Abstract

Fundo

O fator de transcrição Snail1 induz epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT), um processo responsável para a aquisição de capacidade de invasão durante a tumorigênese. Vários estudos têm relatado transcriptomic genes Snail1 regulamentados em diferentes tipos de células, muitos deles envolvidos na adesão celular. No entanto, poucos estudos têm utilizado proteómica como uma ferramenta para a caracterização de proteínas mediadoras EMT.

Metodologia /Principais Achados

identificado por análise proteômica usando 2D DIGE eletroforese combinado com MALDI- TOF-TOF e espectrometria de massa de armadilha de iões ESI-linear de uma série de proteínas com funções variáveis ​​cuja expressão é modulada por Snail1 em células de cancro de cólon humano SW480-ADH. A validação foi realizada por análises de Western blot e imunofluorescência. Snail1 reprimido vários membros da família de proteínas de ligação /fosfotreonina fosfoserina 14-3-3 e também a expressão da proteína associada à proliferação 2G4 (PA2G4) que foi localizada principalmente nos corpos de Cajal nucleares. Em contraste, a expressão de duas proteínas envolvidas no processamento de ARN, a especificidade de clivagem e poliadenilação factor de subunidade 6 (CPSF6) e a emenda do factor de prolina /(SFPQ) ricos em glutamina, foi mais elevada em células que expressam Snail1 do que nos controlos. A regulamentação da 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ e PA2G4 por Snail1 foi reproduzida em células cancerígenas do cólon HT29. Além disso, encontramos uma correlação inversa entre 14-3-3σ e expressão Snail1 em tumores colorretais humanos.

Conclusões /Significado

Nós identificamos um conjunto de novas proteínas-alvo Snail1 no câncer de cólon que expandem os processos celulares afetados pela Snail1 e, assim, a sua relevância para a função celular e fenótipo

Citation:. Larriba MJ, Casado-Vela J, Pendas-Franco N, Peña R, García de Herreros a, Berciano MT, et ai. (2010) Novos Snail1 alvo proteínas no câncer de cólon humanas identificadas pela análise proteômica. PLoS ONE 5 (4): e10221. doi: 10.1371 /journal.pone.0010221

editor: Juan Valcarcel, Centro de Regulació GENOMICA, Espanha |

Recebido: 04 de março de 2010; Aceito: 26 de março de 2010; Publicação: 20 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Larriba et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Ciencia e Innovación de Espanha (SAF2007-60341, BIO2006-07689, ISCIII-RETIC RD06 /0020/0009 e RD06 /0020/0040), Comunidad de Madrid (S-GEN-0266/2006) e a União Europeia (MRTN-CT-2005-019496, NucSys). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o factor de transcrição Snail1 regula a biologia de fibroblastos e a sua regulação positiva em células epiteliais provoca uma alteração de um fenótipo mesenchymatic, um processo conhecido como epitelial-mesenquimal-a transição (EMT). Esta é uma mudança transdiferenciação, em células epiteliais que perdem a adesividade e a polaridade e adquirir a morfologia característica fuso e capacidade migratória de fibroblastos como um resultado de uma alteração drástica do perfil da expressão do gene [1], [2]. EMT desempenha funções fisiológicas importantes durante a embriogénese e cicatrização de feridas, e também é crucial para a aquisição da capacidade de invasão tumoral, o passo inicial da cascata metastática do cancro em [1], [2].

Snail1 parece ter um função de mestre de EMT, apesar de vários outros fatores, como Snail2 (Slug), Zeb1 (δEF1), Zeb2 (SIP1), TWIST1, E47 e E2-2 também são conhecidos por induzir ou contribuir para a EMT em diferentes tipos de células [2 ], [3]. Estes factores promovem parcialmente diferentes perfis de expressão de genes que têm em comum a repressão de genes que codificam proteínas de adesão (E-caderina, ocludina e vários claudinas) e a indução de marcadores de mesenquimais, tais como vimentina, fibronectina, e proteases e factores que promovem o movimento de células [ ,,,0],3], [4]. Snail1 foi o primeiro repressor caracterizado do gene supressor de invasão

CDH1

que codifica para a proteína de adesão de E-caderina fundamental [5], [6]. Além disso, Snail1 foi recentemente mostrado activar a via Wnt /β-catenina sinalização e factor nuclear

actividade kappa B [7], [8], e que anula a inibição da via Wnt /β-catenina via causada pela o composto antitumoral 1α, 25-hidroxivitamina D

3 [9].

Snail1 é regulada em vários cancros humanos e é frequentemente associada a invasão, metástases e mau prognóstico [3]. Snail1 ARN é indetectável em mucosa de cólon normal, mas torna-se regulada positivamente em 60-70% dos cancros do cólon [10] – [12]. Um estudo recente mostrou que a proteína é expressa Snail1 em 79% dos tumores do cólon, geralmente na interfase do tumor de estroma. Snail1 é encontrada, tanto no tecido de tumor epitelial e do estroma adjacente em 56% dos tumores do cólon, enquanto que em 21% dos casos, está presente apenas em células do estroma com fenótipo fibroblástica [13].

Um número de estudos focaram-se na análise do transcriptoma do EMT promovido por Snail1 e outros factores de transcrição, ou pelos genes ou agentes, tais como Ras oncogénicos ou transformação de β factor de crescimento que lhes induzidas [4], [14] – [17]. No entanto, poucos estudos têm utilizado proteómica como uma ferramenta para a caracterização de proteínas mediadoras EMT [18]. A maioria destes estudos empregaram 2D-PAGE seguida por espectrometria de massa MALDI-TOF para identificação de proteínas diferencialmente expressas em tecidos de tumor e /ou linhas de células [18] – [20]. Alguns estudos têm usado a tecnologia iTRAQ seguida de separação 2D-LC de peptídeos e espectrometria de massa [18], [21], [22]. Aqui, utilizou-se a tecnologia 2D-DIGE seguido por MALDI-TOF-TOF e espectrometria de massa de armadilha de iões ESI-linear. A combinação dessas técnicas é um método mais sensível e de confiança para a identificação de pequenas diferenças na expressão de proteínas entre as células de cancro do cólon humanos com níveis baixos ou altos de Snail1. Estas técnicas têm nos dado a oportunidade de dar uma visão mais profunda sobre as alterações proteômicas associados à Snail1 superexpressão. Neste estudo, identificamos uma série de proteínas anteriormente desconhecidos como alvos Snail1 em células cancerígenas do cólon humano. Alguns deles estão envolvidos no controle da expressão gênica celular e fenótipo, e são mediadores prováveis ​​da acção tumorigénico do Snail1.

Resultados

A maioria dos genes previamente caracterizados na forma regulamentada pelo Snail1 membrana codificam plasma proteínas envolvidas na adesão celular ou componentes do citoesqueleto. Para ampliar o nosso conhecimento dos efeitos Snail1 no câncer de cólon humano, empregamos uma estratégia integradora para identificar proteínas nucleares regulamentadas por Snail1 nesta neoplasia (Figura 1A). Utilizou-se electroforese 2D-DIGE combinado com MALDI-TOF-TOF e espectrometria de massa de armadilha de iões ESI-linear para comparar o padrão de proteínas presentes em extractos nucleares a partir de células SW480-ADH de cancro de cólon humano que expressa um retroviralmente transduzidas (células Snail1) de ADNc Snail1 com a das células falsamente infectadas (células Mock). Um subconjunto das proteínas identificadas foi validado por Western blot e análise de imunofluorescência de células cancerígenas do cólon humano, e por imuno-histoquímica de biópsias de cólon humano. Temos anteriormente caracterizado o modelo celular usada neste estudo [7], [10] e constatou que Snail1 superexpressão promoveu a aquisição de uma morfologia mais células estreladas (Figura 1B), a repressão dos marcadores epiteliais de E-caderina, ocludina e claudina -7, e a indução da proteína mesenquimais Lef-1 (Figura 1C).

(a) Esquema de o fluxo de trabalho seguido neste estudo. (B) micrografias representativas de contraste de fase (painéis superiores) e imagens de imunofluorescência confocal a laser que mostram coloração F-actina (painéis inferiores) de células SW480-ADH Mock e Snail1. Barra de escala, 20 ^ M (painéis superiores) e 10 uM (painéis inferiores). (C) análise de transferência de Western de extractos de células completas a partir de SW480-ADH Mock e células Snail1 mostrando Snail1 superexpressão e o seu efeito sobre a expressão de células epiteliais (E-caderina, ocludina e Claudina-7) e mesenquimais (Lef-1) marcadores. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga.

Análise da expressão diferencial de proteínas de frações nucleares de células cancerígenas do cólon humano com alta ou baixa expressão Snail1

Os extractos nucleares de SW480-ADH Mock e as células foram analisadas por Snail1 2D-DIGE como descrito em Materiais e Métodos. mudanças no padrão de proteína foram quantitativamente e analisados ​​estatisticamente usando o software v.6.5 DeCyder considerando os 12 mapas pontuais incluídos no estudo. A Figura 2 mostra um mapa 2D representante das proteínas de SW480-ADH nucleares. Cada gel foi analisada individualmente para calcular os rácios de volume entre amostras individuais e o pool interno, o qual foi utilizado como padrão de referência. Em seguida, todas as imagens foram combinadas e analisadas em conjunto, utilizando o módulo BVA. Foram observadas algumas variações na abundância de proteína entre as células Mock e Snail1. A emparelhado

t

-test foi usado para selecionar 22 pontos cujas variações de expressão entre os dois tipos de células foi estatisticamente significativa (de Student

t

-teste,

p Art 0,05) . Estas manchas foram seleccionados como pontos de interesse e anotada no gel principal (Figura 2). Identificação de proteínas foi realizada por dois métodos: (1) as impressões digitais da massa dos péptidos utilizando MALDI-TOF-TOF e (2) armadilha de iões ESI-linear e sequenciação peptídica MS /MS (aplicando uma taxa restritiva falso positivo descoberta (FDR) de corte, FDR≤1%). Em ambos os casos, a identificação com mais do que um péptido era um requisito. Ao utilizar esta abordagem dupla, 19 proteínas foram identificados em 17 dos 22 locais (Tabela 1). Apenas cinco proteínas foram identificadas por MALDI-TOF-TOF, devido aos baixos níveis de expressão. Dezoito proteínas foram identificadas por armadilha de iões ESI-linear, com dois pontos que continham mais do que uma proteína. Nesses casos, as proteínas foram listadas de acordo com o número de péptidos identificados. Quatro proteínas foram identificados por ambas as técnicas (Tabela 1).

Os extractos nucleares de SW480-ADH Mock e células Snail1 foram diferencialmente marcada com Cy3 e Cy5 corantes. Um padrão interno, combinando proteínas a partir de ambos os extractos foi incluído em todos os géis após marcação com Cy2 corante. 3-10 tiras de IPG NL foram usadas para o padrão de IEF e SDS-PAGE para a segunda dimensão. Representante imagem 2D mostra o mapa mancha correspondente ao padrão interno, que é comum a todos os geles analisados. Pontos indicados com setas foram informativo para a identificação das proteínas por espectrometria de massa (ver Tabela 1 para atribuição de código). pontos selecionados mostrou uma variação estatística dos índices de volume dentro do nível 95 de confiança (Student

t

-teste,

p Art 0,05).

análise ontologia proteína de proteínas identificadas

Entre as proteínas alteradas por Snail1 superexpressão nós identificados α-catenina (CTNNA1), o PI3K α subunidade reguladora (PIK3R1), caldesmona (CALD1), a clivagem e fator de especificidade de poliadenilação subunidade 6 (CPSF6) e vimentina (VIM) como proteínas regulados positivamente; e a proliferação associada à proteína 2G4 (PA2G4, também conhecida como proteína de ligação a ErbB3 ou EBP1 1), proteína activada por GTPase específica-Ran (RANBP1), e vários membros da família da proteína 14-3-3 (YWHAE, YWHAH e YWHAQ ) entre as proteínas regulados negativamente (Tabela 1). Apesar de trabalhar com extratos nucleares, apenas 7 das 19 proteínas foram designados para o compartimento nuclear (CPSF6, WTAP, ENO1, PA2G4, HNRNPH3, RANBP1 e PPIA), enquanto os restantes eram preferencialmente citosólico ou associada ao citoesqueleto. No entanto, não podemos descartar que as últimas proteínas foram parcialmente ou temporariamente presentes no compartimento nuclear. Em relação à função biológica, várias proteínas foram envolvidos na adesão celular (CTNNA1) ou componentes do citoesqueleto (CALD1, VIM e LASP1). No entanto, a maior parte das proteínas foram implicados na transdução de sinal (PI3KR1, RANBP1 e os membros da família 14-3-3) e processamento de RNA (CPSF6, WTAP e HNRNPH3) (Tabela 1). Algumas destas proteínas foram seleccionadas para validação. Dada a elevada homologia existente entre as proteínas 14-3-3 e entre alguns dos péptidos identificados (isto é, para -VISSIEQK- 14-3-3τ e -VLSSIEQK- para 14-3-3σ, o que os torna virtualmente indistinguível), nós decidiu-se incluir todos os membros da família na validação análises.

validação de proteínas alvo candidatos

para uma estimativa quantitativa da expressão das proteínas alvo candidato em SW480-ADH Mock e Snail1 As células, foram analisados ​​por três extractos nucleares preparados de Western blot, independentemente, (N1, N2, N3). Além disso, os extractos citosólicos a partir de uma das experiências (C1) foram incluídos na análise (Figura 3A). downregulation variável (20% a 70%) de 14-3-3 β, ε, σ, proteínas e τ Ç foram encontradas no núcleo das células Snail1. Para todas elas, excepto 14-3-3σ a regulação negativa era mais fraca no citosol do que no núcleo (Figura 3A). Temos sido incapazes de detectar expressão 14-3-3η nem no núcleo ou no citoplasma, ao passo que a de 14-3-3γ não foi afectada pela sobreexpressão Snail1 (dados não mostrados). PA2G4 expressão foi também inferior, em ambos núcleo e citosol de SW480-ADH Snail1 do que em células Mock (Figura 3A).

(A) análise de transferência de Western da expressão das proteínas seleccionadas em citosólica (C) e nuclear ( N) extratos de células SW480-ADH Mock e Snail1. isoformas HNRNPH3 (1-4) são indicadas. Os números abaixo dos géis indicam a quantificação da alteração na expressão entre Snail1 e células falsamente após a normalização para a p-tubulina ou lamina B (citosólicas e nucleares controlo, respectivamente). A significância estatística das mudanças de expressão nucleares promovidos pela Snail1 foi avaliada por bicaudal de Student não pareado

t

-teste. Foi

p Art 0,001 para 14-3-3ε, 14-3-3σ, 14-3-3ζ, CPSF6 e as isoformas 3 e 4 do HNRNPH3;

p Art 0,01 para 14-3-3τ; e

p Art 0,05 para 14-3-3β e PA2G4. A regulamentação da SFPQ (p = 0,057

) e que das isoformas 1 + 2 de HNRNPH3 (

p

= 0,058) não atingiu a significância estatística, mas uma clara tendência foi observada. (B) análise por Western blot da expressão de proteínas seleccionadas em citosólica (C) e as fracções nuclear (N) de células HT29 Mock e Snail1. Os números abaixo dos géis indicam a quantificação da alteração na expressão entre Snail1 e células falsamente após a normalização para a p-tubulina ou lamina B (citosólicas e nucleares controlo, respectivamente). estudo (C) RT-PCR quantitativa de expressão PA2G4 em SW480-ADH e células HT29 Mock e Snail1. 18S rRNA foi usado para a expressão de normalização. A significância estatística foi avaliada por

t

-teste, único asterisco indica

p

. 0,05

Por outro lado, o nível de CPSF6 foi mais elevada em células do que em células Snail1 Mock (Figura 3A). Analisamos também a expressão de emenda fator de prolina /-glutamina rica (SFPQ), uma proteína encontrada 1,59 vezes em regulada na análise proteômica, mas ausente da Tabela 1 porque só foi identificado com um peptídeo no local 609. Fizemos isso porque ambos SFPQ e CPSF6 estão envolvidos no processamento de pré-mRNA e localizada em paraspeckles nucleares [23], o que sugere um possível efeito coordenado de Snail1. Na verdade, descobrimos que Snail1 aumento da expressão SFPQ nuclear e também o baixo nível de SFPQ detectado no citoplasma (Figura 3A).

O regulamento por Snail1 foi complexa no caso do heterogêneo H3 ribonucleoprote�a nuclear (HNRNPH3) , a qual apresenta várias isoformas resultantes de splicing alternativo [24]. Os péptidos utilizados no estudo para identificar proteomic HNRNPH3 indicam que o local downregulated só pode corresponder a isoformas 1, 2 ou 3. A análise por Western blot mostrou que a expressão de isoformas 1 e 2 (PM previsto de 36,9 e 35,2 kDa, respectivamente) foi regulada positivamente por Snail1, enquanto que as isoformas de 3 e 4 (PM previsto de 31,5 e 22,3 kDa, respectivamente) foi fortemente regulada negativamente em ambos núcleo e citosol de células Snail1 (Figura 3A). Portanto, a proteína identificada na análise proteômica deve ser isoforma 3 de HNRNPH3.

A repressão do 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ e PA2G4 por Snail1 em extratos nucleares foi reproduzida em duas experiências independentes em uma outra linha de células de cancro do cólon humano, HT29 (Figura 3B). Além disso, a análise quantitativa de RT-PCR revelou uma diminuição do nível de ARN PA2G4 em ambas as células HT29 expressam Snail1 SW480-ADH e em comparação com as suas respectivas células Mock (Figura 3C).

distribuição subcelular de proteínas alvo Snail1

A expressão de algumas das proteínas alvo Snail1 validados por Western blot foi ainda estudada por imunofluorescência e analisa microscopia confocal. Como mostrado na Figura 4, o nível de 14-3-3 β, ε e σ foi muito mais baixa em ambos núcleo e citosol de células SW480-ADH Snail1 do que em células falsamente. Em todos os três casos, a expressão foi mais elevada no citosol do que no núcleo com uma proporção variável: β σ ε. Análise por imunofluorescência também mostrou uma redução de ambos expressão nuclear e citosólica de células em PA2G4 Snail1 em comparação com células falsamente (Figura 5A). A expressão de PA2G4 tinha um padrão fino punctata em ambos núcleo e citosol, e foi particularmente forte em poucos rodada e bem definida focos nuclear de cerca de 0,5 um de diâmetro (Figura 5). coloração dupla com anticorpos contra Coilin (marcador de corpos de Cajal), o TMG-cap de snRNAs spliceosomal (marcador de corpos de Cajal e manchas nucleares de factores de splicing), fibrilarina (marcador de nucléolo) e PML (marcador de corpos PML) indicou que a focos nucleares PA2G4-positivos correspondem a corpos de Cajal (Figura 5B). Este resultado foi confirmado em neurónios (dados não mostrados), o tipo de célula em que os corpos de Cajal são mais proeminentes [25]. A função mais bem compreendido de corpos de Cajal é a biogênese de pequenas nuclear e RNPs nucléolo (snRNPs, snoRNPs) envolvido na pré-mRNA splicing e processamento de pré-rRNA, respectivamente [25], [26]. As experiências de dupla marcação, também mostrou uma fraca coloração de PA2G4 no nucléolo (ver Figura 5B, PA2G4 e co-coloração fibrilarina), tal como foi anteriormente descrito [27].

Imagens de microscopia confocal que mostram a expressão representativos e localização de 14-3-3 β, ε e σ (vermelho) em células SW480-ADH Mock e Snail1. expressão da GFP (verde) foi inalterada pela Snail1 e foi utilizada como um controlo. Barra de escala, 10 ^ m.

(A) imagens de microscopia confocal representativos mostrando a expressão e localização de PA2G4 (vermelho) em células SW480-ADH Mock e Snail1. expressão da GFP (verde) foi inalterada pela Snail1 e foi utilizada como um controlo. barra de escala, 5 mm. (B) imagens de microscopia confocal representativos mostrando dupla imunomarcação para PA2G4 (vermelho) e de marcadores moleculares (azul) de corpos de Cajal (Coilin), corpos de Cajal e manchas nucleares de factores de splicing (TMG-CAP), nucléolo (fibrilarina) e PML corpos (LMP) em células Mock SW480-ADH. A cor-de-rosa nas imagens de mesclagem indica a existência de co-localização. barra de escala, 5 mm.

Análise de tumores do cólon humanos

A repressão de vários 14-3-3 membros da família por um fator de transcrição associado ao tumor, como Snail1 nos levou a estudar a expressão destas proteínas em cancro do cólon humano. Como 14-3-3σ era o membro que a expressão foi mais fortemente reprimida por Snail1 tanto no núcleo e no citoplasma, que selecionou para o estudo em amostras humanas. Primeiro, analisou-se a expressão por imuno-histoquímica em 14-3-3σ uma matriz de tecido contendo emparelhado amostras normais e tumorais a partir de 46 pacientes com cancro colo-rectal, e descobriram que 14-3-3σ foi altamente expressa por ambas as células epiteliais normais e de tumor, mas não por estroma células (Figura 6A). Como esse padrão de 14-3-3σ expressão era coerente com sua repressão por um indutor da EMT como nos Snail1, decidimos realizar um estudo mais detalhado de 14-3-3σ e expressão Snail1 em fatias consecutivas de cinco biópsias de tumores de cólon. De acordo com estudos anteriores [13], nós, principalmente encontrados Snail1 imunorreatividade no núcleo das células com o fenótipo mesenquimal dentro do tumor (Figura 6B). Estas células podem corresponder a células epiteliais tumorais que tenham sido submetidos a EMT e /ou fibroblastos que foram activadas pelo microambiente tumoral [13]. Por conseguinte, com os dados obtidos a partir da matriz tecidual, foi expressa em 14-3-3σ ambos núcleo e citosol de células epiteliais de tumor, mas que estava ausente nas células do estroma (Figura 6B). Portanto, 14-3-3σ e Snail1 têm padrões de expressão opostos (epiteliais e estromais, respectivamente) em câncer de cólon. Além disso, a expressão 14-3-3σ se assemelha de perto a do gene alvo Snail1

CDH1

/E-caderina e, como proposto para este gene, é possível que reprime a expressão Snail1 14-3-3σ em mesenquimais células. imagens Imuno-histoquímica

(a) mostrando a expressão 14-3-3σ em amostras normais e tumorais de cólon representativos dos 46 analisados ​​na matriz tecidual. As barras indicam a ampliação. As secções foram contrastadas com hematoxilina. Imagens (B) Imuno-histoquímica que mostra a expressão e 14-3-3σ Snail1 em duas fatias consecutivos de um tumor do cancro do cólon representativas dos cinco analisados. As barras indicam a ampliação. As secções foram contrastadas com hematoxilina. painéis direitos são um 3X-magnificação da região indicada nos painéis esquerdos.

Discussão

Identificar proteínas reguladas por Snail1 amplia o conhecimento actual sobre a biologia deste factor de transcrição e lança nova luz sobre os mecanismos de EMT e progressão do câncer. Nós escolhemos o cancro do cólon como um sistema de trabalho porque Snail1 é regulada a nível RNA e proteína neste neoplasia e contribui para a sua malignização [10] – [13]. Anteriormente, os perfis de expressão de genes induzidos por Snail1 em sistemas diferentes foram estudadas por análises transcriptomic, e a maioria dos genes alvo Snail1 detectados codificados para proteínas envolvidas na adesão celular, matriz extracelular e o citoesqueleto [4], [15], [28] . Neste estudo, foi realizada uma análise proteômica de extratos nucleares destinadas a identificar novas proteínas reguladas por Snail1 que poderia mediar os seus efeitos amplos sobre a fisiologia celular e fenótipo.

O nosso estudo mostra uma conservação notável no padrão global de armas nucleares a expressão da proteína em células cancerígenas do cólon humano que expressam níveis elevados ou baixos de Snail1. Ainda, uma série de proteínas reguladas por Snail1 descaracterizados anteriormente implicados em diversas funções celulares foram identificados. Vinte e dois pontos foram encontrados como significativamente desregulamentado entre os dois tipos de células com um

p Art 0,05 (Student

t

-teste). Dezanove proteínas diferentes foram identificadas, a maior parte deles, utilizando o instrumento de armadilha de iões ESI-linear em combinação com um nano-HPLC. Apenas cinco proteínas foram identificadas por MALDI-TOF-TOF, provavelmente devido à baixa expressão das proteínas presentes nas manchas. Dois pontos (1419 e 1926) continham mais de uma proteína. No entanto, no local 1419, vimentina era significativamente mais abundante (com base no número de péptidos de identificação) do que as outras proteínas e que lhe é atribuído a diferenças na expressão. Em lugar de 1926, o número de peptídeos identificados foi bastante semelhante entre LASP1 e HNRNPH3, tornando mais difícil a atribuição da expressão diferencial.

Nossos resultados concordam com o papel repressor da transcrição do Snail1, como em 12 dos 17 pontos com as proteínas identificadas a expressão foi mais baixa em células do que em células que expressam Snail1 Mock, enquanto apenas em cinco deles a expressão foi mais elevada em células Snail1. A repressão das proteínas downregulated pode ser um efeito directo de Snail1, especialmente no caso de PA2G4 cujo nível de ARN foi também reduzida por Snail1. Por outro lado, a indução da expressão de proteínas por Snail1 deve ser indirecto, mediado por outros factores de transcrição, tal como foi relatado para metaloproteases de matriz 2 e 9 [29], [30]. Além disso, descobrimos que Snail1 altera o padrão de splicing de HNRNPH3 em células SW480-ADH. Isto está de acordo com estudos descrevendo que Snail1 muda o padrão de splicing de p120-catenina e

zônula occludens

-1 por mecanismos descaracterizados [31], [32].

De acordo com anterior estudos transcriptomic, mostramos aqui que Snail1 muda a expressão de proteínas envolvidas na adesão celular e citoesqueleto (CTNNA1, CALD1, VIM e LASP1). Além disso e para nosso conhecimento, pela primeira vez, informamos que Snail1 regula proteínas envolvidas em outras funções celulares como a maturação do RNA (CPSF6, HNRNPH3 e SFPQ) e sinalização intracelular (PI3KR1, RANBP1 e 14-3-3 família de proteínas). O efeito repressivo quase geral de Snail1 sobre a expressão de membros da família 14-3-3 é surpreendente e concorda com o papel protector de cancro recentemente proposto de algumas destas proteínas [33], [34]. As proteínas 14-3-3 foram durante muito tempo conhecido como proteínas de ligação a fosfo-serina /fosfotreonina capazes de se ligar e modular a interacção entre as proteínas e envolvidos em processos celulares como a sinalização, de controlo do ciclo celular, a apoptose, o tráfico intracelular, a estrutura do citoesqueleto e a transcrição [34 ], [35]. Só nos últimos anos, diversos membros da família 14-3-3 têm sido associados a uma variedade de processos de cancro. Enquanto 14-3-3σ tem sido proposto como um gene supressor de tumor que é silenciada ou inactivada durante a progressão do melanoma e mama, gástrico, hepatocelular, carcinoma de células escamosas do ovário e [33], [36] – [40]; verificou-se ser sobre-expresso em cancro pancreático [41]. Além disso, uma análise proteomic mostraram que a expressão é regulada negativamente 14-3-3σ em carcinomas de células transicionais invasivo da bexiga urinária submetidas EMT [19]. Isto está de acordo com os nossos dados de biópsias de cólon humano que mostram um padrão de expressão oposto do 14-3-3σ e Snail1. Notavelmente, 14-3-3 ε, ζ e η pode formar um complexo ternário com chibby e β-catenina facilitar a exportação nuclear de β-catenina, antagonizando assim a sua actividade de transcrição que é um motor importante no câncer de cólon [42]. Contrariamente, 14-3-3ζ coopera com ErbB2 para promover EMT e progressão de carcinomas de mama ductais para câncer invasivo [43], e seus associados superexpressão com recorrência do câncer de mama [44]. Neste estudo, identificamos 14-3-3 β, ε, σ, τ e ζ como reprimidos após expressão Snail1 em células cancerígenas do cólon humano. A acção das proteínas 14-3-3 pode ser modulada pela interacção com diferentes parceiros de uma forma espacialmente e temporalmente e é também sujeito a regulação por fosforilação. Por conseguinte, o mesmo membro da família pode ter vários 14-3-3 e mesmo opostas funções que fazem a análise do efeito de 14-3-3 proteínas individuais muito complexo e depende da integração de sinais adicionais [45]. Portanto, é difícil prever o papel destas proteínas em ação Snail1 em câncer de cólon, que podem estar relacionados com as mutações normalmente presentes neste neoplasia.

Nós descobrimos que Snail1 reprime também expressão PA2G4 no câncer de cólon humano células. Esta proteína interage com o domínio citoplasmático do receptor de transdução de sinal ErbB3 downregulating ErbB e heregulina-atenuando o crescimento orientado de células de cancro da mama [46], [47]. PA2G4 situa-se não só no citosol, mas também no núcleo, onde ele se comporta como uma proteína pleiotrópico que interage com um número de proteínas e ARN envolvidos na regulação da transcrição e tradução de controlo [48], [49]. Assim, PA2G4 inibe E2F1- e transcrição mediada por receptor de androgénio através da sua interacção com a proteína do retinoblastoma, receptor de androgénio, várias histonas desacetilases e sin3a [50] – [53]. A localização de PA2G4 em corpos de Cajal que temos agora relatado sugere que esta proteína multifuncional também está envolvida na maturação de ARNnp e snoRNA. Além disso, a sobre-expressão PA2G4 induz a diferenciação de células de cancro da mama humano [54], inibe a proliferação de fibroblastos humanos, e suprime o crescimento e a metástase de células de carcinoma salivares adenóides císticos [55]. A partir de todos estes estudos é concebível que PA2G4 repressão pode contribuir para a acção de Snail1 tumorigénico.

Curiosamente, Snail1 regula positivamente a expressão de proteínas e CPSF6 SFPQ envolvidas no splicing e poliadenilação de ARN, respectivamente [56], [57 ]. Ambas as proteínas foram encontradas recentemente para estar presente em paraspeckles, um compartimento subnuclear proposto ser o site para o processamento e a retenção de [23] de pré-ARNm. De nota, tanto CPSF6 e SFPQ são parceiros de fusão para tirosina-quinases em doenças hematológicas malignas [58]. Snail1 também altera o padrão de splicing de HNRNPH3, outra proteína envolvida no processo de splicing [24]. Curiosamente, as isoformas HNRNPH3 induzidas por Snail1 contêm duas cópias de um domínio (motivo de reconhecimento de RNA) de ligação a ARN comumente encontrados em proteínas que se ligam a RNA de cadeia simples, enquanto que os isoformas reprimidos por Snail1 conter apenas um [24]. No entanto, a consequência funcional desta diferença é desconhecida. Portanto, nosso estudo indica que Snail1 podem modular vários passos na maturação do RNA, tais como poliadenilação e splicing e estabilidade para mRNA e tradução. No seu conjunto, estes dados sugerem que, em adição à sua actividade de repressão de transcrição reconhecidos, Snail1 pode regular a expressão do gene de pós-transcricionalmente através da modulação do nível de proteínas envolvidas no pré-processamento de mRNA e a localização.

Em conclusão, os nossos resultados implicam Snail1 como um regulador de funções celulares anteriormente imprevisíveis além de adesão intercelular e a morfologia das células. O estudo aprofundado dos mecanismos de ação das proteínas-alvo Snail1 recentemente identificados contribuirá para definir a atividade biológica complexa precisa de Snail1 e assim as perspectivas do processo de EMT durante a embriogênese e tumorigênese.

Materiais e métodos

declaração Ética

Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na declaração de Helsinki. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Salud Carlos III (Madrid, Espanha) e da Comissão de Ética para a Investigação Clínica do Instituto Municipal d’Assistència Sanitária (Barcelona, ​​Espanha). Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análise posterior.

células cancerosas cultura celular

SW480-ADH e HT29 cólon humano expressando estavelmente Snail1 (células Snail1) ou um vector vazio ( células Mock) foram gerados por transdução retroviral, utilizando vectores de pRV-Snail1-IRES-GFP (células Snail1) ou pRV-IRES-GFP (células Mock) como já anteriormente relatada [10].