Abstract

Onco-miR-182-5p tem sido relatada a ser sobre-expresso em cancro da bexiga (BC) tecidos no entanto a análise funcional detalhada de miR-182-5p não foi levada a cabo em BC. Portanto, o objetivo deste estudo foi: 1. realizar uma análise funcional do miR-182-5p no cancro da bexiga, 2. avaliar a sua utilidade como um marcador tumoral, 3. identificar genes alvo miR-182-5p no BC. Inicialmente verificou-se que a expressão de miR-182-5p foi significativamente mais elevada no cancro da bexiga em comparação com tecidos normais e de alta expressão de miR-182-5p foi associada com a sobrevivência global mais curto em pacientes com CM. Para estudar o significado funcional de miR-182-5p, que sobre-expressa o miR-182-5p com miR-182-5p precursor e observou-se que capacidades de proliferação celular, migração e invasão foram aumentados em células BC. No entanto apoptose celular foi inibida por miR-182-5p. Também identificamos

Smad4

e

RECK

como potenciais genes alvo de miR-182-5p usando vários algoritmos. actividade de luciferase 3’UTR desses genes alvo foi significativamente diminuído e a expressão de proteína destes genes alvo foi significativamente sobre-regulada em células cancerosas da bexiga transfectadas inibidores de miR-182-5p. Mir-182-5p também aumentou nuclear expressão da beta-catenina e enquanto Smad4 reprimida nuclear expressão da beta-catenina. Em conclusão, nossos dados sugerem que miR-182-5p desempenha um papel importante como um oncogene por derrubar RECK e Smad4, resultando na ativação da via de sinalização Wnt-beta-catenin no cancro da bexiga

Citation.: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Tanaka Y, Tabatabai ZL, Hinoda Y, et al. (2012) Metas Oncogênicos miRNA-182-5p Smad4 e RECK no cancro da bexiga humana. PLoS ONE 7 (11): e51056. doi: 10.1371 /journal.pone.0051056

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de setembro de 2012; Aceito: 29 de outubro de 2012; Publicado: 30 de novembro, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos dos Estados Unidos National Institutes of Health através Grant Número RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA bolsas de revisão de mérito, e VA Projeto de Programa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga (BC) é a terceira principal causa de morte entre os tumores urológicos e o tipo histológico mais comum de câncer de bexiga é o carcinoma urotelial (UC), anteriormente conhecido como carcinoma de células transicionais (TCC) [1]. Aproximadamente 75% dos pacientes são “não-músculo invasivo UC (PTA, PTIS, o PT1) e têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de entre 88-98% [2]. O tratamento comum para esses pacientes é a ressecção endoscópica [1], [3]. Pacientes com músculo UC invasiva são normalmente tratados com radical cystectomy ou quimioterapia radioterapia [1], [4]. No entanto metade dos pacientes UC invasivos musculares desenvolver doença metastática subsequente após o primeiro tratamento agressivo [1], [5]. Estudos anteriores identificaram vários biomarcadores moleculares potenciais para o câncer de bexiga [6], [7]. Inativação de genes supressores de tumores

TP53

e

Rb

e

Ras

ativação de oncogenes, foram considerados como os principais intervenientes importantes na carcinogênese cancro da bexiga [6].

a activação da sinalização de Wnt-beta-catenina também tem sido estudado e relatado para ser associado com a progressão do cancro e de mau prognóstico no cancro da bexiga [8], [9]. Factor de crescimento transformante beta (TGF-beta) desempenha um papel crucial no desenvolvimento embrionário e patogénese de várias doenças e cancro [10]. Evidência de diafonia entre TGF-beta e outras vias de sinalização, incluindo a sinalização de Wnt foram relatados [10]. Smad4 é um componente de transdução de sinal intracelular Central de TGF-beta e estudos recentes têm demonstrado que Smad4 coopera com beta-catenina em vários caners [11] – [14]

RECK é repressor crucial de metaloproteinases de matriz (MMPs. ) e estudos anteriores demonstraram que a expressão de RECK é significativamente menor em tecidos de cancro da bexiga em comparação com tecidos normais uroteliais [15] – [17]

até agora, muitos microARNs foram identificadas e relatadas como sendo importantes em vários cancros. [18]. MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes, cerca de 22 nucleótidos de comprimento, que são capazes de regular a expressão do gene, tanto a nível da transcrição e tradução [19]. MiRNAs se ligam à 3’UTR do mRNA alvo e reprimir a tradução do mRNA para a proteína ou induzir a clivagem do mRNA e, assim, regular a expressão de genes-alvo [20].

Neste estudo, descobrimos que miR-182- 5p foi significativamente maior nos tecidos de cancro da bexiga em comparação com tecidos uroteliais normais e alta expressão de miR-182-5p foi significativamente associada à sobrevida global mais curto. Até agora não houve relatos sobre a função de miR-182-5p no cancro da bexiga. Assim, nós nos concentramos em miR-182-5p, realizadas análises funcionais, identificou vários genes alvo de miR-182-5p usando vários algoritmos e identificou

Smad4

e

RECK

como genes alvo. Finalmente, sobre-expressos nestes genes-alvo (

Smad4

e

RECK

) em células de cancro da bexiga para examinar o mecanismo da função de miR-182-5p.

Resultados

Expression miRNA-182-5p é significativamente maior no cancro de bexiga tecidos e associadas a menor sobrevida global

Nós comparamos os níveis de expressão de miRNA-182-5p em tecidos de cancro da bexiga (n = 18) e normal tecidos uroteliais (n = 6) por PCR em tempo real. A expressão de miR-182-5p foi significativamente maior nos tecidos de cancro da bexiga (Fig 1A). Nós investigamos a associação de miR-182-5p e vários parâmetros clínicos, como mostrado na Figura 1-B e observou que a alta expressão de miR-182-5p foi significativamente associada à sobrevida global mais curto.

A. expressão de miR-182-5p em amostras clínicas e linhas celulares de cancro da bexiga, B. Associação de miR-182-5p com os parâmetros clínico-patológico, tramas C. Kaplan Meier da sobrevivência global.

Quanto vários outros parâmetros clínicos, não se observou qualquer relação significativa. Dividimos os pacientes com câncer de bexiga 18 em duas categorias com base no valor mediano e gráficos de Kaplan-Meier mostrou que a sobrevida global foi menor no alto miR-182-5p expressar grupo (p value = 0,0349, teste log-rank) (Figura 1- C).

miRNA-182-5p Expression é significativamente aumentada em linhas celulares de cancro da bexiga

Nós comparamos a expressão de miR-182-5p em várias linhas celulares de cancro da bexiga e sua expressão na T24 e UM células -uc-3 estava na gama de que, em tecidos de cancro da bexiga. Assim, usamos estas linhas celulares de cancro da bexiga dois para novas experiências neste estudo (Figura 1A).

Efeito do microRNA-182-5p Over-expressão na viabilidade celular e migração em linhas celulares de cancro da bexiga

Para confirmar a função de miR-182-5p, nós transfectadas precursor miR-182-5p em linhas celulares de cancro da bexiga (T24 e UM-UC-3). Ao fim de 24 horas após a transfecção de miR-NC ou o precursor de miR-182-5p em células de cancro da bexiga, o nível de expressão de miR-182-5p foi verificada por meio de PCR em tempo real (dobre mudança; 4545, 5920, respectivamente Figura 2-A). . Em seguida, foram realizadas várias análises funcionais. Observamos um aumento significativo da proliferação celular (Fig. 2-B), invasão (Fig. 2-C) e migração (Fig. 2-D) em miARN-182-5p células transfectadas em comparação com células transfectadas miR-NC. Além disso, o miR-182-5p diminuiu significativamente a apoptose celular (Fig. 2-E).

Duas linhas celulares de cancro da bexiga (T24 e UM-UC-3) foram transitoriamente transfectadas com miR-182-5p precursora ou de controlo (miR-NC). A. Relativa expressão de miR-182-5p, B. ensaio de viabilidade celular, Ensaio de Invasão C., D. Wound healing ensaio (24 horas), E. análise citométrica de fluxo da apoptose em miR-NC ou o miR-182-5p transfectadas aC células.

3′-UTR-ensaio de luciferase e Target expressão da proteína em miR-182-5p transf

RECK mRNA tem um, enquanto Smad4 tem dois potencial sítio de ligação de cortesia com miR- 182-5p no seu UTR 3 ‘(Fig. 3-A). Com base nestes resultados, foram realizados ensaios de luciferase 3’UTR e descobriram que as actividades relativas de luciferase com estes locais foram significativamente diminuída em miR-182-5p transfectadas células cancerosas da bexiga (T24, UM-UC-3) (Fig. 3-B ). Estes resultados sugerem que RECK e Smad4 mRNAs são potenciais genes alvo de miR-182-5p. análise de Western confirmou que RECK e Smad4 expressão da proteína foi significativamente aumentada em miR-182-5p inibidor de células transfectadas (Fig. 3-C).

. RECK e Smad4 3’UTR posição e sequências complementares do miR-182-5p. ensaio B. 3’UTR luciferase (miR-NC e precursor miR-182-5p), C. RECK, Smad4 e expressão da proteína beta-tubulina na inibidor de miR-NC ou inibidores de células de câncer de bexiga 182-5p Mir-transfectadas (T24, UM-UC-3).

Efeitos da sobre-expressão de RECK e Smad4 no celular do cancro de bexiga (T24) função

Para examinar a função de RECK e Smad4, nós overexpressed RECK e Smad4 em células T24 que foi confirmada através da medição do mRNA (Fig. 4-a) e os níveis de expressão de proteína (Fig. 4-B). Em seguida, realizamos várias análises funcionais. Como mostrado na Figura 4, a viabilidade das células (Fig. 4-C), invasão (Fig. 4-D) e migração (Fig. 4-E) foram significativamente inibidos em RECK e Smad4 transfectadas células cancerosas da bexiga T24. Como mostrado na Figura 4-F, a percentagem de células apoptóticas foi significativamente aumentado nas células transfectadas RECK ou Smad4.

A. Ao fim de 24 horas após a transfecção de ambos os pCMV6-vazia, pCMV6-RECK ou pCMV6-Smad4 em células de cancro da bexiga (T24), os níveis de expressão de RECK e Smad4 foram verificados pelo tempo real de RT-PCR (dobre mudança; 24744, 8563, respectivamente) e análise de Western (B) ensaio de C. A viabilidade das células, o ensaio de invasão D., E. Ferida ensaio de cura, F. citometria de fluxo e apoptose em vazio, RECK e Smad4 transfectadas células T24. Os dados são a média ± S.D. de quatro experiências independentes. G. expressão da beta-catenina na fração nuclear, CREB foi utilizado como controle.

Efeito do miR-182-5p e Smad4 na expressão da beta-catenina na fração Nuclear

Como mostrado na Figura 4-L, a expressão de beta-catenina na fracção nuclear foi significativamente aumentada em miR-182-5p células T24 transfectadas. Em contraste, a expressão de beta-catenina na fracção nuclear foi significativamente diminuída em Smad4 transfectadas células T24.

Discussão

Um número de microARNs foram identificados como supressor de tumores ou oncogenes, com base no seu nível de expressão em tecidos de cancro da bexiga e /ou análise funcional. No entanto, muitos estudos miRNA têm incidido sobre miRNAs supressores de tumor incluindo miR-125b, -133a, -143, -145, -200 família (200a, 200b, 200c, 141, 429), -203, -205, -218, – 449a, -493 e -517a [21] – [29]. Dois miARNs (MIR-21 e miR-129) foram identificados e confirmados como oncogenes em cancro da bexiga [30], [31].

miR-182-5p também tem sido relatada como sendo um oncogene em várias cancros [32] – [37]. Semelhante aos nossos resultados, um relatório descobriram que a expressão de miR-182-5p foi significativamente maior nos tecidos de cancro da bexiga em comparação com urotélio normal, no entanto a análise funcional não foi realizado neste estudo [38]. Assim, investigou-se a relação entre a expressão de miR-182-5p e parâmetros clínicos incluindo estágios patológicos e os resultados dos pacientes e descobriram que a expressão de miR-182-5p foi correlacionada com a sobrevivência global mais curto após a operação em pacientes com câncer de bexiga. Estes resultados sugerem que miR-182-5p pode ser um biomarcador de diagnóstico novo e útil no câncer de bexiga.

Nosso próximo objetivo foi determinar se as funções de miR-182-5p como um oncogene câncer de bexiga. De três bexiga linhas celulares de cancro (T24, UM-UC-3, J82), a expressão de miR-182-5p em duas linhas celulares (T24 e UM-UC-3) era na gama de expressão observada em tecidos de cancro da bexiga . Assim, usamos estas linhas celulares de cancro da bexiga dois (T24 e UM-UC-3) para experiências de análise funcional. Descobrimos que a sobre-expressão de miR-viabilidade 182-5p significativamente promovida células de câncer de bexiga, migração e invasão e apoptose inibida. Usamos vários algoritmos de pesquisa para potenciais genes alvo miR-182-5p desde microRNAs exercem seus efeitos, regulando a expressão do gene alvo. Foram identificados RECK e Smad4 como potenciais genes alvo por ensaio de luciferase e analisa Ocidental 3’UTR.

MMP desempenha um papel importante na invasão de cancro e metástases e MMP-2 de elevação em tecidos de cancro da bexiga tem sido relatado para ser correlacionada com o estágio do tumor e mau prognóstico em pacientes com câncer de bexiga [39], [40]. RECK é um importante MMP-2 repressor e expressão RECK foi previamente relatado para ser regulada negativamente em tecidos de cancro da bexiga em comparação com urotélio normal, [16], [17]. Além disso, a metilação do DNA foi identificada como um mecanismo de silenciamento RECK [41]. Recentemente miR-21 foi identificado como um regulador do

RECK

expressão de genes em vários tipos de câncer [42], mas até à data não houve nenhum relatório mostrando regulação direta de RECK por miR-182-5p.

Nós também investigou a função de RECK em mais de expressá-la em uma linha de células de cancro da bexiga (T24). Como mostrado, RECK inibiu a proliferação celular, migração e invasão capacidades em células cancerosas da bexiga e o número de células apoptóticas foi aumentada por RECK transfecção.

Smad4 é um importante componente de transdução de sinal de TGF-beta e estudos recentes demonstram que funções SMAD4 por cooperar com beta-catenina em vários tipos de câncer.

Wnt-beta catenin sinalização é crucial para a embriogênese e tumorigénese [43]. Em células de cancro, a via Wnt é normalmente activado fazendo com que não fosforilada beta-catenina a acumular-se no citoplasma e move-se para o núcleo, onde se liga a TCF /LEF e regula transcricionalmente genes alvo que promovem a tumorigénese Wnt [43]. No cancro da bexiga, desregulado de sinalização Wnt-beta-catenina desempenha um papel importante na progressão e metástase. Assim que olhei para ver se a expressão da beta-catenina foi alterada por qualquer miRNA-182 ou Smad4 transfecção. Como observamos, miR-182-5p aumento nuclear expressão da beta-catenina, enquanto Smad4 diminuiu nuclear expressão da beta-catenina. Tanto quanto sabemos, não houve relatos de miR-182 e sinalização Wnt-beta-catenina e nossos resultados sugerem que onco-miR-182-5p podem estar envolvidos na regulação de genes Wnt-beta-catenin relacionados.

Em nosso estudo, Smad4 superexpressão diminuição da proliferação de células de câncer de bexiga, a migração ea capacidade de invasão. A apoptose também foi aumentada com Smad4 superexpressão em células de cancro da bexiga. Uma vez que a perda de Smad4 tem sido relatada a desempenhar um papel causal na iniciação carcinomas de células escamosas da pele, do tracto digestivo superior, bem como o adenocarcinoma do tracto gastrointestinal [44], os nossos resultados podem indicar que Smad4 desempenha um papel importante no cancro da bexiga. Desde focada apenas no Smad4 na cascata de sinalização de Wnt-, é possível que outros genes podem ser directamente ou indirectamente regulada pela miR-182-5p. Experimentos adicionais serão necessários para elucidar o papel exacto de miR-182-5p na sinalização de Wnt-catenina beta. Tomados em conjunto, este estudo mostra que miR-182-5p exerce seus efeitos oncogénicos em células de câncer de bexiga,-down regulação RECK e Smad4.

Este é o primeiro relatório para documentar também que a expressão de miR-182-5p é aumentou significativamente em tecidos de cancro da bexiga, onde funciona como um oncogene por inibição da expressão de RECK e Smad4 e pode ser potencialmente útil como um biomarcador de prognóstico. Estes resultados também sugerem que miR-182-5p podem ter potencial terapêutico para o tratamento de cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

formalina-fixo, incluídas em parafina amostras de câncer incorporados (FFPE) da bexiga foram obtidas a partir de San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos (Número de aprovação: H9058-35751-01).

amostras clínicas

Um total de 18 male pacientes com câncer de bexiga patologicamente confirmada foram incluídos neste estudo (Veterans Affairs Medical Center em San Francisco)

Cultura celular

linhas celulares de cancro da bexiga Três (J82, número ATCC:. HTB-1, T24; número ATCC: HTB-4, UM-UC-3, número ATCC: CRL-1749) foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As linhas de células J82 e de UM-UC-3 foram cultivadas em MEM de Eagle com BSS de Earle suplementado com de soro fetal de bovino a 10%. A linha de células T24 foram cultivadas em meio de McCoy 5A com soro bovino fetal a 10%.

RNA e proteínas Extracção

ARN (microARN e de RNA total) foi extraído a partir fixado em formalina, parafina-embedded (FFPE) cancro da bexiga humana e tecidos não cancerosos normais da bexiga (células uroteliais) usando um kit miRNeasy FFPE (Qiagen) após o laser micro-dissecção com base em comentários patologistas. O ARN total foi também extraído de linhas celulares de cancro da bexiga usando um miRNeasy Mini Kit (QIAGEN). As células foram lisadas com tampão RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL) contendo inibidores de protease (Sigma, St. Louis, MO). quantificação de proteína foi feito usando um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). O NE-PER nuclear e citoplasmática Reagente de extração foi utilizado para extrair frações de proteínas nucleares e citoplasmáticos de células de câncer de bexiga (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).

MicroRNA transfecção (pré-miR Precursor e miR Inhibitor)

precursores Pré-miR ™ miARN [controlo negativo (miR-NC) ou HSA-miR-182-5p, Ambion] foram transientemente transfectados para células de cancro da bexiga por Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Anti-miR ™ miRNA inibidor [controle negativo (inal-NC) ou inibidor de miR-182-5p (miR-182 inibidor), Ambion] foram transitoriamente transfectadas em células de câncer de bexiga por siPORT NeoFX transfecção Agent (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Após a transfecção, as células foram incubadas a 37 ° C durante 48 horas até que a avaliação.

A viabilidade celular, invasão celular, Cicatrização de Feridas Ensaio

A viabilidade celular foi medida 3 dias após a transfecção com MTS (CellTiter 96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular, Promega). Os dados são a média ± S.D. de 6 expericias independentes. Os ensaios de invasão celular foram realizadas com o kit de 24 poços de ensaio a invasão de células CytoSelect (BioLab celular, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células transf ectadas foram re-suspensas em meio de cultura sem FBS e colocado na câmara superior em triplicado. Após 48 horas de incubação a 37

o C (5% CO2), as células que migram através da membrana foram coradas. Os resultados foram expressos em células invadidas quantificados a 560 nm OD. O processo de cicatrização de feridas começa com remodelação da matriz do tecido, migração, e eventual fecho da área da ferida. Portanto, este ensaio é frequentemente utilizado para avaliação da migração de células de câncer. ensaio de cicatrização de feridas foi realizada com o CytoSelect 24 poços cicatrização de feridas kit de ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Para gerar um campo de feridas, as células transfectadas foram cultivadas até que se formou uma monocamada em torno do inserto. Depois de retirar o inserto, um campo ferida aberta 0,9 milímetros foi gerado e as células foram deixadas migrar a partir de ambos os lados da abertura. o fechamento da ferida foi monitorizado e o encerramento por cento foi medida. [Taxa de encerramento por cento (%) = Área da superfície de células migradas /total de área de superfície X100)].

Análises Apoptose

As células (48 horas após a transfecção) foram lavadas duas vezes com 1xPBS e tripsinizadas. Após inactivação da tripsina em meio completo, as células foram re-suspensas em 1x tampão arrefecido com gelo (70 ul) de ligação. Anexina V-FITC solução (10 ul) e corante de viabilidade de 7-AAD (20 ul) foram adicionados a 70 ul das suspensões de células. Após incubação durante 15 minutos no escuro, a 400 ul de 1x tampão de ligação arrefecido em gelo foi adicionado. A distribuição apoptótica das células em cada amostra foi então determinada usando um FACS (Lab celular QUANTA SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Os dados são a média ± S.D. de quatro experiências independentes.

plasmídeo Construção e 3’UTR-Luciferase Assay

Foram construídos plasmídeos individuais para cada local de ligação na 3’UTR do mRNA de genes-alvo potenciais com base em microRNA.org em formação. Em seguida, confirmou miR-182-5p ligação aos genes alvo mRNA 3’UTR por ensaio de luciferase com precursor miR-182-5p. PmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão usado para executar 3’UTR de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). As sequências dos iniciadores utilizados para as inserções de plasmídeos são apresentados na Tabela 1. Em um volume total de 20 ul, 5 ul de cada um de 100 | iM de iniciadores para a frente e iniciador inverso, 2 pi de 10 x tampão de emparelhamento (Tris-HCl a 100, pH 7,5, 1 M de NaCl, 10 mM de EDTA) e 8 ul de água foram adicionados a um tubo de PCR de 200 uL e incubados a 95 ° C durante 5 minutos e depois colocados à temperatura ambiente durante 1 h. Os oligonucleotídeos foram ligados no

Pme

I-

Xba

site eu de pmirGLO Dual-Luciferase miRNA alvo Vector Expression. Colony PCR directo foi realizada por inserção de reconhecimento utilizando REDTaq (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Os iniciadores utilizados para a PCR foram como se segue: iniciador directo, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 ‘; iniciador de sentido reverso, 5’-gcagccaactcagcttcctt-3 ‘. parâmetros de PCR para amplificação foram como se segue: 94 ° C durante 3 minutos, 30 ciclos de PCR a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 10 minutos e 4 ° C durante 10 minutos. O produto da PCR foi digerido com NotI (Takara /Fisher Scientific,

Pittsburgh

,

PA, EUA

). Os tamanhos dos vetores contendo inserções foram cerca de 200 pb e 100 pb por electroforese desde a sequência de reconhecimento NotI foi incorporada nos iniciadores. Para a transfecção precursor de miR-182-5p, células cancerosas da bexiga foram co-transfectadas com vectores de expressão luciferase dupla pmirGLO miARN alvo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de miR-NC e pmirGLO ou miR-182-5p e. A actividade da luciferase foi avaliada utilizando o Ensaio Reporter Sistema Dual-Luciferase® (Promega) (48 horas após a sua transfecção).

A superexpressão de plasmídeos de genes alvo (RECK, Smad4) e Análise Funcional

de modo a construir gene alvo (RECK, Smad4) sobre plasmídeos de expressão, os genes foram amplificados com o ARN total a partir de tecidos normais de rim de adulto humano (catálogo #: R1234142-50, Instituto Biochain, Newark, CA) e 1-RWPE por reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR). As sequências dos iniciadores para a clonagem são mostradas na Tabela 1. A reacção em cadeia com polimerase produtos foram clonados na expressão de mamífero pTargeT-Vector System (Promega, Madison, WI). Então pCMV6-RECK ou pCMV6-Smad4 foi obtida por subclonagem de um fragmento NheI-XhoI de pTargeT-RECK /Smad4 no local de Nhel-Xhol de Vector pCMV6-Entry.

Inicialmente, transfectadas pCMV6 vazio e pCMV6- RECK ou -Smad4 em células cancerosas da bexiga e RNA e proteínas foram extraídas. A sobre-expressão de RECK ou Smad4 foi confirmada por tempo real de RT-PCR e análise de Western Blot e de análises funcionais foram realizados.

quantitativo em tempo real de RT-PCR

quantitativo em tempo real de RT-PCR foi realizadas em triplicado, com um sistema de detecção de Applied Biosystems Prism 7500 Sequence rápida utilizando TaqMan universal PCR Master mix de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA). As sondas TaqMan e iniciadores foram adquiridos a Applied Biosystems. GAPDH humano e RNU48 foram utilizadas como um controle endógeno. Os níveis de expressão do RNA foram determinadas usando o 7500 Fast System SDS software versão 1.3.1 (Applied Biosystems).

Análise Ocidental

proteína celular total (15-20 mg) foi utilizado para Western blot . As amostras foram resolvidas em géis de proteína de 4-20% exactos (Thermo Scientific, Rockford, IL) e transferidas para membranas de PVDF (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). As membranas foram imersas em leite desnatado a 0,3% em TBS contendo 0,1% de Tween 20 durante 1 hora e sondadas durante a noite a 4 4 ° C com anticorpo policlonal primário e anticorpo monoclonal contra Smad4 (# 9515), RECK (# 3433), beta-catenina ( # 9562), CREB (# 9197) e beta-tubulina (# 2128) a partir de Cell Signaling Technology, Beverly, MA. As manchas foram lavadas em TBS contendo 0,1% de Tween20 e marcado com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-ratinho secundário ou anticorpo anti-coelho (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). As proteínas foram reforçadas por quimioluminescência (Amersham ECL além de sistema de detecção de Western Blotting, Fairfield, CT) para visualização. Os níveis de expressão de proteínas foram expressas em relação aos níveis de beta-tubulina ou CREB

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando StatView. (Versão 5; SAS Institute Inc., NC). A

p

-valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência com a preparação do manuscrito. .