Abstract

Fundo

A metástase é a principal causa de morte relacionada com câncer e orientar o processo de metástase tem sido proposta como uma estratégia para combater o câncer. Portanto, para desenvolver fármacos candidatos que visam o processo de metástase é muito importante. Nos estudos preliminares, descobrimos que schisandrin B (Sch B), uma lignana dibenzocyclooctadiene de ocorrência natural com muito baixa toxicidade, pode suprimir a metástase do câncer.

Metodologia

ratos

BALB /c foram inoculados subcutânea ou injectado via veia da cauda com câncer de mama murino 4T1 células. Os ratinhos foram divididos em grupos tratados Sch-B e de controlo. O crescimento do tumor primário, invasão local, pulmão e metástase óssea, e o tempo de sobrevivência foram monitorizados. biópsias de tumor foram examinadas imuno-histo e patologicamente. A actividade inibidora de Sch B em TGF-β induzida transição epitelial-mesenquimal (EMT) de 4T1 e células de cancro da mama humano primários foi ensaiado.

principais conclusões

B Sch significativamente suprimida do pulmão espontâneas e metástases ósseas de células 4T1 inoculados sc sem efeito significativo sobre o crescimento do tumor primário e significativamente prolongado o tempo de sobrevivência desses ratos. Sch B não inibiu a metástase do pulmão de células 4T1 que foram injectados através da veia da cauda. Delayed início do tratamento com SCH B em ratinhos com tumores pré-existente não reduzir a metástase pulmonar. Estes resultados sugeriram que Sch B actuado na fase de invasão local. evidências histopatológicas demonstraram que os tumores primários no grupo Sch B foram significativamente menos localmente invasivo do que os tumores de controlo. Os ensaios in vitro demonstraram que Sch B pode inibir TGF-β EMT induzida de 4T1 células e de células de cancro da mama humanos primários.

Conclusões

Sch B suprime significativamente a metástase pulmonar e óssea de 4T1 células via inibição da EMT, sugerindo sua potencial aplicação em alvejar o processo de metástase do câncer

Citation:. Liu Z, Zhang B, Liu K, Ding Z, Hu X (2012) Schisandrin B Atenua cancer invasão e metástase via Inibidor epitelial-mesenquimal transição. PLoS ONE 7 (7): e40480. doi: 10.1371 /journal.pone.0040480

editor: Jonas Fuxe, Instituto Karolinska, na Suécia

Recebido: 30 Janeiro, 2012; Aceito: 8 de junho de 2012; Publicação: 25 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por 863 projecto nacional (2007AA02Z143), projetos China Ciências naturais da Fundação (30772544, 81071802) e os Fundos Fundamentais pesquisa para as universidades Central, Ministério da Educação Nacional, a China, a X. Hu. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro da mama é a principal ameaça para as mulheres, com uma estimativa de 1,4 milhões de novos casos e 458.000 mortes em 2008, em todo o mundo [1]. Para as duas últimas décadas, as integrações de cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal na menopausa, e as drogas anti-HER2 contribuir consideravelmente para a redução da mortalidade [2]. No entanto, apesar dos avanços significativos, metástase distal do cancro da mama para os órgãos viscerais e ossos é ainda pobremente resolvida [1], [3], [4].

metástase do cancro é um processo multi-passo que inclui locais invasão, intravasamento aos sistemas linfáticos e sanguíneos, a sobrevivência na circulação sanguínea, a extravasão dos microvasos e a colonização num local secundário [5], [6]. Numerosos estudos têm revelado o conhecimento sobre os mecanismos de cada passo de metástases do cancro [7], [8]. O multistep de metástase do câncer e para a compreensão dos mecanismos associados oferecem inúmeras oportunidades para intervenções químicas [9].

5 × 10

4 células viáveis ​​4T1 foram inoculados

sc

na direita segunda área almofada de gordura mamária de estabelecer o modelo espontaneamente metastático. Sch B (100 mg /kg de peso corporal) ou veículo (0,5% paraxamer) foi administrado intragastricamente todos os dias durante um total de 7 doses. Os ratinhos (n = 20 para cada grupo) foram sacrificados no dia 30. (A) As curvas de crescimento do tumor primário (B) de peso corporal do rato. (C) o peso do tumor primário no dia sacrificado. (D) O número de nódulos metastáticos do pulmão visíveis. (E) O índice metastático do pulmão. *, P 0,05, **, P 0,01

Schisandrin B (Sch B) é o mais abundante dibenzocyclooctadiene lignana presente na erva medicinal tradicional chinesa

Schisandra chinensis

(.

Turcz.

)

Baill

. Nos últimos anos, Sch B foi revelado possuir várias funções contra o câncer. Nós e outros relatado anteriormente que Sch B foi um duplo inibidor da glicoproteína-P e multirresistência proteína 1 (MRP1) [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Sch B também poderia intensificar a apoptose induzida por doxorrubicina em células de cancro, através da activação da via da apoptose mitocondrial, sem toxicidade melhorados óbvias em relação a células normais [16], mitigar cardiotoxicidade aguda e crónica induzida por doxorrubicina [17], [18], atenuar cisplatina induzida por stress oxidativo, genotoxicidade e neurotoxicidade [19], e inibir a actividade da proteína quinase ATR em resposta a danos no ADN [20]. Em um estudo piloto que estava destinado a observar o efeito de Sch B sobre o reforço do efeito anti-tumoral da doxorrubicina sobre câncer de mama murino 4T1 células, percebemos que Sch B sozinho poderia reduzir significativamente a metástase pulmonar espontânea de 4T1. Esta observação preliminar nos levou a realizar este estudo para investigar o efeito inibitório do Sch B em 4T1 metástases in vivo.

5 × 10

4 células viáveis ​​4T1 foram inoculados

sc

em a segunda à direita área almofada de gordura mamária de estabelecer o modelo espontaneamente metastático. Os ratinhos foram tratados com Sch B (100 mg /kg de peso corporal) ou veículo todos os dias durante um total de 7 doses. Os tumores primários foram ressecados no dia 10. Dois terços dos ratinhos (n = 20 para cada grupo) foram sacrificados no dia 30 e um terço dos ratos (N = 10 para cada grupo) foram para a experiência de sobrevivência. (A) Números de visível metástase 4T1 pulmão. índice metastático (B) Pulmão calculada por H E de coloração. tempo de sobrevivência (C) Mouse. (D) Rato peso corporal. (E) Peso do tumor ressecado no dia 10. *, P 0,05, **, P . 0,01

Os ratinhos (n = 8 para cada grupo) que receberam Sch B (100, 30, 10 mg /kg de peso corporal) ou veículo todos os dias durante 7 doses totais, e tumores primários foram ressecados no dia 10. tempo (a), sobrevivência do ratinho. (B) Rato peso corporal. (C) O peso do tumor ressecado no dia 10. *, P 0,05, **, P 0,01, Sch b versus grupo controle

Materiais e Métodos

Chemicals e anticorpos.

Sch B foi do Instituto Nacional para o Controle de produtos farmacêuticos e biológicos (Pequim, China). crescimento tumoral-β1 humano recombinante (TGF-β) foi adquirido a partir de Pepro Tech Inc. (Rocky Hill, NJ). Epitelial-mesenquimal kit amostrador anticorpo de transição (# 9782, incluindo E-caderina, Caracol, Lesma ZEB1 anticorpos) foi obtido a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). anticorpos vimentina (# 550513) e fibronectina (# 610078) eram produtos da BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). faloidina Rodamina (# R415) foi adquirido a partir da Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA):

metástase óssea de ratos 4T1 em demonstrado na Figura 2 foram avaliados utilizando H . E coloração tal como descrito em Materiais e Métodos. A incidência de metástases ósseas foi reflectida pela osteólise visível. (A) foto Representante da metástase óssea. Osteolysis foi marcado pela seta. (B) foto Representante de ossos sem osteólise. (C) A incidência de metástases ósseas (n = 20) comparadas utilizando análise de qui-quadrado. *, P . 0,05, Sch B contra o grupo controle

Cultura de Células

4T1 células eram da Academia Chinesa de Ciências Cell Bank of Type Culture Collection (Xangai, China) e cultivadas em monocamadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células MDA-MB-231 foram adquiridos a partir de cultura de tecidos na Colecção Americana de (No. HTB-26; ATCC, Manassas, VA) e mantidas em meio L-15 com 10% de FBS de Leibovitz, 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (todos da Invitrogen). Ambas as células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera

(A) da cauda veia modelo de injecção:. Os ratinhos (n = 10 para cada grupo) foram tratadas por gavage com Sch B ( As doses diárias: 30 ou 100 mg /kg de peso corporal ou veículo) durante 3 dias antes da inoculação das células 4T1. Em seguida, cada ratinho foi inoculado com 2 × 10

5 4T1 células por via de injecção na veia da cauda, ​​seguido por tratamento com SCH B (doses diárias: tratadas por gavage com 30 ou 100 mg /kg de peso corporal ou veículo) para os próximos consecutivos 7 dias e sacrificados no dia 18. (B) modelo de tratamento com atraso. Os ratinhos (n = 10 para cada grupo) foram inoculados com 5 × 10

4

s.c.

. para a segunda área da direita almofada de gordura mamaria, e os tumores primários foram ressecados no dia 10. Sch B (100 mg /kg de peso corporal) ou veículo foi dada todos os dias a partir do dia 13-19 de um total de 7 doses, e os ratinhos foram sacrificados no dia 30. A metástase pulmonar foi marcado por nódulo metastático macroscópica, tal como descrito em Materiais e Métodos. *, P 0,05, Sch B contra o grupo controle

Cultura de células primárias

tumores de mama frescas foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia com o consentimento informado por escrito.. Foram selecionados espécimes de infiltrando carcinoma ductal de mama sem quimioterapia para cultura de células como descrito por Speirs et al. [21]. As células foram cultivadas em HuMEC Pronto Médio (Invitrogen) suplementado com FBS a 2% numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera.

Ratos (n = 20 para cada grupo) foram tratados Sch com B (100 mg /kg de peso corporal) ou veículo intragastricamente por dia durante 7 dias. (A) Os tumores primários e tecidos circundantes foram ressecados no dia 15 para coloração hematoxilina-eosina (superior, × 40, inferior, × 100). (B) imunocoloração de E-caderina e vimentina. (× 100).

Animais

Fêmea BALB /c e BALB /c nu camundongos /nu (18-22 g) foram obtidos a partir de Xangai SLAC Laboratório animal Co., Ltd (Xangai, China; certificado animal: No. SCXK [Hu] 2007-0005). Os animais foram alojados numa gaiola de polipropileno padrão contendo cama esterilizada sob condições controladas de temperatura (23 ± 2 ° C), humidade (50 ± 5%), e a luz (10 e 14 h de luz e escuridão) em Zhejiang University Animal Laboratory center (No. SYXK [Zhe] 2007-0029).

4T1 Xenoenxerto modelo Singênico

o modelo animal é baseada no relatório anterior [22]. Cada rato foi inoculado com 5 × 10

4 células viáveis ​​4T1

s.c

. na segunda área almofada de gordura mamária direita. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em grupo SCH B ou controlo no dia seguinte após a inoculação. Cada rato foi tratadas por gavage com qualquer Sch B (100, 30, ou 10 mg /kg de peso corporal) ou veículo (0,5% paraxamer, Sigma) a cada dia durante um total de 7 doses. Para investigar o efeito de Sch B em 4T1 metástase, usamos 3 protocolos. Em primeiro lugar, os ratinhos foram tratadas por gavage com Sch B (100 mg /kg de peso corporal), e os tumores cresceram sem interrupção. Em segundo lugar, os ratinhos foram doseados com Sch B (100 mg /kg de peso corporal) e, em seguida, tumores primários foram ressecados no dia 10 como descrito anteriormente [23]. Em terceiro lugar, os ratinhos foram administrados com três doses de Sch-B (100, 30, ou 10 mg /kg de peso corporal) e os tumores primários foram excisadas no dia 10. O volume do tumor foi medido por compassos de calibre de Vernier, duas vezes ou três vezes por semana e calculou por uma elipse fórmula volume V = (L × W

2) × 0,5, onde L é o comprimento e W é a largura. As metástases pulmonares foram marcados através da contagem de nódulos metastáticos macroscópicas baseada nos relatórios anteriores [24], [25], e o número médio de metástases pulmonares por ratinho foi determinada como um indicador de disseminações cancerosas gerais [23], [26].

As células foram tratadas com Sch B (5 ug /ml) e TGF-β (5 ng /ml) tal como descrito em Materiais e Métodos. (A) Fotografias representativas de TGF-β induzida mudança morfológica de células 4T1, com ou sem pré-tratamento de Sch B. (B) imunocoloração fluorescência de E-caderina celular, vimentina, fibronectina, e F-actina. (C) Western blot da caderina-E, vimentina, Caracol, Lesma, ZEB1, com β-actina como o controle interno. (D) e (E), o TGF-β induzida migração e invasão de células 4T1, com ou sem pré-tratamento de Sch B. (F) fotos representativos de TGF-induzida a alteração morfológica das células cancerígenas da mama primário, com ou sem pré-tratamento de Sch B e western blot de e-caderina e vimentina de células de câncer de mama primários de três pacientes individuais.

Atraso Tratamento Modelo

Os tumores primários foram ressecados no dia 10, e Sch B (100 mg /kg de peso corporal) ou do veículo foi tratadas por gavage em dias 13-19. Todos os animais foram sacrificados no dia 30 para coleta de dados.

veia da cauda Injection Modelo

Este modelo in vivo é baseado no relatório anterior [27]. Antes da inoculação com células 4T1, cada ratinho foi tratadas por gavage com Sch B (30, 100 mg /kg) ou veículo (0,5% paraxamer) durante 3 dias consecutivos. Cada ratinho foi, em seguida, inoculados com 2 × 10

5 células por via intravenosa, por via de injecção na veia da cauda, ​​seguido por Sch B ou do tratamento com veículo durante 7 dias consecutivos. Todos os ratinhos foram sacrificados no dia 18.

MDA-MB-231 in vivo Modelo Animal

Cada ratinho foi inoculado com 5 x 10

6 MDA-MB-231 células

sc

. na segunda área almofada de gordura mamária direita. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em grupo SCH B ou controlo no dia seguinte após a inoculação. Cada rato foi tratadas por gavage com qualquer Sch B (100 mg /kg de peso corporal) ou veículo (0,5% paraxamer, Sigma) durante 7 dias consecutivos com um total de 7 doses. Os ratos foram sacrificados no dia 30 após a inoculação

O critério para avaliar o mouse Moribund Estado

Um rato moribundo é definido como aquele que apresenta mais de uma das seis sinais clínicos seguintes:. Incapacidade para comer ou beber; letargia grave (relutância em se movimentar quando gentilmente cutucou com uma pinça); equilíbrio grave ou perturbações da marcha, de acordo com o critério NIH [28].

As análises histológicas

O tecido tumoral foi fixado, incorporado, e cortado com 5 mm de espessura. As secções de parafina foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) (Sigma). Para imuno-histoquímica, a imunocoloração de E-caderina e vimentina foi realizada utilizando um protocolo padrão [29]. H E secções foram avaliadas e fotografadas com um microscópio Nikon Eclipse 50i controlado pelo software NIS-Elementos (versão 3.22). A área relativa de metástases foi medida utilizando o software ImageJ 1.45S (NIH) [30]. Metástase pulmonar foi quantificada por contagem da área total do tecido por corte de pulmão (D1) e metástase presente na mesma área (D2). O índice metastático foi calculada pela razão D2 /D1 [31]. Para metástases ósseas, os ossos das pernas (fémures e tíbias) foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra, descalcificadas em HCl a 1% durante 24 horas, e embebido em parafina. As secções foram coradas com H E e foram examinados microscopicamente. A incidência de metástases ósseas foi refletida pela osteólise visível [32].

toxicidade celular de Sch B em 4T1 células

2 × 10

3 células foram semeadas por poço em 96- placas de poços. Sch B (5, 10, 20, 40, 80, 160 ug /ml) foi adicionado e cultivadas durante 60 horas, a viabilidade celular foi estimada por exclusão de azul de tripano. Seis poços foram medidos para cada concentração. concentração inibitória de metade (

IC 50) foi determinada.

Efeito do Sch B em TGF-β EMT induzida

O murino 4T1 e células de câncer de mama primário humanos foram pré-tratados com Sch B (5 ug /ml) durante 24 horas, depois adicionou-se TGF-β (5 ng /ml) e cultivadas durante mais 36 horas. Os lisados ​​de células foram usadas na análise de transferência de Western como previamente descrito [33]. imuno fluorescência foi realizada de acordo com o nosso método relatado anterior [34].

migração e invasão celular Ensaios

Para os ensaios de migração, 2 × 10

5 células foram colocadas em placas de seis poços . Após o pré-tratamento de Sch B (5 ug /ml) durante 24 horas, a concentração de FBS do meio de cultura foi alterado para 2% e uma ferida incisa foi como previamente descrito [35]. Em seguida, adicionou-se TGF-β (5 ng /ml) e cultivadas durante mais 24 horas, foram tiradas fotografias por microscopia de contraste de fase. Transwell (Corning Costar, Cambridge, MA) com um filtro revestido com Matrigel (BD Biosciences) foi usado para ensaios de invasão. 4 × 10

3 em células sem soro meio RPMI-1640 foram semeadas em poços a 24 Transwell câmara superior, as câmaras inferiores foram cheias com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS como um quimio-atractor. Após 12 horas de pré-tratamento de Sch B (5 ug /ml) em ambas as câmaras superior e inferior da câmara, adicionou-se TGF-β (5 ng /ml) e tratou-se durante mais 12 horas. No final dos ensaios, o lado do filtro da câmara superior foi limpo com uma mecha de algodão e o filtro foi corada durante uma hora com violeta de cristal (Sigma) em 2% de etanol e, em seguida, lavado em água. Em seguida, as células sobre o filtro foram contados em 10 campos, pelo menos, sob o ponto de vista de um microscópio de contraste de fase.

Análise estatística

Os dados foram expressos como a média ± DP. sobrevivência do ratinho foi avaliada por análise de Kaplan-Meier eo teste de log rank. O teste do qui-quadrado foi utilizado para comparação metástase óssea. testes t de Student foram utilizados para a comparação entre dois valores médios. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Ética Declaração

O estudo animal foi aprovado pelo comitê de ética de animais institucional da Universidade de Zhejiang, com a aprovação No. zju-2009-1-01- 028. tumores humanos foram obtidas com consentimento informado pelos pacientes e seguindo um protocolo aprovado pelo Comité do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Zhejiang Ética.

Resultados

Sch B reduz significativamente 4T1 Lung Metástase sem inibição de Tumor primário

4T1 modelo de xenoenxerto singeneico é amplamente utilizado para estudar a metástase espontânea do cancro [36]. O principal local metastática deste modelo é pulmonar [22]. Usando esse modelo, descobrimos que Sch B reduziu significativamente 4T1 metástase pulmonar, mas sem inibição significativa de tumores primários (Fig. 1).

Sch B aumenta significativamente Survival Time of Mice por inibição 4T1 Lung Metástase

Para excluir o efeito do tumor primário no tempo camundongos sobrevivência, nós removemos tumor primário por ressecção cirúrgica no dia 10 após 4T1 inoculação. Em seguida, dois experimentos com fins diferentes foram realizadas nesses ratinhos. Experiência 1 foi para observar as metástases do pulmão. Os ratinhos foram sacrificados no dia 30 após a inoculação e a metástase pulmonar foi examinada. Os resultados mostraram que Sch B inibiu significativamente 4T1 metástase pulmonar (Figura 2 A . B A Fig. S1). Experiência 2 foi observar o tempo de sobrevivência. FIG. 2C demonstrou que os ratinhos que receberam Sch B viveram significativamente mais tempo do que o controlo e este efeito foi dependente da dose (Fig. 3A). As curvas de crescimento dos ratinhos e peso dos tumores foram comparáveis ​​entre Sch B e grupo de controlo (Figura 2D .. E, a Fig 3B C).

É de notar que 10% dos ratinhos que receberam Sch B (100 mg /kg de peso corporal, a Fig 2C . 3A) sobreviveram durante 3 meses, após o que a experiência foi terminada. Este fenómeno foi observado em três experiências independentes. Estes ratos foram executados e examinados patologicamente. Não houve metástases pulmonares visíveis nestes ratos (dados não mostrados). Foi demonstrado por Pulaski e Demaria [37], [38] que a metástase de 4T1 tumor singeneico poderia ocorrer numa fase muito precoce (por exemplo, dentro da primeira semana após a inoculação SC), e o nosso estudo sugere que Sch B poderia interferir com início metástase. Consistentemente, mostrámos que Sch B poderia atenuar 4T1 invasão local in vivo, e inibir EMT in vitro (ver abaixo). Os resultados sugerem que a cirurgia precoce (por exemplo, cirurgia feita no prazo de 10 dias após a inoculação), combinado com o tratamento Sch B pode bloquear completamente a metástase in vivo de 4T1 células.

Sch B Atenua 4T1 metástases para osso

O modelo de ratinho 4T1 é comumente utilizado como um modelo de metástases de cancro mamário de osso, [39] [32]. Inibir a metástase do tumor mamário para o pulmão pode desviar células tumorais para metastizar em órgãos alternativos, tais como o osso [32]. A fim de excluir esta possibilidade, nós investigamos se Sch B desviaria 4T1 a metástase óssea. Nossos dados demonstram que Sch B reduziu significativamente 4T1 metástase óssea (Figura 4), que se reflecte na gravidade da osteólise.

Sch B inibe a invasão local de 4T1 células

Embora os resultados acima indicados que Sch B pode inibir 4T1 pulmão e metástase óssea, não se sabia como Sch B interferiu com 4T1 metástase. Uma vez que a metástase do cancro é um processo complexo que envolve invasão local, intravasamento, a sobrevivência na circulação sanguínea, o extravasamento e a colonização num local secundário, seria importante para identificar em que o passo B Sch interfere com 4T1 metástase. Nós pensamos que o modelo através de injecção na veia da cauda de células de câncer pode ajudar a dizer se Sch B perturba metástase no passo da invasão local ou não. Se Sch B não inibir metástases pulmonares de células 4T1 injectados via veia da cauda, ​​deve interferir com a metástase 4T1 no passo de invasão local. Os resultados mostraram que Sch B não teve nenhum efeito inibitório significativo sobre metástases pulmonares de células 4T1 através de injecção na veia da cauda (Fig. 5A).

De modo a confirmar ainda mais se Sch B afectar 4T1 metástases no passo de fase precoce , foi realizada uma experiência de tratamento tardio com Sch B em camundongos com tumores pré-existentes. Os resultados mostraram que o tratamento tardio com Sch B teve nenhum efeito significativo sobre a metástase 4T1 (Fig. 5B).

Com base nos resultados acima, foi realizado o exame histopatológico. Como mostrado na fig.6a, as células tumorais tinham invadido profundamente nos músculos, na maioria dos tumores primários no grupo de controlo (13 de 20), enquanto que no grupo B Sch, a maioria dos tumores mostrou uma clara fronteira entre a região de células tumorais e músculos (14 em 20). Além disso, as células na margem do tumor no grupo de controlo foram em forma de fuso, mais como células mesenquimais, enquanto que no grupo B Sch, as células de tumor mantidos morfologia “Cobblestone”, como mais células epiteliais. Estas observações sugerem que Sch B pode inibir a transição mesynchymal epitelial (EMT).

Além de alterações morfológicas, EMT é também acompanhada com mudanças Expressional de alguns biomarcadores, como a E-caderina, vimentina, etc [6], [ ,,,0],40], [41]. Quando as células estão sob essa transição, E-caderina seriam reprimidos e vimentina regulada. Foram examinadas as expressões de E-caderina e vimentina em tumores. Fig.6B mostrou células tumorais no grupo Sch B teve uma maior expressão da caderina-E (um biomarcador epitelial), mas menor expressão vimentina (um biomarcador mesenquimais) do que aqueles no controle, sugerindo que Sch B inibiu 4T1 metástases provavelmente através de segmentação EMT.

Para além da 4T1 modelo, também investigamos o efeito do Sch B na metástase in vivo de linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231 (Fig. S2). 30 dias após a inoculação, os ratinhos foram sacrificados. Descobrimos que não havia nem nódulos metastáticos macroscópicas no pulmão nem metástase óssea no controle e ratos tratados Sch B. Os relatórios sobre a capacidade metastática desta linha de células de diferentes laboratórios parece misto: enquanto vários grupos relataram uma habilidade pobre metastático desta célula [42], [43], [44], outros [45], através da selecção vigoroso, adquiriu vários subclones (osso em busca de MDA-231BO e de procura de cérebro MDA-231BR) com alta capacidade metastática. No entanto, apesar de não haver metástase óbvio, percebemos que, semelhante ao 4T1, células MDA-MB-231 invadiu mais profundamente nos músculos, na maioria dos tumores primários no controle do que no grupo tratado Sch B.

Sch B inibido TGF-β EMT induzida de 4T1 e células cancerosas da mama humanos primários

in vitro

TGF-β é um forte indutor EMT que pode agravar a migração de células tumorais invasão

in vitro

[46]. No ensaio de inibição de EMT, 5 ug /ml Sch B, uma concentração muito abaixo do seu IC

50 em relação a células 4T1 (Fig. S3), foi utilizado.

4T1 células tornaram-se fusiformes ou mesenchymal- como depois do tratamento TGF-β, acompanhada por uma expressão de e-caderina diminuiu e aumento da expressão de vimentina /Slug //ZEB1. Este efeito foi significativamente atenuada por pré-tratamento de células com Sch B (Fig. 7A, 7B, 7C).

Consistentemente, no ensaio de cicatrização da ferida, o TGF-β aumentou a taxa de migração de células 4T1 por cerca de duas dobras mais do que a de controlo, que foi bem inibida por pré-tratamento de células com Sch B (fig. 7D, a Fig. S4A). Da mesma forma, a capacidade de invasão das células 4T1 reforçada por TGF-β foi significativamente atenuado por Sch B (Fig. 7E, Fig. S4B), que por si só não afetou nem a migração celular, nem invasão.

Sch B também inibiu o efeito de TGF-β sobre as células cancerosas da mama humanos primários (Fig. 7F).

Discussão

Como o câncer relacionado a mortalidade é em grande parte causada por metástase do cancro, para reduzir a metástase é uma estratégia importante para o combate Câncer. Propõe-se, por um grupo de cientistas bem conhecidos que “dado o facto de que os tumores primários podem frequentemente ser controlados utilizando as terapias convencionais, poderia agentes que actuam especificamente sobre o processo de metástase ser mais susceptíveis de aumentar a sobrevivência do paciente a longo prazo” [47] . No presente estudo, nós demonstramos (1) Sch B atenua significativamente metástase 4T1 estendendo assim o tempo de sobrevivência de ratinhos; (2) B Sch atenua metástase 4T1 no passo de invasão local; e (3) Sch B inibe EMT de células 4T1, bem como células de cancro da mama humanas primárias. Concluímos que Sch B pode atenuar metástase 4T1 celular via inibição da EMT.

Outro mecanismo possível para Sch B para inibir metástase poderia ser o seu efeito citotóxico sobre 4T1 células. Isto parece improvável. Os estudos em animais mostraram que Sch B não afectou significativamente o crescimento de tumores primários 4T1 (Fig. 1, 2, 3), sugerindo que não há efeito citotóxico. Este é, em geral agradável com os relatórios anteriores que este composto tem baixa toxicidade para as células cancerosas em comparação com fármacos anti-cancerígenos clínicos [17], [48], [49]. Para apoiar ainda mais que a citotoxicidade não desempenham um papel importante na atenuação metástase de células 4T1, incluímos doxorrubicina (Dox), uma droga anticâncer altamente citotóxica, em nosso projeto experimental. Apesar de a citotoxicidade de Dox para 4T1 é três ordens de magnitude mais forte do que a de Sch B (dados não apresentados), as metástases pulmonares 4T1 foram significativamente menos no grupo SCH B do que no grupo Dox ou de controlo, mas sem diferença significativa entre os dois últimos grupos (Fig. S5A). Colectivamente, Sch B inibindo 4T1 metástase é improvável através dos seus efeitos citotóxicos.

Enquanto estender a vida de pacientes com câncer é a primeira prioridade na quimioterapia, a qualidade de vida de pacientes com câncer também é muito importante. Muitos fármacos anticancerígenos clínicos têm efeitos secundários graves, tais como a neurotoxicidade, a reacção gastrointestinal, a inibição da medula óssea, perda de cabelo, etc, que reduzem substancialmente a qualidade de vida de doentes com cancro. Assim, o alívio da dor é cada vez mais reconhecida na quimioterapia do cancro. A este respeito, o desenvolvimento de drogas que têm muito baixa toxicidade sistemática ao corpo humano seria mais ideal. A segurança de Sch B tem sido bem documentada. Os relatórios anteriores de outros laboratórios indicam que nos seus protocolos utilizando Sch B para proteger carbono hepatotoxicidade induzida por tetracloreto em ratinhos, a dose de Sch B é 3 mmol /kg (1,2 g /kg), implicando o bem-tolerância do presente composto [ ,,,0],50]. Os dados toxicológicos como revisto por Hanke

et al.

Revelou a alta-segurança deste composto [51]. Além disso, há uma quantidade suficiente de provas que demonstram que este composto é seguro para a saúde humana. Sch B é a derivada dibenzocyclooctadiene mais abundante no

S. chinensis

(Turcz.) Baill, uma erva medicinal tradicional chinesa. Esta erva tem sido usada como um remédio para os últimos milhares de anos e ainda está sendo praticada activamente na China, Coreia do Sul e Japão, sem efeitos colaterais graves já relatadas

.

Além de sua inibição em células de câncer metástase, Sch B combinado com outras drogas anticâncer pode trazer outros benefícios potenciais. Tem sido relatado que alguns agentes anti-cancro pode aumentar a metástase através da activação de invasão e metástase de células cancerosas. Para exemplos, a inibição da angiogénese reduzida do crescimento do tumor primário e a densidade de microvasos, mas acelerada invasão tumoral e metástase [52], [53]; ciclofosfamida e o inibidor de Hsp90 17-AAG inibida tumores primários mas promoveu a invasão tumoral e metástase [54], [55]; doxorrubicina promoveu metástase óssea de 4T1 células cancerosas da mama [32]. Nós encaramos que combinação de Sch B com estes agentes pode trazer benefícios para controlar tanto do tumor primário e metástases.

Informações de Apoio

Figura S1.

Efeitos da Sch B em metástases pulmonares de 4T1 células. Pulmão de metástases em ratinhos 4T1 demonstrado na Figura 2 foram avaliados utilizando H E de coloração, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os ratinhos (n = 20 para cada grupo) foram sacrificados no dia 30 e metástase foi quantificada com H E a coloração por meio da contagem da área total do tecido pulmonar por secção e metástase presente na mesma área. (A) As fotografias representativas de nódulos pulmonares superfície visível. (B) com H E coloração de metástases pulmonares. Sob o microscópio, não foram capazes de dar uma imagem completa com uma única foto, para que tirou várias fotos que foram então combinadas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040480.s001

(TIF)

Figura S2.

Efeitos da Sch B em modelo animal MDA-MB-231. 5 × 10

6 células viáveis ​​MDA-MB-231 foram inoculadas s.c. na segunda área almofada de gordura mamária direita. Os ratinhos foram tratadas por gavage com Sch B (100 mg /kg de peso corporal) todos os dias durante um total de 7 doses. Os ratinhos foram sacrificados no dia 30 após a inoculação. Os tumores primários, ossos e tecidos circundantes foram examinados patologicamente utilizando H E. (A) As fotografias representativas de frente invasiva, em que as células tumorais no músculo invadiram circundante no grupo de controlo, ao passo que a invasão foi atenuada no grupo tratado Sch B. curvas (B) do crescimento do tumor primário. (C) as curvas de peso do corpo. (D) O peso do tumor no dia do sacrifício. (E) fotos representativas dos pulmões que não têm nódulos metastáticos visíveis. ossos (F) da perna (fémures e tíbias) foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra, descalcificadas em HCl a 1% durante 24 horas e embebidos em parafina. As secções foram coradas com H E, que não apresenta metástase observável

doi: 10.1371 /journal.pone.0040480.s002

(TIF)

Figura S3..

A citotoxicidade do Sch B em direção 4T1 células. 2 × 10

3 células foram semeadas por poço em placas de 96 poços. Foi adicionado Sch B (5, 10, 20, 40, 80, 160 ug /ml) e as células foram cultivadas durante 60 horas. A viabilidade celular foi estimada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano.