9 (

P

= 0,0003) (Fig. 4 A e B). RAGE anticorpos também foram exibidas para suprimir a migração de células (Fig. 4C).

O uso do anticorpo RAGE (pré-tratamento de 10 ng /ml durante 1 hora) para bloquear IDADE conjugação resultou num aumento significativo na fosforilação de ERK, MMP2 e MMP9 devido à AGEs. Comparado com o tratamento de produtos FGA (#), RAGE anticorpo bloqueou a fosforilação de ERK, MMP2, MMP9 e (A e B), bem como migração de células (C).

RAGE RNAi (20 nM durante 48 horas) foi então usado para silenciar a expressão de proteína. Comparado com o ARNi de controlo negativo (N), RAGE ARNi foi demonstrado que têm uma expressão suprimir significativamente RAGE (0,64 ± 0,07,

P

= 0,006) (Fig. 5A). A supressão da migração das células por RAGE ARNi foi encontrado para ocorrer de forma independente dos efeitos de produtos FGA (Fig. 5B). Além disso, RAGE RNAi inibiu a fosforilação ERK (RNAi: 0,64 ± 0,08,

P

= 0,01; N + AGEs: 1,26 ± 0,03,

P

= 0,001) MMP2 (N + AGEs: 1,28 ± 0,04,

P

= 0,003), e a secreção de MMP9 (RNAi: 0,58 ± 0,06,

P

= 0,002; N + AGEs: 1,36 ± 0,05,

P

= 0,003). Comparado com N + AGEs, o tratamento com RNAi + AGEshad um efeito significativo sobre todos os três destes processos (ERK:

P

= 0,02; MMP2:

P Art 0,003; MMP9:

P

= 0,04) (Fig. 5C e D). O controle negativo não mostrou efeitos significativos.

RAGE RNAi (20 nM durante 48 horas) foi utilizada para silenciar a expressão da proteína. Comparado com o ARNi de controlo negativo (N), RAGE ARNi significativamente reduzida expressão RAGE (A). A supressão da migração das células por RNAi RAGE ocorreu independentemente de entre o tratamento com os produtos FGA (B). RAGE ARNi também inibiram a fosforilação de ERK, MMP2, MMP9 e. Comparado com N + AGEs (#), RNAi + AGEs apresentou uma redução significativa (C e D) e do controlo negativo não teve nenhum efeito.

Discussão

A relação entre câncer bucal e DM foi demonstrado por investigadores anteriores [30] – [32]. Pacientes que sofrem de câncer oral em conjunto com DM são o rosto com as células cancerosas altamente invasivas, e baixas taxas de sobrevivência [26]. No entanto, o mecanismo subjacente a relação entre o cancro oral e DM não tem sido elucidado. Este é o primeiro estudo a investigar uma potencial relação entre AGEs e câncer oral. Realizamos essa pesquisa para identificar o papel do sistema de AGE-RAGE no câncer oral, e para elucidar a relação entre o câncer oral e DM

Os pesquisadores têm relatado anteriormente que AGEs e RAGE regular a migração de células [15]. – [17], [33]. Os resultados confirmam que os produtos FGA melhorar a migração de células e também mostram que os AGEs reduzir a viabilidade celular. Takino et ai. resultados semelhantes obtidos utilizando produtos FGA derivados gliceraldeído-[17]. Além disso, Bhawal et ai. informou que RAGE está intimamente associada com a invasão de câncer oral [15], e os nossos resultados mostram que AGEs regulam a migração celular através da expressão de RAGE. Em um ambiente clínico, a expressão de MMP2 e MMP9 apareceu a estar estreitamente relacionado com metástase no câncer oral [34], [35]. Os AGEs têm sido ainda demonstrado que o aumento da secreção de MMP2 [17] e regular a expressão de MMP9 [36], [37] através da via de ERK [23], [38]. Os resultados suportam estes constatação anterior; especificamente, que a fosforilação ERK e a expressão de MMP2 e MMP9 são regulados por idades. Além disso, CD44 é um fator de migração relacionada com Raiva [39]. No entanto, não conseguimos diferença significativa observada na expressão de CD44 após o tratamento AGEs (dados não mostrados). Um relatório semelhante confirmou que a expressão de CD44 não é afectado por produtos FGA [40]. Isto sugere que os AGE-RAGE regular a migração de células através de uma via que não é dependente de CD44

Estudos recentes têm sugerido que o RAGE é um receptor múltiplos que regula a proliferação celular por meio do seu ligando (S100 ou HMGB1) [41]. – [43]. Xu et al. e Meghnani et ai. Também sugerem que o RAGE aumenta a proliferação celular e vias relacionadas [44], [45]. Além disso, HMGB1 foi encontrado para regular a proliferação celular e metástase via RAGE ea atividade inibitória melanoma (MIA) via no câncer oral [46]. Em nosso estudo, idades e BSA parecem diferir em seus efeitos sobre as células SAS. As idades foram mostrados para diminuir o número de células; No entanto, aumentou-BSA. Mais especificamente, neste estudo as células foram incubadas durante 24 horas antes do tratamento isento de soro; assim BSA pode ter agido como um fator de crescimento. A nossa descoberta de que os produtos FGA diminuíram o número de células, aumentando a fosforilação de ERK, indica claramente que os produtos FGA diferem nos seus efeitos sobre as células. Valência et ai. também demonstraram que as vias divergentes de expressão de genes são activados pelo ligando RAGE S100 e idades [47]. Assim, os efeitos do sistema de AGE-RAGE diferem dos de outros ligandos

O uso de PD98059 para bloquear a via ERK resultou na supressão da migração das células e também reduziu a expressão de MMP2 e de MMP9.; No entanto, não se observou qualquer diferença no que diz respeito à influência de AGEs no aumento da expressão de RAGE. O uso de anticorpos RAGE e RNAi para bloquear a via AGEs-RAGE resultou na fosforilação ERK inibida e migração celular e também reduziu a expressão de MMP2 e MMP9. Estes resultados demonstram que os efeitos de AGEs sobre a migração de células ocorrem via ERK fosforilação. Curiosamente, um estudo clínico prévio sugere que o aumento nos níveis de raiva em cancro correlacionada com metástases [15], [33]. Em outros modelos de células, RAGE apareceu para regular a migração celular [15], [48], [49]. Os nossos resultados mostram que os efeitos de migração celular RAGE ARNi influência, a fosforilação de ERK, e expressão de MMP9 independentemente. Esta descoberta fornece suporte adicional para a afirmação de que RAGE medeia metástases através da expressão de MMP9 através da via ERK.

Neste relatório, AGEs diminuiu a viabilidade celular e migração celular reforçada, promovendo ao mesmo tempo a fosforilação ERK e aumentar a expressão de MMP2 e MMP9. PD98059, o anticorpo RAGE, e RNAi foram mostrados para mediar regulação AGE. Este é o primeiro estudo a demonstrar que a raiva regula a expressão de MMP9 através da via de ERK. Mais importante, nós demonstramos o papel que AGE-RAGE desempenha na malignidade do câncer bucal através da ERK regulação e vias a jusante, em última análise, afetando migração celular no cancro oral. O mecanismo pelo qual as funções do sistema AGE-RAGE no nosso

modelo in vitro

de câncer oral é apresentada na Fig. 6. AGEs aumentam a expressão RAGE, que estimula a via de jusante da fosforilação ERK e resulta em regulação para cima da MMP2 e MMP9. Isto por sua vez aumenta a migração celular, que se manifesta na malignidade do cancro. Estas descobertas explicam por que os casos de câncer oral concomitante com DM apresentam aumento da invasão câncer e as taxas de sobrevivência reduzidas. Os resultados também indicam que o acúmulo de AGEs devido ao envelhecimento ou DM aumenta a probabilidade de desenvolver cancro maligno.

AGEs aumentam a expressão RAGE e estimular a via de jusante da ERK fosforilação. Isso tem o efeito de regular MMP2 e MMP9 expressão e melhorar a migração de células, que se manifesta como malignidade.

Informações de Apoio

Figura S1.

Encerramento da área de migração celular. área de migração foi medida utilizando o ImageJ e quantificada por mudanças gravação na área da ferida. Produtos FGA diminuíram significativamente o tamanho da área da ferida, enquanto que PD98059, anticorpo RAGE e RAGE ARNi suprimida migração em 4 horas. A análise foi conduta por ANOVA one-way, e o resultado foi estatisticamente significativa (p 0,0001)

doi: 10.1371 /journal.pone.0110542.s001

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Figura S2.. Funcionalmente

de MMP 2 e MMP 9. Após o tratamento das células com SAS idades (400 ug /ml) durante 0,5-4 horas, foi detectada a expressão de ERK fosforilação. O funcionalmente de MMP 2 e MMP 9 foram detectados por zymorgraphy após o tratamento AGEs para 4 ou 24 horas. Os resultados mostram que a fosforilação de ERK AGEs aumentada (A). MMP 2 e MMP 9 foram aumentadas em AGEs às 4 horas, mas apenas MMP 2 foi aumentada às 24 horas (B)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110542.s002

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