Sumário
Fatty sintase de ácido (FASN) expressão é elevado em vários tipos de câncer, e esta expressão sobre-está associada com mau prognóstico. Inibidores de FASN, tais como orlistat, mostram alegadamente efeitos antitumorais contra cânceres que FASN sobre-expresso, fazendo FASN um alvo terapêutico promissor. No entanto, foram observadas grandes variações nos níveis de expressão FASN em tumores individuais e métodos para prever o resultado terapia alvo-FASN antes do tratamento são necessários para evitar tratamento desnecessário. Além disso, como a inibição FASN afecta a progressão do tumor permanece obscura. Aqui, mostramos o método para prever o resultado da terapia alvo-FASN utilizando o consumo de etilo radiomarcado e mecanismos de inibição apresentados FASN com linhas celulares de cancro da próstata humano, para proporcionar a estratégia de tratamento de terapia direcionada-FASN. Nós revelou que a absorção de tumor de acetato radiomarcado refletiu os níveis de expressão FASN e sensibilidade à terapia alvo-FASN com orlistat
in vitro
e
in vivo
. terapia FASN-alvo era notavelmente eficazes contra tumores com expressão alta FASN, que foi indicado pela elevada absorção de acetato. Para examinar os mecanismos, estabelecemos células cancerosas da próstata FASN knockdown por transdução de curto hairpin RNA contra FASN e investigou as características por análises em morfologia e comportamento das células e perfil de expressão gênica baseada em microarray. FASN inibição não só suprimiu a proliferação celular, mas impediu a formação pseudopodia e suprimiu a adesão celular, migração e invasão. inibição FASN também suprimiu genes envolvidos na produção de hormonas intracelulares de segundo mensageiro de ácido araquidónico e de androgénio, ambos os quais promovem a progressão do tumor. Coletivamente, nossos dados demonstram que a absorção de acetato radiomarcado é um preditor útil de resultado da terapia alvo-FASN. Isto sugere que [1-
11 C] a tomografia por emissão de positrões acetato (PET) pode ser uma ferramenta poderosa para realizar a terapia personalizada segmentadas FASN por visualização não invasiva de captação de acetato de tumor e selecção dos tumores responsivos. terapia alvo-FASN pode ser um tratamento eficaz para suprimir várias etapas relacionadas com a progressão do tumor em cancros da próstata selecionados por [1-
11 C] PET acetato
Citation:. Yoshii Y, Furukawa T, Oyama N, Hasegawa Y, Y Kiyono, Nishii R, et al. (2013) de ácido gordo sintase é um alvo chave em múltiplas funções tumorais essenciais do câncer de próstata: A absorção de Radiolabeled Acetato como um Predictor do Resultado terapia-alvo. PLoS ONE 8 (5): e64570. doi: 10.1371 /journal.pone.0064570
editor: Juri G. Gelovani, Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de fevereiro de 2013; Aceito: 15 de abril de 2013; Publicado em: 31 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yoshii et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para Jovens cientistas (B) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, Japão (JSPS) (a YY). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
sintase ácido
fatty (FASN) é uma enzima chave na síntese dos ácidos gordos a partir de acetil-CoA, que é expresso em níveis elevados no fígado e no tecido adiposo, mas em níveis baixos em outros tecidos em humanos [1]. FASN é sobre-expressos em vários cancros humanos, incluindo o da próstata, mama, pulmão, ovário, bexiga, estômago, cavidade oral e melanoma, e a sobre-expressão está associado com prognóstico pobre [2], [3]. FASN foi demonstrado desempenhar um papel importante na carcinogénese por células de apoptose protecção [2].
Em anos recentes, inibidores da FASN mostram declaradamente actividade antitumoral [4]. O Orlistat, um inibidor selectivo de FASN, é um daqueles pronta para uso clínico, particularmente uma vez que o orlistat já é utilizado como uma droga over-the-counter para a obesidade nos Estados Unidos e na União Europeia. O orlistat é relatado para exercer actividade anti-tumoral através da indução de apoptose em células tumorais [3], [5]. Assim, a terapia alvo-FASN está prevista para ser eficaz contra tumores que expressam FASN. No entanto, as grandes variações nos níveis de expressão FASN em tumores individuais foram observadas através de estudos patológicos [2], [6]. Portanto, quando se considera a aplicação da terapia alvo-FASN, métodos para prever o resultado terapêutico em tumores individuais antes do tratamento são necessários para reduzir o tratamento desnecessário.
Para abordar este requisito, nós nos concentramos em captação de acetato radiomarcado em células tumorais. Descrevemos previamente mecanismo de absorção de etilo radiomarcado em células de tumor; citosólica acetil-CoA-sintetase, que se converte de etilo a acetil-CoA, é sobre-expresso em células tumorais e desempenha um papel na incorporação de acetato marcado radioactivamente e o acetato incorporado nas células tumorais é usado principalmente para a síntese de ácidos gordos em vez de repartição de CO
2 através da síntese de ciclo do ácido ou aminoácido tricarboxílico [7], [8]. Além disso, Yun et al. 2009 também têm demonstrado que a acetil-CoA-sintetase é importante em [1-
11C] absorção de etilo e ligada com a síntese de ácidos gordos dependente de etilo [9]. Estas evidências significa que a absorção de acetato mediada por acetil-CoA sintetase está associada a síntese de ácidos graxos em tumores. Na verdade, tem sido relatado que os inibidores de FASN, incluindo orlistat, pode reduzir a incorporação de acetato marcado radioactivamente em ácidos gordos em células de cancro da próstata [5], [10]. Vāvere et ai. demonstraram que a absorção de etilo marcado radioactivamente está correlacionada com a expressão FASN e [1-
11C] acetato de tomografia por emissão de positrões (PET), que pode de forma não invasiva visualizar absorção de etilo, é uma ferramenta útil para examinar os niveis de expressão em xenoenxerto de FASN linhas celulares de cancro da próstata [10]. Estes estudos indicam que a absorção de etilo radiomarcado é um bom marcador substituto de expressão FASN em tumores. Portanto, a absorção de acetato radiomarcado pode ser um bom indicador do resultado da terapia alvo-FASN; no entanto, não fica claro se o resultado da terapia alvo-FASN pode ser previsto por captação de acetato radiomarcado. Neste estudo, nós examinamos se a captação de acetato radiomarcado pode prever o resultado terapêutico da terapia FASN-alvo utilizando linhas celulares de cancro da próstata humanos para demonstrar a aplicabilidade de [1-
11 C] PET acetato como um preditor de resultado da terapia FASN-alvo. Até agora, em estudos clínicos, [1-
11C] acetato de PET tem sido aplicado para a avaliação de diversos tipos de tumor maligno [11] – [14]; portanto, se a relação entre a absorção de acetato radiomarcado e resultado da terapia alvo-FASN está provado, [1-
11C] acetato de PET poderia ser aplicada rapidamente para prever o resultado terapia alvo-FASN.
Além disso, os mecanismos como inibição FASN afeta a progressão do tumor ainda não está adequadamente tratados e, portanto, é necessária elucidação dos mecanismos para compreender o significado da inibição FASN e incentivar a utilização de terapia alvo-FASN. Neste estudo, para investigar mecanismos, estabelecemos as células cancerosas da próstata knockdown FASN por transdução de ARN curto-hairpin (shRNA) contra FASN, que pode induzir o silenciamento de genes específicos de, e as características investigadas por meio de análises sobre a morfologia e o comportamento das células e microarray- baseada perfil de expressão do gene. Através desses estudos, discutimos a nova estratégia de tratamento da terapia FASN-alvo no cancro da próstata.
Materiais e Métodos
celular Cultivo
linhas de células cancerosas humanas da próstata, LNCaP ( CRL-1740), PC3 (CRL-1435), 22Rv1 (CRL-2505), e DU145 (HTB-81) foram obtidas da American Type Culture Collection. As células foram incubadas numa atmosfera humidif içada de 5% de CO
2 no ar a 37 ° C. Meio RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino e antibióticos 10% foi utilizado para o meio de crescimento. Exponencialmente as células em crescimento foram usadas para experiências. As células foram tratadas com tripsina e o número de células viáveis foi contado usando o método do azul de tripano de corante de exclusão.
A absorção celular Estudo de [1-
14C] acetato de etilo
In Vitro
foi examinada a captação celular de [1-
14C] etilo em LNCaP, PC3, 22Rv1, e as células DU145. As células foram semeadas a 1 x 10
5 em 1 ml de meio de crescimento por poço em placas de 24 cavidades e pré-incubados durante 24 h antes de estudo de captação. Após pré-incubação, o meio foi removido e 500 ul de meio de crescimento contendo 37 kBq de [1-
14C] acetato de metilo (2,07 GBq /mmol) (GE Healthcare, Pollards, UK) foi adicionado a cada poço, e as células foram incubadas durante 1 h a 37 ° C. O meio foi então removido, e as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado. As células resultantes foram lisadas com 500 uL de NaOH 0,2 N durante 2 h à temperatura ambiente, e a radioactividade do lisado e cintilador líquido (ACSII; GE Healthcare) mistura foi medida com um contador de cintilação líquida Tri-Carb (PerkinElmer, Wallac, Turku, Finlândia). As células tratadas da mesma forma que antes da lise de células foram contadas utilizando o método do corante azul de tripano-exclusão.
Western Blot Análise
FASN níveis de expressão foram analisados por análise de Western blot. As amostras foram submetidas a lise com tampão de lise contendo mistura de inibidores de protease (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) e as concentrações de proteína foram determinadas por Bio-Rad kit de ensaio de proteína (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). electroforese em gel de SDS-poliacrilamida foi realizada com 20 ^ g de proteína em cada amostra utilizando 4% -15% de mini-protean TGX géis pré-moldados (Bio-Rad). o anticorpo primário anti-coelho FASN (SC-20140; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anticorpo de coelho anti-actina-β primário (IMG-5142A; Imgenex, San Diego, CA, EUA), e anti-cabra foram utilizados; coelho anticorpo secundário IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA G21234). Bandas foram detectados com o Plus Sistema ECL Western Blotting Detection (GE Healthcare) e intensidade foi calculada pela densitometria utilizando o software Image J. (National Institutes of Health).
A viabilidade celular após o tratamento Orlistat
Effect do tratamento orlistat
in vitro
foi examinada com LNCaP, PC3, 22Rv1, e as células DU145. As células foram semeadas a 1 x 10
4 em 100 ul de meio de crescimento por poço em placas de 96 poços. Após a pré-incubação durante 24 h, o meio foi substituído com meio de crescimento contendo 0 uM, 12,5 uM, 25 uM, 50 uM, 250 uM ou 500 uM orlistat (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA). A concentração de orlistat foi decidido com base nos estudos anteriores [3], [5]. Orlistat foi dissolvido em etanol e adicionado no meio de crescimento para conter menos de 0,02% de etanol, a final. Depois de 48 h-incubação com meio contendo o orlistat, a viabilidade celular foi analisada por CellTiter-Glo ensaio de viabilidade celular luminescente (Promega, Fitchburg, WI, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. reagente CellTiter-Glo foi adicionado directamente aos poços de cultura e incubadas durante 10 min com agitação. A luminescência foi registada utilizando um leitor de placas (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Durante a 48 horas de incubação com orlistat, o meio foi atualizada em 24 horas após o início do tratamento.
Implantação de xenoenxertos em ratinhos
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do Instituto Nacional de Ciências radiológicas (Japão). O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética animal do Instituto Nacional de Ciências Radiológicas (Japão) (número de autorização: M40-01). NOD.CB17-Prkdc SCID /J ratos machos (4 semanas de idade) foram obtidos de Charles River Laboratories (Yokohama, Japão). Antes das experiências, os ratinhos foram mantidos em repouso durante pelo menos 1 semana. Para
in vivo
estudos, foram utilizadas três linhagens celulares representativas em termos de expressão FASN; LNCaP (expressão alta FASN), PC3 (baixa expressão FASN), ou DU145 (muito baixa expressão FASN). Para obter modelos de xenotransplante, as células de tumor em 3 × 10
7 para LNCaP e 1 × 10
7 para PC3 e DU145 foram injectados por via subcutânea no rato ombro direito com matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, EUA).
In Vivo
biodistribuição
Para estudo de biodistribuição, camundongos com tumores de xenoenxerto foram injectados intravenosamente com 37 kBq [1-
14C] de etilo em 100 ml de solução salina em na veia da cauda e foram sacrificados aos 10 min ou 30 min após a injecção (4 ratinhos por grupo). Os órgãos de interesse (tumor, músculo, pulmão, fígado, baço, pâncreas, do rim e da próstata) e de sangue foram recolhidas, e o peso de cada órgão foi medida. Os órgãos foram digeridos em 1 ml de Soluene 350 (Perkin Elmer) a 50 ° C durante 2 h. Alíquotas de peróxido de hidrogénio (30% w /v), 2 x 100 mL, adicionou-se sequencialmente com as amostras para branquear. forma de cintilação (Hionic-Fluor, Perkin Elmer) foi adicionado antes da contagem da radioactividade num contador de cintilação líquida Tri-Carb (PerkinElmer). dados de biodistribuição foram calculados como% ID /g (média ± SD).
Imagem PET pequenos animais com [1-
11C] acetato
Para confirmar a biodistribuição de absorção de radiomarcado etilo em modelos de xenotransplante, foi realizada pequenos animais imagiologia PET com [1-
11C] acetato. [1-
11C] acetato de etilo foi sintetizado como descrito anteriormente [15]. A pureza radioquímica era 99%. PET dinâmicas de 60 minutos de duração (12 × 5 min) foi realizada utilizando um sistema de animal de companhia pequena (Inveon, a Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, EUA). Cada murganho foi injectado intravenosamente com aproximadamente 18,5 MBq de [1-
11C] acetato de etilo, através da veia da cauda sob anestesia com isoflurano 1,5%. A temperatura corporal foi mantida por uma bomba de luz e calor durante a varredura. As imagens foram reconstruídas usando um máximo 3D a posteriori usando software Inveon Aquisição Local de Trabalho (Siemens Medical Solutions).
Em Orlistat Tratamento Vivo
Efeitos terapêuticos de orlistat foram também investigadas com murganhos de xenoenxerto de tumor. Os ratinhos com tumores bem estabelecidos (0,6-0,9 cm de diâmetro mais longo) foram divididos aleatoriamente em grupos de orlistato-tratamento e de controlo (5 animais /grupo). O Orlistat (240 mg /kg /dia) foi injectado i.p. por dia, durante 2 semanas. A dose de tratamento foi determinada com base em estudos anteriores [3], [5]. Orlistat foi dissolvido em 33 ul de etanol, e diluiu-se com 66 ul de soro fisiológico imediatamente antes da injecção. Como um controlo, a quantidade equivalente de veículo foi injectado, da mesma maneira. Os ratos foram pesados, e os tamanhos do tumor foram medidos utilizando compassos de calibre de precisão 3 vezes por semana. O volume do tumor foi calculado pela equação: volume do tumor = comprimento x largura
2 × π /6
RNA de interferência (RNAi) Experimentos
Neste estudo, para investigar mecanismos exatos how. inibição FASN afeta a progressão do tumor, adotamos células LNCaP FASN knockdown estabelecidos pela transdução de shRNA contra FASN, que pode trazer silenciamento específico do gene estável a longo prazo [16]. células LNCaP knockdown FASN foram estabelecidas por transdução de Missão partículas de transdução lentiviral (SHCLNV-NM 00410; Sigma) que transportam cassetes de expressão que codificam shRNAs que geram RNAs pequenos interferência, contra FASN, de acordo com o protocolo do fabricante. Cinco clones de shRNAs contra FASN (TRCN3125, 3126, 3127, 3128, e 3129) e foram usadas linhas de células transfectadas com cada um shRNA foram estabelecidos (designado FASN-ARNi 3125, 3126, 3127, 3128. e 3129 células, respectivamente). Não segmentação shRNA (SHC002V, Sigma) foi utilizado como um controlo negativo (células de controlo-de ARNi). As células (1 x 10
4) foram plaqueadas em 100 ul de meio de crescimento por poço em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. O meio foi depois mudado para meio de crescimento contendo brometo de hexadimetrina (Sigma) a uma concentração final de 8 ug /mL para melhorar a eficácia de transdução. partículas lentivirais (5-50 ul, 0,5-5 multiplicidade de infecção) foram adicionados e as placas foram incubadas durante a noite. Posteriormente, foram selecionados transdutantes estaveis que expressam o shRNA com puromicina. Os níveis de expressão de mRNA FASN foram examinadas por qRT-PCR para verificar a eficiência do knockdown. Para qRT-PCR, a lise das células, o isolamento de ARN, transcrição reversa e PCR em tempo real foram realizadas utilizando o kit TaqMan Gene Expression Células-a-CT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. a expressão do gene foi analisada utilizando Gene Expression TaqMan Mestre Mix (Applied Biosystems) para β-actina (Hs99999903) e FASN (Hs00188012) com StepOne em Tempo Real Sistemas de PCR (Applied Biosystems). mRNA FASN foi quantificada pela
método T C comparativa usando a expressão β-actina como um controle endógeno [17].
proliferação celular, Morfologia, Migração e Invasão
comportamentos celulares foram examinados com FASN-RNAi 3128 e 3129 e as células controle-RNAi LNCaP. Para o ensaio de proliferação de células, as células foram semeadas em placas de 96 poços a 5 x 10
3 células /100 ul de meio de crescimento. Após o tempo de incubação é claro, a proliferação celular foi determinada por ensaios luminescentes CellTiter-Glo. A morfologia celular foi observada utilizando um microscópio invertido (MDI 4000B; Leica, Solms, Alemanha). imagens de lapso de tempo foram adquiridos a cada 2 horas a 10 × ampliação para 5 dias, utilizando um microscópio invertido motorizado (IX 81; Olympus, Tóquio, Japão) equipado com uma incubadora estágio superior (Tokai Hit, Fujinomiya, Japão) e os dados foram analisados com software Fluoview (Olympus). Para migração e invasão ensaios, a migração de células de 96 poços CytoSelect e ensaios de invasão (célula Biolabs, San Diego, CA, EUA) foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. As células a 4 × 10
4 células /100 uL em meio isento de soro foram colocadas no poço superior e 150 ul de meio contendo 10% de soro fetal de bovino foi colocada no fundo do poço, e as células foram deixadas migrar ou invadir durante 24 h antes da análise. Topo (não migra ou não-invasoras) foram removidas células, fundo (migrar ou invadir) as células foram coradas com uma solução de corante e a fluorescência foi registada usando um leitor de placas a 480 nm /520 nm.
DNA Microarray Analysis
perfil de expressão gênica foi examinado por análise de microarranjo de DNA com FASN-RNAi 3128 e as células controle-RNAi LNCaP. Os ARNs totais foram isolados a partir de células com um sistema de micro-para-Midi purificação de ARN total (Invitrogen). A integridade dos RNAs totais foi avaliada usando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Baixo de entrada rápida Amp Labeling Kit, de uma cor (Agilent Technologies) foi usado para preparar Cy3 marcado ARNc alvo de acordo com as instruções do fabricante. ARNc marcadas foram hibridadas com uma SurePrint GE G3 Humano 8 × 60K Microarrays (Agilent Technologies). Dois hibridações separadas foram realizadas para cada amostra. imagens de matriz foram capturados usando um DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies), e os dados foram analisados por meio de Software Feature Extraction (Agilent Technologies) para obter intensidades de sinal com correção de fundo. Os dados foram analisados com GeneSpring GX Software (Versão 11.0, Agilent Technologies). Após a filtragem de dados, mRNAs diferencialmente expressos em células alvo versus controles foram avaliados pelo teste exato de Fisher, seguido por várias correções utilizando o método Benjamini e Hochberg taxa de descoberta de falsas (FDR). conjuntos de genes com um FDR
q
-valor 0,05 foram considerados significativos. dados de microarranjos de DNA pode ser encontrada no Gene Expression Omnibus banco de dados com o número de adesão (GSE39183).
Análise Estatística
Os dados são expressos como média ± SD.
P valores
foram calculados por análise de variância (ANOVA) para a comparação entre vários grupos de tratamento. A análise estatística dos volumes de tumor foi realizada por repetidas ANOVA, seguido pelo teste post-hoc Tukey.
P
valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
In Vitro
Estudos
Foram examinadas as relações entre absorção de acetato radiomarcado, expressão FASN e sensibilidade ao tratamento orlistat
in vitro
com LNCaP, PC3, 22Rv1, e linhas celulares DU145 (Fig. 1). [1-
14C] acetato de absorção depois de 1 hora é mostrado na Fig. 1A, superior. Alta absorção de [1-
14C] acetato de etilo foi observada em células LNCaP, enquanto que em PC3 e 22Rv1 era menor, e que em DU145 foi muito baixo (
P
0,05). expressão FASN mostrou uma tendência complementando que o observado na captação de [1-
14C] acetato (Fig 1A, mais baixos.): células LNCaP mostraram maior expressão FASN comparação com as outras linhas de células (
P 0,01). Nós confirmamos que havia uma forte correlação positiva entre a captação de [1-
14C] acetato e expressão FASN (
R
2
= 0,93,
P Art 0,05) (Fig. 1C, superior).
(a) a absorção de [1-
14C] acetato (superior) e níveis de expressão FASN (inferior) em LNCaP, PC3, 22Rv1, e as células DU145. Os grupos com diferentes alfabetos são significativamente diferentes (
P Art 0,05). (B) a viabilidade celular por cento após o tratamento orlistat em LNCaP, PC3, 22Rv1, e as células DU145. A viabilidade celular é indicado como uma percentagem do que com o tratamento 0 uM orlistato. Os asteriscos indicam significância estatística versus tratamento com 0 uM para cada linha celular (*
P
0,05). (C) Relação entre a absorção de [1-
14C] acetato e expressão FASN (superior), relação entre a viabilidade celular% após o tratamento orlistat de 12,5 mM e captação de [1-
14C] acetato (meio), e relação entre a viabilidade das células após o tratamento orlistato% em 12,5 uM e expressão FASN (inferior). Valores de seis experimentos independentes são mostrados. Os dados são expressos como média ± SD.
Fig. 1B mostra a viabilidade celular% após o tratamento orlistat
in vitro
. Sob baixa dose de orlistat tratamento a 12,5 uM, as células LNCaP, que tinha mostrado a maior captação de [1-
14C] acetato de etilo e expressão FASN, mostrou uma diminuição significativa da viabilidade celular% (
P 0,05), mas não houve reduções significativas na viabilidade celular% no PC3, 22Rv1 e células DU145. Com 25 um tratamento orlistat, além LNCaP células, PC3 e 22Rv1 células, que tinham mostrado relativamente baixa absorção de [1-
14C] acetato e expressão FASN, mostrou uma diminuição significativa na viabilidade celular%, enquanto as células DU145, que tinha mostrado o menor absorção de [1-
14C] acetato e FASN expressão, não mostrou diminuição da viabilidade. Com mais de 50 uM tratamento orlistato, todas as linhas celulares examinadas mostraram uma diminuição significativa da viabilidade celular%, mas as alterações nas células DU145 foram moderadas. Houve uma correlação negativa significativa entre a viabilidade celular% e captação de [1-
14C] acetato e expressão FASN, respectivamente (
R
2
= 0,92,
P
0,05;
R
2
= 0,97,
P Art 0,05), sob tratamento orlistat baixa dose de 12,5 mM (Fig 1C, médio e inferior).. Considerando que, não houve correlação significativa entre a viabilidade celular% e captação de [1-
14C] acetato e expressão FASN, respectivamente, em tratamento orlistat de alta dose. Estes dados demonstram maior sensibilidade ao tratamento orlistat nas células com maior expressão FASN e absorção de acetato.
Biodistribuição e [1-
11C] acetato de Estudo PET com ratos portadores de tumores
para
in vivo
estudos, foram utilizados ratos portadores de LNCaP (expressão elevada FASN), PC3 (baixa expressão FASN), ou DU145 (muito baixa expressão FASN) tumores. Os níveis de expressão FASN de cada xenoenxerto de tumor foi confirmada antes da experiência, que mostrou tendência semelhante ao
In vitro
estudo (Fig. S1). Em primeiro lugar, para investigar a absorção absoluta de acetato marcado radioactivamente nestes tumores de xenoenxerto, realizamos estudo de biodistribuição. dados de biodistribuição foram obtidos aos 10 min e 30 min após injecção de [1-
14C] acetato de metilo (Fig. 2A). pontos de tempo de amostragem foram decididas com base em um estudo anterior [10]. Biodistribuição nos órgãos de sangue e normais mostraram um padrão semelhante como em relatórios anteriores [18]. [1-
14C] acetato de etilo foi eliminado do sangue em 30 min, em comparação com 10 min (Fig. 2A, esquerda). Aos 30 min, tumores LNCaP (0,27 ± 0,05% ID /g) apresentou 2,2 vezes maior captação de [1-
14C] acetato de tumores PC3 (0,13 ± 0,01% ID /g;
P
0,01) e 5,5 vezes maior absorção do que os tumores DU145 (0,06 ± 0,01% ID /g;
P
. 0,001) (Fig 2A, à direita). Tumor-para-sangue e proporções tumor-para-muscular em 30 min também foram mais elevados em tumores LNCaP em comparação com os tumores PC3 e DU145 (Fig. S2). Em seguida, animal de estimação pequeno animal com [1-
11C] acetato foi realizada para confirmar e completar os resultados do estudo de biodistribuição. Como as imagens demonstrado, [1-
11C] acetato mostrou acúmulo tumor clara no modelo de xenotransplante LNCaP, enquanto a acumulação moderada ou baixa de [1-
11C] acetato foi observada em PC3 e modelo xenoenxerto DU145 (Fig. 2B ). Portanto, biodistribuição e [1-
11 C] estudos PET acetato demonstrado que a absorção de acetato radiomarcado reflete os níveis de expressão FASN e pode distinguir tumores com expressão alta FASN de tumores com baixa expressão FASN.
(A) Biodistribuição aos 10 min e 30 min de órgãos (à esquerda) e cada tumor (à direita). Os dados representam% ID /g, expressos em média ± SD. Os grupos com diferentes alfabetos são significativamente diferentes (
P Art 0,05). (B) imagens de PET pequenos animais de [1-
11C] acetato em 30 minutos após a injeção. Setas amarelas indicam tumores. S = estômago; L = fígado.
Targeted-FASN Terapia
In Vivo
Foram examinados ainda mais a sensibilidade da terapia FASN-alvo com orlistato em cada xenotransplante tumoral
em
vivo (Fig. 3). FIG. 3A mostra a medição do volume tumoral. No dia 14, o volume do tumor em tumores de LNCaP tratadas com orlistat diminuiu acentuadamente; 22,0 ± 6,2% do volume de tumor inicial. Em contraste, PC3 e DU145 tumores tratados com orlistato apresentaram aumentos progressivos no volume do tumor; 238,8 ± 46,6% e 367,1 ± 99,5% do volume inicial do tumor, respectivamente. FIG. 3B mostra o volume de tumor em LNCaP, PC3, DU145 e os tumores tratados com o orlistat, mostrado, em termos de volume de tumor relativo versus tamanho do tumor inicial normalizado contra cada tumor não tratado no mesmo ponto de tempo; houve diferenças significativas no crescimento tumoral entre LNCaP, PC3 e tumores DU145 (
P Art 0,05). Os efeitos do tratamento com orlistat sobre o peso corporal são mostrados na Fig. 3C. perda de peso corporal foi menor do que 5% ao dia 14. Não houve nenhuma alteração aparente na condição física (sem sinal de revestimento desalinhado ou diarreia) ao longo do período experimental. Estes dados demonstram que a absorção de acetato radiomarcado reflete sensibilidade da terapia direcionada-FASN com orlistat
in vivo
e terapia com orlistat é altamente eficaz contra tumores com expressão alta FASN indicados pela alta absorção de acetato radiomarcado. Segmentadas FASN
(a) Crescimento de tumores tratados com o orlistat (240 mg /kg /dia) ou apenas veículo diariamente durante 2 semanas (esquerda) em ratinhos portadores de xenoenxertos de tumor. Os dados representam o volume do tumor (mm
3). Imagens representativas de tumores tratados no dia 14 (à direita). (B) o volume de tumor relativo versus tamanho do tumor inicial normalizado contra cada tumor não tratado no mesmo ponto de tempo. Os grupos com diferentes alfabetos são significativamente diferentes (
P Art 0,05). (C) Efeitos do tratamento com orlistat no peso corporal.
FASN inibição por RNAi
Em seguida, para examinar os mecanismos como a inibição FASN afeta a progressão do tumor, adotamos FASN knockdown células LNCaP obtido por transdução shRNA. Neste estudo, nós estabelecemos cinco linhas celulares FASN-RNAi, FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128 e 3129 células, e qRT-PCR mostrou uma acentuada diminuição na expressão do mRNA FASN em FASN-RNAi 3128 células e uma diminuição moderada em 3129 células FASN-ARNi, em comparação com células de controlo em RNAi (Fig. S3). A análise Western blot mostrou a mesma tendência em FASN-ARNi 3128 e 3129 células em expressão FASN, respectivamente (Fig. 4A, esquerda). Knockdown de FASN por RNAi em células LNCaP levaram a uma redução correspondente da incorporação de acetato (Fig. 4A, à direita). Foram utilizados
FASN-RNAi 3128 e 3129 células e controle-RNAi células. (A) A expressão relativa de FASN, analisados por análise de Western blot (esquerda) e captação de [1-
14C] acetato (direita). proliferação (B) celular durante 7 dias (superior esquerdo). As imagens de microscopia de luz (superior direito). Migração relativa e potencial de invasão em células FASN-RNAi, em comparação com células de controlo-RNAi (inferior, esquerda e direita, respectivamente). Valores de seis experimentos independentes são mostrados. Os dados são expressos como média ± SD. Os grupos com diferentes alfabetos são significativamente diferentes (
P Art 0,05)..
Curiosamente, o knockdown de FASN induz mudanças observáveis nas características biológicas de células LNCaP (Fig 4B ). Knockdown de FASN inibiu a proliferação celular correspondendo a uma diminuição na expressão FASN (figura 4B, esquerda superior.); houve diferenças significativas na proliferação celular em FASN-RNAi 3128 e 3129 células, em comparação com células-RNAi controlar (
P Art 0,05). Além disso, a observação microscópica mostrou que as células controle-RNAi foram fusiforme com pseudópodes em placas de cultura, enquanto FASN-RNAi 3128 células foram redonda com formação deficiente de pseudópodos e FASN-RNAi 3129 células apresentaram morfologia intermediária (Fig. 4B, superior direita) . O movimento das células em placas de cultura foi ainda observada usando microscopia de lapso de tempo (Fig. 5, de vídeo S1, S2 vídeo). As células de controlo-RNAi acoplado na parte inferior formada pseudópodos placa, tornou-se em forma de fuso, e migraram ativamente com a divisão celular e alongamento de seus pseudópodos. Enquanto, as células FASN-RNAi 3128 mostrou a formação de pseudópodos deficiente, tornou-se redondo, e as células divididas, mas mostrou menor migração em comparação com células de controlo-RNAi. FASN-ARNi 3129 células mostraram comportamentos intermediários (dados não mostrados).
Os dados indicam imagens em células de controlo em RNAi (A) e FASN-ARNi 3128 células (B). As imagens foram tiradas a cada 6 horas durante 5 dias. setas brancas indicam um exemplo da formação de pseudopodia, morfologia em forma de fuso, e a migração celular activa nas células de controlo em RNAi. setas pretas indicam um exemplo da formação deficiente de pseudópodos, morfologia redonda e baixa atividade da migração celular nas células FASN-RNAi 3128.
Com base nestas observações, os autores sugerem que a inibição FASN afeta o a migração e a invasão de células. Para testar isso, foi realizada a migração celular e ensaios de invasão com as células controle-RNAi LNCaP FASN-RNAi e. Descobrimos que as células FASN-RNAi mostraram menos migração e invasão correspondente à diminuição na expressão de FASN (Fig. 4B, inferior esquerda e direita). Estas observações indicam que a inibição FASN não apenas suprimiu a proliferação celular, mas também prejudicada celular adesão, migração e invasão.
Gene Expression perfil no FASN Cells Knockdown
Para entender melhor os efeitos da inibição FASN,