Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade por câncer no mundo de hoje . Apesar de alguns avanços na terapia do cancro do pulmão têm sido feitas, a sobrevida do paciente ainda é pobre. MicroRNAs (miARNs) pode funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumores em malignidade humana. A família miR-34 consiste miARNs-supressora de tumor e sua expressão reduzida foi avaliado em vários cancros, incluindo o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Neste estudo, verificou-se que o miR-34a e alfa do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas alvo miR-34c e beta (PDGFR-α e PDGFR-β), os receptores de tirosina-quinase da superfície das células que induzem a proliferação, migração e invasão no cancro. MiR-34a e miR-34c foram reprimidos em tumores de pulmão em comparação com tecidos normais. Além disso, identificou-se uma correlação inversa entre PDGFR-α /β e miR-34a /c expressão em amostras de tumores do pulmão. Finalmente, o miR-34a /c sobre-expressão ou infra-regulação de PDGFR-α /β por ARNsi, aumentado fortemente a resposta de apoptose relacionado com TNF ligando indutor (TRAIL), enquanto a redução da capacidade migratória e invasiva das células NSCLC.

Citation : Garofalo M, Jeon YJ, Nuovo GJ, Middleton J, Secchiero P, Joshi P, et al. (2013) miR-34a /c-Dependent PDGFR-α /β Downregulation Inibe Tumorigênese e aumenta TRAIL-induziu a apoptose no câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (6): e67581. doi: 10.1371 /journal.pone.0067581

editor: Noriko Gotoh, Instituto de Ciências Médicas da Universidade de Tóquio, Japão

Recebido: 10 de novembro de 2012; Aceito: 23 de maio de 2013; Publicação: 21 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Garofalo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health CA152758. Os autores são gratos pelo apoio de pesquisadores da Universidade do Estado de Ohio Investment alvejado no Excellence Award. MG é um receptor da concessão Scholar Kimmel 2011. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

interesses concorrentes:. GJN é um funcionário da filogenia , Inc. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo [1]. Apesar de anos de pesquisa, o prognóstico para pacientes com câncer de pulmão permanece sombrio. O tipo mais frequente, cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC) (85%), mostra uma sobrevivência global em cinco anos de 15%. As isoformas de receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) e o seu ligando, o PDGF, constituem uma família de receptores e ligandos envolvidos na proliferação e prosurvival sinalização dentro das células. O sistema /PDGFR PDGF inclui dois receptores (PDGFR-alfa e PDGFR-beta) e os quatro ligandos (PDGFA, PDGFB, PDGFC, e PDGFD). Ligando do receptor induz a dimerização de ligação, permitindo que a autofosforilação de resíduos de tirosina específicos e subsequente recrutamento de uma variedade de moléculas de transdução de sinal. PDGFR regula o crescimento normal e diferenciação celular [2] e expressão de PDGFR activado promove a transformação oncogénica [3]. Numerosos

in vitro

e

In vivo

estudos mostraram que a inibição da sinalização PDGFR-α perturba a sobrevivência de células cancerosas no subgrupo de tumores estromais gastrointestinais (GIST) com a ativação PDGFR-α mutações [4, 5]. Em um estudo recente de 150 amostras de doentes com NSCLC, activado PDGFR-α foi detectado em 13% dos casos [6], sugerindo que um subconjunto destes pacientes pode beneficiar de terapias dirigidas contra PDGFR-α. Além disso, a sobre-expressão de PDGFR-α foi observada em amostras de meduloblastoma metastática X paciente não-metastáticos e destruir a função do PDGFR-α inibiram o potencial metastático de células de meduloblastoma in vitro [7]. Dado o seu papel na sinalização celular progrowth, PDGFR-α tornou-se um alvo terapêutico atractivo numa série de neoplasias humanas. No cancro do pulmão de células não pequenas, a expressão de PDGFR-α citoplasmática por tumores é um indicador de prognóstico negativo [8], confirmando que o eixo de PDGF pode ser biologicamente relevante. Todos os membros da atividade angiogénico potente exibição família PDGF

in vivo

, ea partir deste ponto de vista, PDGF-B eixo /PDGFRβ foi a mais extensa avaliada. Nos ratinhos nulos foi mostrado que PDGF-B e PDGFRβ estão criticamente envolvidos no desenvolvimento vascular. O papel do PDGF /PDGFR em desenvolvimento vascular é suportada por experiências knockout [9,10]. MicroRNAs (miARNs), uma classe de ~ 22 nt Os ARN endógenos, são reguladores importantes da expressão do gene e têm sido implicados na regulação de processos críticos que são desregulados em células cancerosas, como a proliferação [11] diferenciação [12] e a apoptose [13 ]. Alterações na expressão de miARN no cancro ter sido documentada em diversos estudos sugerem que miARNs e contribuir de forma crítica para o fenótipo de células de cancro [14,15]. Além disso, alguns genes codificadores de miRNA foram classificados como genes supressores de tumores oncogênicos ou de acordo com a sua função na transformação celular e expressão alterada em tumores.

Em 2007, os relatórios dos vários laboratórios mostraram que os membros do miR-34 família são alvos directos p53, e que a sua sobre-regulação induzida por apoptose e do ciclo celular prisão [16,17]. Em mamíferos, a família miR-34 é composto por três miRNAs processados ​​que são codificados por dois genes diferentes: miR-34a é codificada por sua própria transcrição, enquanto que miR-34b e compartilhar miR-34c um transcrito primário comum. Além disso, a região do promotor de miR-34a, 34b-miR e miR-34c contém ilhas de CpG e metilação aberrante CpG reduz o miR-34 expressão família em vários tipos de cancro [18,19,20].

neste estudo, mostra que o miR-34a e miR-34c, são fortemente regulados negativamente em células NSCLC e tumores pulmonares Considerando que eles são altamente expresso em tecidos de pulmão normal. Além disso, o miR-34a e miR-34c, visando PDGFR-α e PDGFR-β, aumentar a apoptose induzida por TRAIL e diminuir a capacidade de invasão das células de câncer de pulmão. Além disso, nossos resultados sugerem, pela primeira vez, que o tratamento combinatório de inibidores da fuga e PDGFR poderia ser eficaz para a terapia anti-NSCLC.

Resultados

miR-34a e miR-34c PDGFR-alvo -α e PDGFR-β 3 ‘UTRs

Entre os miRNAs, membros da família miR-34 desempenham importantes papéis supressores tumorais, como eles são regulados diretamente pelo p53 e compor a rede p53 [16,17]. Um estudo anterior indicou que miR-34 metilação estava presente em NSCLC e foi significativamente relacionado a um resultado clínico desfavorável [20]. Em primeiro lugar, analisada por PCR em tempo real (qRT-PCR) miR-34a, expressão -34b e -34c em 5 linhagens de células NSCLC diferentes com WT p53, mutante ou nula (Figura S1a em S1 Arquivo). MiR-34a, -34b e -34c teve expressão baixa ou ausente em todas as cinco linhas de células (Figura s1b no arquivo S1). Para identificar miR-34a, -34b e metas -34c, foi realizada uma pesquisa de bioinformática (TargetScan, PicTar) para alvos de mRNA putativos. Entre os alvos candidatos, 3 ‘UTR de PDGFR-α humana e PDGFR-β continha regiões (nucleotídeos PDGFR-alfa 2670-2676; nucleotídeos PDGFR-beta 1535-1541; 2699-2705) que combinavam com as sequências de sementes de hsa-miR- 34a, -34b e -34c (Figura 1a). PDGFR-α e PDGFR-β têm sido relatados para ser sobre-expresso e relacionadas com mau prognóstico no cancro do pulmão [21]. Para verificar se PDGFR-α e PDGFR-β foram alvos diretos de miR-34a, -34b e -34c, PDGFR-α 3 ‘UTR, contendo dois locais miR-34a, -34b e -34c ligação e PDGFR-β 3’ UTR, contendo um miR-34a, -34b e local de ligação -34c (Figura 1a, b), foram clonados a jusante do quadro de leitura aberta de luciferase. Curiosamente, a expressão aumentada de miR-34a e miR-34c, e não o miR-34b, por transfecção, confirmada por qRT-PCR (dados não mostrados), diminuiu significativamente a actividade de luciferase, indicando uma interacção directa entre os miARNs e PDGFRα e PDGFRβ 3 ‘UTRs (Figura 1C, d). repressão do gene alvo foi resgatada por mutações nos sítios de sementes complementares (Figura 1b, c, d). Tomados em conjunto, os resultados indicam que o miR-34a e miR-34c e 34b não miR-alvo directamente PDGFR-α e PDGFR-β.

(a), PDGFR-alfa e PDGFR-beta 3 ‘UTRs contêm, respectivamente , dois e um previsto miR-34a, -34b e sítios de ligação -34c. Na figura é mostrado o alinhamento das regiões de semente de miR-34a /c com PDGFR-α e PDGFR-β 3 ‘UTRs. Os locais de mutagénese alvo são indicados no vermelho. nucleotídeos _deleted. (B) construções PGL3 control-PDGFR-alfa contendo dois obrigatório-a PDGFR locais (em vermelho). A deleção de um dos dois locais de PDGFR-alfa foi utilizado para gerar os mutantes palsmids luciferase. (C-d) PDGFR-α e PDGFR-β 3 ‘UTRs são alvos diretos de miR-34a e miR-34c. pGL3-PDGFR-alfa e de luciferase pGL3-PDGFR-β construções, que contêm um tipo selvagem (lado esquerdo dos histogramas) ou mutada (lado direito dos histogramas) PDGFR-α e PDGFR-β 3 ‘UTR, foram transfectados em Calu células -6. repressão relativos de expressão de luciferase de pirilampo foi normalizada para um controlo de transfeco. Os ensaios de repórter foram realizadas três vezes, com resultados essencialmente idênticos. * P 0,0001, ** P . 0,05 pelo teste t de duas Student atados

miR-34a e miR-34c são inversamente relacionada com PDGFR-α /expressão β

in vitro

e

in vivo

em seguida, foram analisadas as consequências da expressão ectópica de miR-34a e -34c em células Calu-6 e H1703. Nós escolhemos estas duas linhas de células por causa dos elevados níveis de expressão de PDGFR-α (H1703 e Calu-6) e PDGFR-β (Calu-6) (dados não mostrados). O aumento da expressão de miR-34a-34c e miR por transfecção foi confirmada por qRT-PCR (dados não mostrados) e, em seguida, os efeitos sobre PDGFR-α e PDGFR-β ARNm e os níveis de proteína foram analisados ​​por qRT-PCR e Western blot. MiR-34a e -34c (e não o miR-34b) sobre-expressão significativamente reduzida de PDGFR-α e mRNAs PDGFR-beta (Figura 2A) e os níveis de proteína endógenos, em comparação com as células transfectadas com um mexidos pré-miR (Figura 2b). Os níveis de expressão dos quatro ligantes PDGF (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) após miR-34a e miR-34c expressão forçados foram também avaliados em ambas as células Calu-6 e H1703. PDGFD mal foi expresso em ambas as linhas celulares; não encontramos qualquer variação da expressão de PDGFA, PDGFB e PDGFC (dados não mostrados). Em resumo, estes resultados suportam as previsões de bioinformática indicando PDGFR-α e PDGFR-β 3 ‘UTRs como alvos de miR-34a e -34c.

(a) qRT-PCR mostrando PDGFR-α e PDGFR-β mRNAs downregulation em Calu-6 e H1703 células após a miR-34 e miR-34c mas não miR-34b aplicada expressão (b) miR-34a e miR-34c expressão aplicada diminui os níveis endógenos de níveis de proteína /p PDGFR-alfa em H1703 e Calu-6 NSCLC. As células foram transf ectadas com quer mexidos, miR-34a-34c ou miR durante 72 h. PDGFR-α e expressão de PDGFR-β foi avaliada por Western blot. Carregando controle foi obtido utilizando anticorpo GAPDH. * P 0,05, ** P . 0,001 pelo teste t de Student dois atados

Para verificar a regulação baixa de miR-34a e -34c também

in vivo

, 9 tumores de pulmão (entre adenocarcinoma eo carcinoma de células escamosas) e os tecidos normais do pulmão histologicamente adjacente foram analisadas para miR-34a e expressão -34c. Tal como mostrado na Figura 3a e b, 34a e miR-expressão de miR-34c foi menor no tumor em comparação com as amostras normais (figura 3a, b).

(a-b) qRT-PCR em 18 de pulmão tumor e tecidos normais. MiR-34a e miR-34c são regulados negativamente nos tumores, em comparação com os tecidos pulmonares normais. parcelas (c) caixa mostrando miR-34a e expressão de miR-34c em 48 de pulmão tecidos normais e cancerosas. parcelas (d) XY dispersão mostrando correlação inversa entre miR-34a /c e PDGFR-α /β. Bicaudal teste t de Student foi utilizado para verificar o significado. P . 0,05

Além disso, analisou-se o miR-34a, 34c e PDGFR-α /β expressão de mRNA em 24 amostras de tumores primários de pulmão humano, em comparação com 24 tecidos normais. MiR-34a e -34c foram quase indetectáveis ​​no tumor e altamente expresso no pulmão normal amostras testadas (Figura 3c). Notavelmente, uma correlação inversa entre o miR-34a /c e PDGFR-α e PDGFR-β foi observado (Figura 3D). Para corroborar esses achados, hibridação in situ análise (ISH) foi realizada utilizando sondas LNA 5′-marcada com DIG de tumores do pulmão e tecidos normais, seguido por imuno-histoquímica (IHC) para PDGFR-α e PDGFRβ. A maioria das células de cancro do pulmão mostraram expressão baixa de miR-34a e alta expressão de PDGFR-α /β, enquanto que o pulmão não-maligno adjacente expressa PDGFR-α raramente e abundantemente expressa miR-34a. MiR-34a e PDGFR-α expressão /β na maioria dos 107 tumores diferentes analisadas era basicamente mutuamente exclusivos (Figura 4a, b e S2 na Figura S1 do ficheiro).

(a-b) e em imuno-histoquímica hibridização in situ em 107 amostras de tecido de câncer de pulmão. MiR-34a (azul) e PDGFR-α /β (marrom /vermelho, respectivamente, em RGB e cada vermelha fluorescente Nuance convertido à imagem) expressão foi inversamente relacionada em cancros do pulmão e os tecidos pulmonares normais adjacentes. Estas secções em série foram analisadas quanto à expressão de miR-34a por hibridação in situ, seguido por imuno-histoquímica para PDGFR-α /β. (A) exemplo representativo: análise de miR-34a e PDGFR-α Co-expressão. Nota falta de expressão na imagem resultante da fusão (painel b) (amarelo fluorescente = co-expressão). (B) exemplo representativo: miR-34a = azul (painel a), PDGFR-β = vermelho (painel b), a co-expressão = amarelo (painel C). RGB = regular imagem Azul Verde da reação ISH /LHC mostrados em painéis a-c. A barra de escala indica 50 um. A ampliação é a mesma para todos os painéis.

miR-34a e miR-34c resistência TRAIL superar de células NSCLC através PDGFR-α e downregulation PDGFR-β

TNF-relacionados Indutor de apoptose ligando (TRAIL) é um membro da família do factor de necrose tumoral, que se sabe induzir apoptose numa variedade de diferentes tipos de tumores. TRAIL é capaz de induzir especificamente a morte celular em células cancerosas, enquanto poupando células normais e está actualmente a ser testado como um agente anti-tumoral promissora nos ensaios clínicos [22]. No entanto, muitos tumores incluindo NSCLC são resistentes a TRAIL, assim, limitando a sua aplicação terapêutica. Uma vez que o PDGFR-α e PDGFR-β regulam a via PI3K /Akt e ERK1 /2 vias [23,24,25], o próximo examinados por imunocoloração, a expressão e /ou activação de algumas das proteínas envolvidas nestas vias seguintes miR -34a e miR-34c aplicada expressão ou PDGFR-α /β silenciamento por ARNsi. Como mostrado na Figura 5a, os níveis de fosforilação de ERK diminuiu após o miR-34a-34c e miR expressão aplicada em comparação com células transfectadas com o controlo de miR. PDGFR-α silenciamento reduziu a activação de ambos Akt e ERK1 /2 (Figura 5b). Anteriormente, demonstrou que a via PI3K /AKT desempenha um papel-chave na apoptose induzida por TRAIL [26], por conseguinte, foram examinados os efeitos de miR-34a e sobre-expressão de miR-34c sobre a sobrevivência das células e resistência TRAIL do NSCLC. Primeiro, foi realizado um ensaio de proliferação de células resistentes semi-Calu-6 e H1703 TRAIL após expressão de miR-34a e miR-34c forçados. 48 h após a transfecção as células foram expostas a TRAIL durante 24 h e, em seguida, a proliferação celular foi avaliada utilizando um ensaio MTT. células Calu-6 e H1703 que sobre-expressam o miR-34a e -34c mostrou um índice de proliferação significativamente menor em comparação com as células de controlo (Figura S3A no ficheiro S1). Além disso, a caspase 3/7 ensaio revelou um aumento na sensibilidade TRAIL após o miR-34a e -34c aplicada expressão ou silenciamento PDGFR-α /β, em comparação com as células transfectadas com um ou mexidos miR siRNA (Figura 5c, d).

(a) Western blot em células Calu-6 após a expressão forçada miR-34a, -34b e -34c. MiR-34a-34c ou miR e não miR-34b forçado expressão diminui os níveis de expressão PDGFRβ e reduz a activação da ERK1 /2. (B) transferência de Western que mostra a inactivação da via de Akt e ERK após o silenciamento do PDGFR-α. (C) Caspase 3/7 ensaio. MiR-34a e -34c expressão executada em Calu-6 e H1703 células resistentes a semi, aumenta a resposta a apoptose induzida por TRAIL. (D) Caspase 3/7 ensaio que mostra que o PDGFR-α ou silenciamento PDGFR-β aumenta a resposta a apoptose induzida por TRAIL. (E) PDGFR-α ou sobre-expressão de PDGFR-β em células sensíveis TRAIL-H460 diminui a resposta ao fármaco. (F) O tratamento combinado de um inibidor do PDGFR (20? M) e concentrações diferentes de TRAIL (0-100-150 ng /ml) durante 24h sensibiliza células NSCLC a apoptose induzida por TRAIL. * P 0,001, ** P . 0,05

Além disso, a sobre-expressão de PDGFR-α e PDGFR-β em células sensíveis TRAIL-H460, o aumento da resistência à droga (Figura 5e e Figura S3C em S1 Arquivo). Por outro lado, o tratamento de células Calu-6 com um inibidor do PDGFR aumentou significativamente a sensibilidade à apoptose induzida por TRAIL (Figura 5F e Figura S3D em S1 do ficheiro). Curiosamente, a sobre-expressão de PDGFR-α ou PDGFR-β (utilizando-se dois plasmídeos que contêm apenas as sequências codificantes e não das UTRs 3 de PDGFR-α /β) juntamente com miR-34a ou miR-34c, diminuiu a sensibilidade à induzida por TRAIL apoptose, tal como avaliado por ambos MTT e caspase 3/7 ensaio (Figura S4 no ficheiro S1). Os resultados sugerem que PDGFR-α e PDGFR-β desempenhar um papel importante na apoptose induzida por TRAIL e que inibidor de PDGFR pode sensibilizar células NSCLC a trilha com consequências terapêuticas importantes.

PDGFR-α /β downregulation por miR- 34a-34c e miR inibe a migração e a invasão de células NSCLC

Como PDGFR-α /β regular a via PI3K /Akt, nomeadamente envolvidos na migração e invasão de tumores diferentes [27,28], nós investigamos se o miR -34a /c poderia influenciar a migração NSCLC e invasão através PDGFR-α e downregulation PDGFR-β. Para testar directamente o papel funcional de miR-34a /c na tumorigénese, que sobre-expresso destes dois miARNs ou silenciados PDGFR-α /β em Calu-6 ou células H1703. Curiosamente, observou-se uma diminuição significativa das capacidades migratórias e invasivos de Calu-6 e as células H1703 após miR-34a ou a sobre-expressão de miR-34c (Figura 6a), bem depois de PDGFR-α e downregulation PDGFR-β (Figura 6b), confirmada também por ensaio ferida-zero (Figura 6c). Para verificar melhor que o PDGFR-α e PDGFR-β estavam envolvidos na tumorigénese de células NSCLC, o miR-34a e -34c foram transfectadas em células Calu-6, isoladamente ou em combinação com um plasmídeo que sobre-expressam apenas a sequência de codificação e não a UTR 3 ‘ de PDGFR-α e PDGFR-β. MiR-34a /c aplicada expressão reduzida migração e invasão de Calu 6 células, mas a sobre-expressão de PDGFR-α ou PDGFR-β, juntamente com os dois microRNAs, parcialmente restaurada as capacidades de migração e invasão, sugerindo que o miR-34a /c regular NSCLC tumorigénese, pelo menos em parte, através de PDGFR-α /β (Figura 6 d, e).

(a) miR-34a e -34c aplicada expressão reduz as capacidades migratórias e invasivos de células H1703. (B) PDGFR-α e PDGFR-β silenciamento reduz as capacidades migratórias e invasivos de células Calu-6. RFU = Unidades de fluorescência relativa. (C) fotografias representativas das áreas riscadas da monocamada confluente de Calu-6 células transfectadas com miR-34a /c ou controlo miRNA (miR-CTR) às 0h, 12h e 24h após o ferimento com uma ponta de pipeta. barra de escala, 100 mm. A ampliação é a mesma para todos os painéis. (D-e), PDGFR-α e a sobre-expressão de PDGFR-β parcialmente resgata capacidades migratórias e invasivos de células Calu-6. * P . 0,05

Discussão

O cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em homens e mulheres em todo o mundo

1. The American Cancer Society estima 156,940 mortes por câncer de pulmão nos Estados Unidos para 2011 isoladamente [29]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável pela maioria dos casos de câncer de pulmão e é a principal causa de mortalidade por câncer [30].

A alta taxa de mortalidade associada ao câncer de pulmão levou inúmeros esforços exaustivos para identificar novos alvos terapêuticos e modalidades de tratamento para esta doença mortal. receptores derivados das plaquetas factores de crescimento (PDGFRs) e os seus ligandos, factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs) desempenham papéis críticos na migração das células mesenquimais e proliferação. Anormalidades do PDGFR /PDGF são pensados ​​para contribuir para uma série de doenças humanas e, especialmente, a malignidade [31].

MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que mostram a desregulamentação na maioria dos cânceres. Há evidências crescentes de que eles desempenham papéis importantes na patogênese e prognóstico de malignidades humanas e na resistência aos medicamentos quimioterapêuticos [32,33]. factor de indução de apoptose relacionado com o ligando (TRAIL) de necrose do tumor desencadeia a apoptose em células tumorais, mas quando é utilizado sozinho, é ineficaz no tratamento de tumores TRAIL-resistente. Esta resistência é um desafio para as terapias anti-cancro à base de TRAIL. Neste estudo, verificou-se que o miR-34a e miR-34c são fortemente downmodulated em ambas as células NSCLC e tumores do pulmão em comparação com tecidos normais. expressão forçada de miR-34a e miR-34c subregulado PDGFR-α e PDGFR-β mRNA e os níveis de proteína. Luciferase e experiências de Western blot demonstrou que o PDGFR-α e PDGFR-β são alvos directos de miR-34a e miR-34c mas não de miR-34b. A resistência de muitos tipos de cancro às quimioterapias convencionais é um importante factor que prejudica o tratamento do câncer de sucesso. activação AKT, também contribui para a tumorigénese e metástase tumoral, e como mostrado, mais recentemente, a resistência à quimioterapia [26,34]. Como resultado, ambos

in vitro

e

in vivo

estudos combinando pequenas moléculas inibidoras da via PI3K /Akt com a quimioterapia padrão têm sido bem sucedidos em atenuar a resistência quimioterápico. Especificamente, inibindo a atividade de AKT pode ser uma abordagem válida para tratar o cancro e aumentar a eficácia da quimioterapia.

As proteínas quinases são importantes reguladores da maioria das vias de sinalização celular. Entre eles, tirosina-quinases receptoras (RTKs), tais como PDGFR, desempenham papéis cruciais na promoção do crescimento e proliferação celular por transdução de estímulos extracelulares para os circuitos de sinalização intracelular [35]. Um componente importante da máquina de sinalização intracelular é o PI3K Akt (PKB) target //da rapamicina em mamíferos (PI3K /Akt [PKB] /mTOR) via [36,37]. activação aberrante desta via por mutação de qualquer um dos vários genes é conhecido por ocorrer na maioria dos cancros humanos através de vários mecanismos [38,39]. Num trabalho anterior [26], que demonstraram que MET, através da activação da via PI3K /AKT, tumorigénese induzida por TRAIL e resistência em NSCLC. Portanto, a hipótese de que o PDGFR-α /β, através da activação da via do AKT deve ser envolvida na apoptose induzida por TRAIL. De facto, a sobre-expressão de miR-34a e miR-34c ou infra-regulação de PDGFR-α /β por ARNsi, altamente aumentou a resposta das células NSCLC semi-resistentes à apoptose induzida por TRAIL-. Mais importante, o tratamento combinado de um inibidor do PDGFR com TRAIL, aumento da apoptose e a proliferação celular reduzida, como avaliado por ensaios de ensaio de caspase 3/7 e MTT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que o tratamento combinado de TRAIL com inibidores PDGFR poderia sensibilizar um subconjunto de tumores pulmonares, que expressam os receptores dos FCDP, para a droga. Além disso, sabe-se bem que a via PI3K /AKT, bem como os ERK1 /2 vias de regular a migração celular e invasão de cancros diferentes [40,41]. Aqui, relatamos que o miR-34a e sobre-expressão de miR-34c ou PDGFR-α /β silenciamento inibiu a capacidade de migração e invasão de Calu-6 e as células H1703, em comparação com células transfectadas com um controlo ou ARNsi miR mexidos. expressão forçada de PDGFR-α ou PDGFR-β parcialmente restaurada migração NSCLC e invasão de apoio que a regulação da expressão destes receptores por miR-34a /c desempenha um papel importante no NSCLC tumorigênese. No entanto, reconhecemos que outros alvos miR-34a /c incluindo c-Met [16] e AXL [42] também poderia estar envolvido. Enquanto este manuscrito foi em preparação Silber et al. relatou que a expressão de miR-34a foi menor em gliomas proneural em comparação com outros subtipos de tumor e identificado PDGFR-α como um alvo directo de miR-34a [43]. Aqui, nós relatamos que não só miR-34a mas miR-34c também regula negativamente PDGFR-α em células NSCLC. Além disso, demonstramos que PDGFR-β é um miR-34a c target /direta, enquanto nós não ver qualquer efeito significativo sobre a expressão de PDGFR-α e PDGFR-β após o miR-34b aplicada expressão. Notavelmente, o nosso estudo mostra que a inibição ou a regulação negativa do PDGFR-α e PDGFR-β por miR-34a /c antagoniza tumorigenicidade e aumenta a sensibilidade à morte celular induzida por TRAIL com importante aplicação terapêutica para a terapia anti-tumoral futuro de cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

linhas e células do cancro do pulmão amostras de tecido

H460 humano, A549, linhas de células H1299, H1703 foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e com 2 mM de L-glutamina e 100Uml-1 de penicilina-estreptomicina. Calu-6 células foram cultivadas em MEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, L-glutamina 2mM e 100Uml-1 de penicilina-estreptomicina. 9 tumores pulmonares (incluindo adenocarcinoma eo carcinoma de células escamosas) e suas contrapartes normais foram gentilmente cedidas pelo Dr. S. P. Nana-Sinkam Pulmonar, Alergia, Critical Care e Medicina do Sono, The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Columbus, OH. amostras de tecido normal e tumoral 48 pulmonares foram fornecidos a partir do Departamento de Patologia da Universidade do Estado de Ohio. Todos os tecidos humanos foram obtidos de acordo com um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board do Estado de Ohio.

luciferase ensaio

Os “UTRs 3 dos genes PDGFRA e PDGFRB humanos, foram amplificados por PCR usando o seguinte primers:

PDGFR-α FW 5 ‘TCTAGACCG GCCTGAGAAACACTATTTGTG 3’

PDGFR-α RW 5 ‘TCTAGAACATGAACAGGGGCATTCGTAATACA 3 “

PDGFR-β FW 5′ TCTAGAAAAGAGGGCAAATGAGATCACCTCCTGCA 3 ‘

PDGFR-β RW 5 ‘TCTAGATATTGAGAACCCACTCTCCCTCCTTGGA 3’

e clonado a jusante do codão Renilla luciferase parada em pGL3 vector de controlo (Promega). Estas construções foram utilizadas para gerar, por PCR inversa, os mutantes plasmídeos p3′-UTRs- utilizando os seguintes iniciadores:

PDGFR-α Mut1 FW 5 ‘ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATCGCCTCG 3’

PDGFR-α Mut1 RW 5 ‘CGAGGCGATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT

PDGFR-αmut2 FW: 5′ ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATGGTCGTTTATATTT 3 ‘

PDGFR-αmut2 RW: 5′ AAATATAAACGACCATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT 3 ‘

PDGFR-β Mut FW 5′ -ATGGGGGTATGGTTTTGTCAGACCTAGCAGTGAC-3 ‘

PDGFR-β Mut RW 5′-GTCACTGCTAGGTCTGACAAAACCATACCCCCAT-3′

células Calu-6 foram co-transfectados com 1 ug de p3’UTR-PDGFR-α, p3 UTR-PDGFR-β ou com p3’UTRmut-PDGFR-α e p3’UTRmut-PDGFR-β, 1 ug de uma expressão de luciferase de Renilla construir pRL-TK (Promega) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células foram colhidas 24 h após a transfecção e ensaiados com dupla Ensaio da Luciferase (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Três experiências independentes foram realizados em triplicado.

Análise Western Blot

Total de proteínas a partir de NSCLC foram extraídas com ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão (NaCl 0,15 mM, 0,05 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1% de Triton, SDS a 0,1%, 0,1% de desoxicolato de sódio e 1% de Nonidet P40). extracto da amostra (50 ug) foi resolvido em 7,5-12% de gel de SDS-poliacrilamida (PAGE), utilizando um aparelho de mini-gel (Bio-Rad Laboratories) e transferido para Hybond-C nitrocelulose extra. As membranas foram bloqueadas durante 1 hora com leite seco magro a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20, incubadas durante a noite com anticorpo primário, lavadas e incubadas com o anticorpo secundário, e visualizados por quimioluminescência. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-PDGFR-α, anti-PDGFR-β, anti-ERK1 /2, de anti-p-ERK, anti-pAKT, anti-AKT total, a anticorpos anti-GAPDH (Cell Signaling). Utilizou-se um anti-coelho ou anti-imunoglobulina de murganho secundário G (IgG) conjugado anticorpo peroxidase (Chemicon).

-PCR em tempo real

-PCR em tempo real foi realizado utilizando um padrão de PCR TaqMan kit de protocolo sobre uma 7900HT Sequence Detection System Applied Biosystems (Applied Biosystems). A reacção de PCR incluiu 10 ul 0,67 ul de produto de RT, 1 ul TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,2 sonda TaqMan mM, iniciador de sentido directo a 1,5 mM e 0,7 mM de iniciador reverso. As reacções foram incubadas numa placa de 96 poços em 95

° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95

° C durante 15 s e 60

° C durante 1 min. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. O ciclo limite (CT) é definido como o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência passa o limiar fixo. O método CT comparativo para a quantização relativa da expressão do gene (Applied Biosystems) foi utilizado para determinar os níveis de expressão de miARN. O eixo y representa o 2 (-ΔCT), ou a expressão relativa das diferentes miRs. expressão Mirs foi calculada em relação ao U44 e U48 rRNA. Os experimentos foram realizados em triplicado para cada ponto de dados e análise de dados foi realizada por meio de software (Bio-Rad).

A morte celular e proliferação celular quantificação

Para a detecção de caspase 3/7 actividade, as células foram cultivadas em placas de 96 cavidades, em triplicado, tratadas com TRAIL (100-150ng /ml) e analisadas utilizando Caspase-Glo 3/7 Assay kit (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As variáveis ​​contínuas são expressos como valores médios ± desvio padrão (D.P.). A viabilidade celular foi examinada com 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-dipheniltetrazolium (MTT) -cell Titer 96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (Promega), de acordo com o protocolo do fabricante. Metabolicamente activas células foram detectadas através da adição de 20 ul de MTT a cada poço. Após 1 h de incubação, as placas foram analisadas num Multilabel Counter (Bio-Rad Laboratories).

anti-PDGFR-alfa e anti-PDGFR-β siRNAs transfecção

As células foram cultivadas a 50% de confluência e transf ectadas de forma transiente durante 72 horas utilizando Lipofectamina 2000 com 100 nM de anti-PDGFR-α e /ou com 100 nM anti-PDGFR-β SmartPool ARNsi de controlo ou ARNsi (Dharmacon), um conjunto de quatro alvo específica de 20-25 nt ARNsi concebido para derrubar a expressão do gene.

miARN bloqueado de ácido nucleico de hibridação in situ dos fixados em formalina, embebidos em parafina secção de tecido

a hibridação in situ (ISH) foi realizada em tecidos de pulmão humano desparafinadas usando anteriormente protocolo publicado [44], que inclui uma digestão de pepsina (1,3 mg /ml) durante 30 minutos. A sequência da sonda que contém o ácido nucleico disperso bloqueado (LNA) bases com digoxigenina conjugada com o 5 modificado “final era: 5 ‘ACAACCAGCTAAGACACTGCCA 3’. O coquetel de tecidos e miARN sonda foram co-desnaturada a 60

° C durante 5 minutos, seguido de hibridação a 37

° C durante a noite e uma lavagem de rigor em SSC 0,2X e 2% de albumina de soro bovino a 4

° C durante 10 minutos. 0,05.