Sumário
Nós descrevemos aqui duas novas variantes endógenos do retículo endoplasmático (ER) SEL1LA receptor carga humana, p38 designada e p28. Estudos bioquímicos e de interferência de ARN em células tumorigénicas e não tumorigénicas indicam que a p38 e p28 são N-terminal, ER-ancorados e mais estável em relação ao SEL1LA transmembranar canónica. P38 é expressa constitutivamente segregada e, com o aumento após o stress ER, na linha de mieloma KMS11 e na linhas de cancro da mama MCF7 e SKBR3, mas não na linha MCF10A epitelial da mama não tumorigénico. P28 é detectada apenas na linha de células SKBR3 pouco diferenciado, onde é segregada após ER stress. Consistentemente com a presença de p38 e p28 no meio de cultura, estudos morfológicos de células SKBr3 e KMS11 detectar imunomarcação SEL1L N-terminal em secretoras /compartimentos degradativas e vesículas de membrana extracelularmente-divulgados. Nossos resultados sugerem que as duas novas variantes SEL1L estão envolvidos no tráfico de endossomal e secreção através de vesículas, o que poderia contribuir para aliviar o stress do ER em células tumorigénicas. P38 e P28 poderia, portanto, ser relevante como marcadores de diagnóstico e /ou alvos terapêuticos no câncer
Citation:. Cattaneo M, Lotti LV, Martino S, Alessio M, Conti A, Bachi A, et al. (2011) Secreção de Novel SEL1L endógena variantes é promovido pela ER stress /UPR via endossomos e vesículas Shed em células cancerosas humanas. PLoS ONE 6 (2): e17206. doi: 10.1371 /journal.pone.0017206
editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 26 Outubro, 2010; Aceito: 22 de janeiro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Cattaneo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de MIUR-FIRB nRBIP064CRT Ministero Università e Ricerca (MIUR) e MAPLOMBARDIA, Grant 7/193 ar 3 a IB, MIUR 60% de donativos da Universidade La Sapienza de LVL, MIUR 60% de donativos 2008-2010 de G . d’Annunzio University para RMC, e por um subsídio de 2009 do Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) para RMC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
vários mecanismos homeostáticos que controlam o dobramento de proteínas e montagem e promover a eliminação de proteínas defeituosas operar em compartimentos celulares distintos para proporcionar proteção contra o estresse proteotoxic endógena [1] – [4]. O retículo endoplasmático (ER) é o local de dobragem e de montagem para as proteínas estruturais e enzimas residentes, bem como para proteínas de secreção e de membrana de plasma [5]. Essa carga de trabalho notável é gerido pela eficiente e de alta fidelidade dobramento de proteínas e sistemas, com base em acompanhantes e isomerases dissulfeto ATP-dependente, em paralelo com os mecanismos de controle de qualidade que permitam o trânsito de Golgi correção misfold só de proteínas para adequadamente dobradas [6]. Além disso, a depuração de proteínas aberrantes retidas no ER é mediado através da via de degradação associadas ao ER (ERAD) [7], um processo multi-passo que requer o reconhecimento de proteínas defeituosas, retro-translocação para o lado citosólico da membrana do ER, ubiquitinação e degradação pelo proteassoma 26S [8].
no entanto, a capacidade da proteína-dobragem celular e da via ERAD pode ser prejudicada e /ou sobrecarregada por uma variedade de condições patológicas que perturbam energia e homeostase de cálcio, aumento a síntese de proteínas de secreção e /ou interferir com a formação de glicosilação de proteínas e ligação dissulfureto [6], [9]. Em tais casos, a acumulação de proteínas desdobradas intralumenal /malfolded determina ER stress, o que por sua vez, activa uma cascata complexa de vias de sinalização de sobrevivência, colectivamente denominadas resposta proteína desdobrada (UPR). O objectivo é aliviar o stress ER atenuando a taxa de síntese de proteínas e de up-regulação das enzimas proteína dobráveis, a maquinaria ERAD e da capacidade secretora [6], [10], [11]. máquinas Se a homeostase não pode ser restaurado, UPR-ativados podem desencadear programas de death /senescência [12].
É cada vez mais evidente que o UPR tem um papel importante no cancro, em que é necessária para manter o fenótipo maligno e para desenvolver resistência à quimioterapia [13]. Na verdade as células cancerosas têm de se adaptar à fome de nutrientes e hipóxia, o que influencia o estado redox celular e disponibilidade de energia a partir da hidrólise de ATP. Isto é esperado para comprometer as suas capacidades de enovelamento de proteínas, predispondo ao estresse ER [14] – [16]. Assim, aumento da regulação das vias ERAD-UPR pode contribuir substancialmente para as adaptações celulares complexos necessários para a progressão do cancro [17], [18]. A este respeito é sabido que muitas proteínas ER residente está desregulado, modificada após tradução, de forma anormal segregada e /ou da superfície celular re-localizada em vários tipos de câncer [13], [19] – [21].
O gene ERAD multifacetada
SEL1L
(sel-1 supressor de lin-12,
C.elegans
-como) codifica para pelo menos três isoformas de proteínas diferentes,
ie
, o ER-SEL1LA residente canónica, um receptor de carga que se associa com a ligase de ubiquitina-proteína E3 HRD1 [22] – [25], e a menor, recentemente clonado e SEL1LB -C, que não têm a SEL1LA por membrana C-terminal abrangendo a região para inserção no ER [26]. Vários estudos têm demonstrado que a expressão da proteína SEL1L varia em tumores humanos em relação aos tecidos normais correspondentes, sugerindo um envolvimento na progressão do cancro [27] – [32].
Relatamos aqui a identificação, caracterização e localizações subcelulares de dois novos Anchorless variantes endógenos SEL1L, p38 e p28, estudados nas linhas celulares de cancro da mama SKBr3 e MCF7, a linha de mieloma múltiplo KMS11 e as linhas não tumorigénicas MCF10A (mama) e 293FT (rim de embriões). Descobrimos que:
i
p38 e p28 são codificados por a extremidade 5 ‘do
SEL1L
gene;.
ii
. p38 é regulada para cima e constitutivamente segregada nas células cancerosas, de modo diferente a partir da linha MCF10A não tumorigénica; .
iii
p28 é expresso apenas na linha do cancro da mama SKBR3 pouco diferenciado; .
iv estresse
ER /UPR melhorar fortemente a secreção de p38 nas células cancerosas;
v
. SEL1L N-terminal está presente em compartimentos secretoras e de degradação de células SKBr3 e KMS11, e em vesículas libertado para o espaço extracelular. No geral, a evidência bioquímica e morfológica apoia a ideia de que a p38 SEL1L e p28 estão envolvidas nas vias que ligam o estresse ER /UPR ao tráfico endossomal e à secreção via vesículas extracelulares-derramado. Além disso, a expressão da p38 e p28 e sua libertação para o meio de cultura é regulada em tumorigênico relativamente a células não tumorigénicas, sugerindo funções relacionadas com o cancro.
Materiais e Métodos
As linhas celulares, a cultura condições, transfecções
mieloma múltiplo humano KMS11, MCF7 do cancro da mama, SKBR3, MDAMB453, linfoma de Namalwa, cancro do colo do útero HeLa e G144 glioblastoma, células de G166, G179 e foram mantidas em meio RPMI contendo 10% de soro fetal de bovino (Euroclone, Celbio, Pero, Itália). embrião 293 FT células de rim humano foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino (Euroclone, Celbio, Pero, Itália). MCF10A células não tumorigénicas da mama [33] foram mantidas em MEBM (Lonza, Treviglio, Itália), suplementado com EGF, 20 ng /ml; bFGF, 20 ng /ml; insulina, 10 ng /ml; e hidrocortisona, 0,5 ng /ml. células fetais humanas não tumorigénicas CB660 cerebral, obtidas a partir de Prof. Austin Smith (Cambridge, Reino Unido), foram mantidas em meio de células estaminais neurais em pratos revestidos com laminina. As células foram transitoriamente transfectadas com os plasmídeos indicados e ARNsi por Lipofectamina 2000 (Invitrogen, S.Giuliano M.se, Itália) e colhido após o tempo indicado. As células foram tratadas com DTT (2 mM) durante 3 horas, MG132 (10? M) durante 3 ou 22 horas, ciclo-heximida (200 ug /ml) durante 3, 6, 18 h, como indicado.
Constrói
Tagged TPD52 isoforma 1 constructos foram gerados por clonagem da sequência de comprimento completo que codifica uma isoforma TPD52, fundida com um tag de myc ou GFP na extremidade 3 ‘, em pCDNA3.1myc-Hys (-) a ou vectores peGFPN3 , respectivamente (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Itália). Os myc-tag
SEL1LB
construções foram previamente descrito [26].
RT-PCR
O ARN total foi extraído utilizando o Reagente TRI solução (Applied Biosystems, Monza Itália) . O ARN foi transcrito reverso com SuperScript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Itália) de acordo com as instruções do fabricante. As amplificações de PCR semi-quantitativos foram realizadas com 2 uL do produto de RT por reacção e 0,15 unidades de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Itália), utilizando um instrumento Mastercycler (Eppendorf, Milão, Itália). As condições de PCR para todas as experiências aqui descritas foram: desnaturação a 95 ° C durante 3 min, seguido de 22 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, em seguida a 60 ° C durante 72 segundos. Foram utilizados os seguintes primers específicos:
SEL1LA
: sentido: 5′-ctcgctaacaggaggctcagtagtac-3 ‘; antisense: 5’-gccactggcatgcatctgagc-3 ‘
HRD
1: sentido: 5′-ggccagggcaatgttccgc-3′; antisense: 5′-gtccattgcctggagctcc-3 ‘
BIP
: sentido:. 5′-tgcagcaggacatcaagttc-3′; antisense: 5′-cgctggtcaaagtcttctcc-3 ‘
ATF6
: sentido: 5′-ctgatggctgttcaatacac-3′; antisense: 5′-aatgactcagggatggtgct-3 ‘
CHOP
: sentido: 5′-gatggcagctgagtcattgc-3′; antisense: 5′-atgcttggtgcagattcacc-3 ‘
XBP-1