Abstract

Uma das questões-chave sobre alterações genômicas no cancro é se eles são funcionais no sentido de contribuir para a vantagem selectiva das células tumorais. A frequência com que ocorre uma alteração pode reflectir a sua capacidade de aumentar o crescimento de células cancerosas, ou, alternativamente, o reforço da instabilidade de um local pode aumentar a frequência com que se encontra a ser aberrante em tumores, independentemente de impacto oncogénica. Aqui temos abordado este em uma escala de todo o genoma para exclusões focais associados ao câncer, que são conhecidos para identificar ambos os genes supressores de tumor (supressores tumorais) e loci instável. Com base no DNA análise do número de cópias de mais de mil cânceres humanos representando dez tipos de tumores diferentes, observamos cinco loci com frequências de exclusão focais acima de 5%, incluindo o

A2BP1

gene em 16p13.3 e

gene MACROD2 Restaurant at 20p12.1. No entanto, nem a expressão do RNA nem estudos funcionais que corroboram a função supressora de tumores em qualquer um dos genes. Outras análises sugerem vez que estes são locais de aumento da instabilidade genómica e que eles se assemelham a locais frágeis comuns (CFS). ampla análise do genoma revelou propriedades de deleções recorrentes CFS-like que as distinguem das eliminações que afectam genes supressores de tumores, incluindo o seu isolamento em loci específicos de distância a partir de outros sítios de deleção genómicas, um tamanho de exclusão consideravelmente menor, e a dispersão por todo o locus afectado, em vez de montagem em um local comum de sobreposição. Além disso, deleções CFS-como ter menos impacto sobre a expressão do gene e são enriquecidos em linhas celulares em comparação com tumores primários. Mostramos que loci afectados por deleções-CFS, como são frequentemente distintos dos sítios frágeis comuns conhecidos. Na verdade, descobrimos que cada tipo de tecido do tumor tem seu próprio espectro de eliminações CFS-like, e que os cancros do cólon têm muitas mais CFS-como deleções do que outros tipos de tumores. Nós apresentamos regras simples que podem identificar exclusões focais que não são CFS-like e mais susceptível de afectar supressores de tumor funcionais

Citation:. Rajaram M, Zhang J, Wang T, Li J, Kuscu C, Qi H, et ai. (2013) Duas categorias distintas de Focal Eliminações em Câncer Genomas. PLoS ONE 8 (6): e66264. doi: 10.1371 /journal.pone.0066264

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Janeiro, 2013; Aceito: 03 de maio de 2013; Publicação: 21 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Rajaram et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede CA124648 e RC2CA148532. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na câncer humano é geralmente o caso que mutações pontuais altamente recorrentes, tais como as que ocorreram em

KRAS

ou

TP53

, contribuir para a vantagem selectiva das células tumorais. No entanto, o caso é menos clara com alterações no número de cópias de DNA, onde algumas alterações frequentes, tais como amplificação do

ERBB2 /HER2

lócus fornecer claramente uma vantagem seletiva, enquanto outros, como as eliminações frequentes de DNA nas extremidades teloméricas de cromossomos provavelmente não. Isto significa que a frequência de alteração por si só não é suficiente para determinar se ou não uma determinada cópia DNA número de alteração impacta diretamente oncogenicity. Em nenhum lugar isso tem sido mais difícil trazer à tona do que para candidatos genes supressores de tumores localizados em sítios frágeis comuns. locais frágeis comuns são encontrados em todo o genoma humano e são propensos a quebras de ADN quando a célula é exposta ao stress replicação parcial [1], [2]. As células cancerosas freqüentemente mostram exclusões hemizigóticas ou homozigotos nestes loci e, além disso muitas vezes há alterações do gene subjacente expressão [3]. funções supressores de tumor foram encontrados para alguns destes genes, incluindo

WWOX

,

FHIT

, e

PARK2

, e essas funções incluem efeitos de supressão de crescimento de restaurar a expressão deficiente linhas celulares e mutações de perda de função levando a uma melhoria do cancro ou geneticamente manipulada induzida por carcinogénico em ratinhos [3], [4], [5]. Outros estudos fizeram observações que não suportam um papel supressor de tumor por estes genes, incluindo a incapacidade de detectar inativação de mutações pontuais [6], [7] e o fracasso freqüente de eliminações para afetar RNA ou proteína expressão subjacente [7], [ ,,,0],8], que são ambos características comuns de outros genes supressores de tumores.

Anteriormente descobrimos e validadas por rastreio de 26 oncogenes funcionalmente conjuntos de genes que são focalmente amplificados no cancro humano e semelhante validaram genes supressores tumorais que 10 foram encontrados em eliminações focais que afetam câncer de fígado [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Começamos este estudo com o objetivo de validar dois tumorais candidatos gene supressor de que foram excluídos focally em alta frequência particularmente no cancro colorectal,

A2BP1

e

MACROD2

. Em contraste com os resultados obtidos por triagem eliminações focais no câncer de fígado, não encontramos que esses genes eram supressores de tumor, o que nos levou a dar uma olhada em todo o genoma para as propriedades de genes focally apagados em um grande conjunto de dados de DNA número de cópias alterações afetando mais de 1000 amostras de câncer. Isso levou à descoberta de duas classes de supressões focais no câncer humano, que se assemelha eliminações que afectam os sítios frágeis comuns e outro que se assemelha eliminações afetando

CDKN2A /B

. Desde então, um exame de todo o genoma de pequenas deleções em 270 linhas de células humanas de câncer tem sido relatado que também encontra duas classes de supressões focais [16], e enquanto nossas conclusões são muito semelhantes às deles, existem algumas distinções e nuances importantes sobre as duas classes e resultados adicionais que são descritos abaixo.

resultados

Sites comuns de deleções focal em Câncer Humano

o nosso conjunto de dados foi gerada pela matriz análise de CGH de 850 primário tumores e 304 linhas de células de cancro ou xenoenxertos de diversos tipos de tecidos, incluindo o cérebro, mama, cólon, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, próstata, e pele (melanoma) (Tabela S1). Seguindo a normalização de dados e segmentação que detectou um total de 10.835 supressões focais ( 10 MB) nestes 1.154 amostras (Tabela S2). O tamanho médio de deleções, tanto focal e grande, é o mais curto em telómeros como esperado (Figura 1A, Figura S1 S1 Ficheiro) e, por conseguinte, uma percentagem substancial (13%) de deleções focais envolvidos extremidades teloméricas, particularmente ambas as extremidades do X cromossoma eo braço p do cromossomo 4 (Tabela S3). A Figura 1 mostra a distribuição de outro 87% de deleções focais em todo o genoma, binados em intervalos de 2-MB. Havia cinco loci que mostraram frequências de exclusão focais superior a 5% e corresponderam ao

CDKN2A /B

,

FHIT

e

WWOX

loci, supressor de tumor conhecido ou suspeito genes, e o

MACROD2

e

A2BP1

loci (Figura 1B). Eliminações afetando

A2BP1

(também conhecido como

RBFOX1

) foram muito freqüentes no câncer colorretal (21%), mas consideravelmente menos frequente ou ausente em outros tipos de tumor (1-4% no ovário, fígado e cancros do pulmão e da mama em ausente, melanoma, próstata e pâncreas). Da mesma forma, deleções afetando

MACROD2

foram mais freqüentes no câncer colorretal (17%), mas consideravelmente menos frequente ou ausente em outros tipos de tumores (0,5-3% na mama, fígado e pulmão e ausente no ovário, melanoma, próstata, e cancros pancreáticos). eliminações frequentes afectando

A2BP1

e

MACROD2

no câncer de cólon têm sido observados por outros [17], [18].

(A) O tamanho médio segmento de DNA como uma função de posição no cromossoma 1 é apresentada. (B) os 9,401 deleções focais que não eram telomérica foram binned em intervalos de 2 Mb e usados ​​para gerar uma distribuição de frequência em todo o genoma. O intervalo genômico mais acometida correspondeu à

CDKN2A /B

lócus e os próximos seis intervalos genômicas mais frequentemente afectadas são indicados com setas vermelhas e o gene relevante.

Exame de

A2BP1

e

MACROD2

como genes supressores de tumor potenciais

Foram examinados os efeitos do

A2BP1

e

MACROD2

eliminações na expressão do gene subjacente em cancros do cólon e os tecidos normais de cólon. expressão de ARN de

A2BP1

não pôde ser detectado em tempo real por RT-PCR em qualquer um dos tecidos do cólon, tumores ou linhas celulares de cancro normais que foram examinados (Figura 2A). Para ajudar a confirmar este resultado negativo, nós projetamos três sondas adicionais para real-time RT-PCR padrão e RT-PCR, mas em cada caso não conseguiram detectar

A2BP1

em amostras de cólon, apesar de ser capaz de detectar facilmente a sua a expressão no cérebro (Figura 2A). Estes resultados são consistentes com um relatório anterior que a expressão de

A2BP1 /RBFOX1

, que codifica um factor de splicing alternativo, é restrito para o coração, músculo, e cérebro [19]. Embora não possamos descartar de nível muito baixo mas a expressão fisiologicamente relevante de

A2BP1

em amostras de cólon, não observamos nenhum supressores tumorais crescimento ou efeitos supressores de expressar

A2BP1

em linhas celulares de cancro do cólon deleções albergando (Figura 2B). Além disso, embora

MACROD2

é expresso em células de cancro do cólon, deleções não teve nenhum efeito sobre a expressão tal como medido por RT-PCR quantitativo utilizando quatro sondas diferentes, incluindo três dentro de sequências de codificação e um na região não traduzida a 3 ‘. Nem exclusões ter qualquer efeito significativo sobre a expressão de proteínas MacroD2 (Figura 2C). Embora aparentemente paradoxal, estas supressões ocorreram todos dentro de íntrons de

MACROD2

e, portanto, não seria necessariamente esperado para afetar a expressão.

(A) Limiar de ciclos de PCR para a detecção de RT-PCR de

ACTB

(controlo) e

A2BP1

em duas amostras diferentes de tecido cerebral normal, quatro amostras diferentes de tecido normal do cólon, e linhas celulares de cancro do cólon 19. Valores abaixo de 40 indicam que não há detecção de sinal. (B) O efeito da expressão ectópica forçada de

A2BP1

na formação de tumores de linhagem de células de câncer de cólon HCT-15, que abriga uma deleção de 250 kb dentro

A2BP1

. Detecção da expressão por imunotransf erência usando um anticorpo policlonal que reconhece a proteína A2BP1 [38] é mostrada na inserção. Falta de tumor efeitos supressores também foram observados para as linhas celulares de cancro do cólon HCT-116 e SW480, tanto abrigando eliminações no

A2BP1

. (C) A expressão do

MACROD2

em linhas celulares de cancro do cólon, tal como determinado por TaqMan RT-PCR utilizando quatro sondas diferentes (três para as sequências de codificação e de um a UTR 3 ‘, todos afectada por deleções), comparando célula linhas que abrigam eliminações dentro do

MACROD2

gene para aqueles que não têm. A expressão relativa foi calculada pela Sc

método T usando

GADPH

níveis de expressão como referência. (D) A expressão de

MACROD2

em linhas celulares de cancro do cólon, conforme determinado por imunotransferência utilizando um anticorpo para MacroD2.

Patterns de eliminações que afetam

A2BP1, MACROD2, CDKN2A /B

, e

PTEN

Notamos várias diferenças nos tipos e padrões de exclusões que afetam

A2BP1

e

MACROD2

loci quando comparado com eliminações focais que afetam

CDKN2A /B Comprar e

PTEN

loci (Figura 3). Ao examinar todas as exclusões focais ( 10 Mb) que durou um lócus de quatro Mb centrada no gene alvo, descobrimos que deleções afetando o

A2BP1

e

MACROD2

loci eram, em média menor ( 0,6 Mb vs. 1,6 Mb, p = 1.5E-04). Além disso, as exclusões que afetam o

A2BP1

e

MACROD2

loci eram mais separadas e a maioria não convergem para um único local comum de sobreposição, em contraste com a

CDKN2A /B

e

PTEN

loci (Figura 3). Medimos o grau em que cada exclusão foi separado (não sobrepostas) de outras deleções ( “Separação de Exclusão”, ver Materiais e Métodos) e descobriu que havia uma diferença significativa entre o

A2BP1

e

MACROD2

loci e

CDKN2A /B Comprar e

PTEN

loci (0,4 vs. 0,16, p = 0,03).

Cada um dos quatro shows painéis (top ) um ideograma do cromossomo em que o gene destaque é localizado e (abaixo) uma visão ampliada de uma região de 4 Mb centrada no gene caracterizado, mostrando outros genes da região (localização com base no navegador UCSC Genome). Se o gene for suficientemente grande, a estrutura exão-intrão e /ou a direcção de transcrição do gene está indicada. Para a maioria dos genes, em particular nos painéis C e D, os genes são apresentados como rectângulos, devido ao seu menor tamanho. Mostrados abaixo de cada região expandida são barras horizontais indicam a extensão e os limites das exclusões individuais em tumores de cólon (Painéis A e B;

A2BP1

e

MACROD2

, respectivamente), os tumores de pulmão (painel C;

CDKN2A /B

) ou vários tipos de tumor (Painel D;

PTEN

). Os genes existentes em painéis C e D são destacadas em verde.

Em seguida, queria determinar se estas duas distinções entre as exclusões que afetam

A2BP1

e

MACROD2

loci por um lado, e

CDKN2A /B Comprar e

PTEN

loci, por outro lado realizada verdade quando se comparam eliminações que afectam os sítios frágeis comuns conhecidos e genes supressores de tumor recessivos do Gene Census Cancer [20] , [21]. Em nosso conjunto de dados, havia 11 sítios frágeis ordinárias e 24 genes recessivos supressores de tumores que continham um tamanho de amostra suficiente de deleções ( 14) para esta análise estatística (Tabela S4). À semelhança do que observamos acima, neste conjunto maior de loci o tamanho médio exclusão que afectam os sítios frágeis comuns foi significativamente menor do que aquelas que afetam supressores de tumor recessivos (0,6 Mb vs. 3,3 Mb, p = 9e-06, Figura 4A). Da mesma forma, a métrica “Exclusão Separação” foi significativamente maior em sítios frágeis comuns do que era em genes supressores de tumor recessivos (Figura 4B). Este último resultado sugere que as supressões que afectam estes dois grupos surgem por diferentes mecanismos. As deleções em genes comuns sítio frágil pode ser induzida pelo stress replicativa e danos no ADN e subsequente reparar [22], eliminações que afectam

CDKN2A /B

têm sido sugeridos para surgir a partir de recombinação aberrante ou de reparação do ADN pela junção de extremidades não homóloga [ ,,,0],23]. Em apoio à ideia de que estes dois tipos de exclusões surgem por mecanismos distintos, verificou-se que a frequência de co-ocorrência de deleções em genes diferentes sites e co-ocorrência de eliminações em diferentes genes supressores de tumor frágil comum era maior do que a co -deletion de CFS e genes supressores de tumor (Figura 4C).

(a) da caixa e parcelas suiça para “tamanho Eliminação”, que mede o tamanho mediano de eliminações dentro de uma janela de 2 MB centrada no gene, genes comuns frágeis do site (laranja) e genes supressores de tumor (azul) (B) Box e enredos suiça para “separação de Exclusão”, que mede a separação (não sobrepostas) de deleções dentro de uma janela de 2 Mb centrada no gene, ( C) a tendência co-supressão de genes comuns frágeis do site (laranja) e genes supressores de tumor (azul) em relação ao co-supressão de genes de diferentes classes (cinza).

Propriedades adicionais que distinguem eliminações que afectam os sítios frágeis comuns

a seguir, queria determinar se a incapacidade de eliminações para afetar a expressão de

MACROD2

foi uma observação mais generalizável que poderia ser usado para distinguir os genes de sites como frágeis comuns de genes supressores de tumores. Nós determinamos a correlação de expressão do RNA e do número de cópias de DNA para 115 amostras de cancro em que teve tanto de perfis de expressão gênica e os dados ROMA aCGH. Em comparação com as correlações do grupo supressor de tumor, houve um efeito muito pequeno do número de cópias do DNA na expressão génica no grupo sítio frágil comum (p = 0,003, Figura 5A), indicando que esta função pode ser útil na previsão ou não um determinado local de deleções foi CFS-like. Nós, então, examinou se o valor médio cópia de DNA número foi significativamente diferente, o que reflete o grau em que as supressões eram homozigotos contra heterozigotos. Mesmo que não houve diferença estatisticamente significativa entre os valores do número de cópia média DNA (p = 0,09), não parecia haver uma maior gama de valores mais baixos para o grupo supressor de tumor, indicando que alguns destes genes têm deleções mais homozigotos do que os genes sítio frágil comuns (Figura 5B).

gráficos de dispersão de pontos de valores para as estatísticas que distinguem eliminações focais que afetam genes sítio frágil comum (CFS) (laranja) de genes supressores de tumor (azul). (A) “Correlação RNA /DNA”, que corresponde ao coeficiente de correlação de Pearson de valores de número de cópias de ADN transformado-log2 e valores de expressão RNA relativos para as amostras 115 tumorais com tanto matriz CGH e RNA perfil de expressão de dados, (B) DNA Copiar número é o valor médio dos valores do número de cópias de DNA segmentada. (C) Linha Celular Proporção “, que fornece uma medida relativa da frequência Exclusões para um dado gene são encontrados em linhas de células de tumores, em vez de primárias. Painéis (D) e (E) mostram o número de exclusões encontrados em cada gene dentro de uma região de 10 Mb centrada no

MACROD2

loco (D) e TP53 e

MAP2K4

loci (E) . (F) parcelas suiça de “Isolamento Eliminação”, que mede a frequência com que genes vizinhos são eliminados em relação ao gene destaque.

Nós também descobrimos que eliminações que afectam os sítios frágeis comuns foram mais comuns no cancro Box e linhas celulares do que em tumores primários, quando em comparação com deleções que afectam supressores de tumor (p = 7e-05, a Figura 5C). Isto é particularmente evidente no cancro da mama, onde

MACROD2

e

FHIT

são eliminados em 28% e 15% das linhas de células de câncer de mama, respectivamente, mas ou não em todos (

FHIT

) ou em apenas um em cada 255 tumores primários (

MACROD2

) (Tabela S5).

FHIT

foi co-suprimido com

MACROD2

em 75% das linhas de células com

FHIT

eliminação, indicando que, para determinadas linhas de células de cancro da mama, estresse replicativo seguido por DNA quebra e reparação pode ocorrer durante a adaptação à cultura de células e afetar vários genes comuns sítio frágil.

ao olhar para genoma coordenar lotes de frequências de exclusão focais, observamos que as exclusões freqüentes afetando

MACROD2

foram relativamente isolada ao longo do genoma e que a contagem de freqüência caiu vertiginosamente para os genes imediatamente à esquerda e à direita do

MACROD2

(Figura 5D). Isso foi muito distinto do bairro genoma de deleções focais que afetam os genes supressores de tumor

TP53

e

MAP2K4

, que ambos os picos formados de contagens de exclusão, mas de forma menos dramática no contexto de regiões genômicas com um maior taxa global de exclusões (Figura 5E). Quisemos determinar se esta diferença era uma característica que distingue os genes generalizável sítio frágil comuns a partir de genes supressores de tumores, e desenvolvida uma métrica “Isolamento Supressão” que mediram a quantidade de a frequência de supressão de um dado gene foi maior do que os genes vizinhos. Esta métrica foi consideravelmente maior em local comum genes frágeis do que em genes supressores de tumores ( 40 vezes, p = 0,00001). (Figura 5F)

Análise Computacional e Classificação de Focais Eliminações

queria usar esses seis propriedades para analisar eliminações em uma escala de todo o genoma. Restringimos nossa atenção para genes com deleções suficientes para obter resultados estatisticamente significativos ( 14 eliminações; 4.823 genes). Nós explorou pela primeira vez se alguma das seis propriedades eram redundantes, determinando se eles foram altamente correlacionados com qualquer um dos outros cinco. Embora o tamanho da deleção foi moderadamente correlacionada com a separação de deleção (r = 0,39), todas as outras correlações entre pares eram insignificantes (variando entre -0,13 a 0,18), e procedeu-se a incluir todos os seis propriedades para análise sem supervisão. Nós, então, transformou as seis propriedades usando análise de componentes principais e plotados os 4.823 genes utilizando os três primeiros componentes principais. O gráfico resultante mostrou que a maioria dos genes foram mais semelhantes aos genes supressores de tumor recessivo (Figura 6A). Com uma excepção, os genes do sítio frágil comuns foram bem separados a partir do grupo principal e foram semelhantes para apenas um pequeno número de genes adicionais (Figura 6A). Este resultado indicou que a maioria dos genes que são orientadas por deleções focais são semelhantes aos genes supressores de tumor, ao passo que um número consideravelmente menor de genes são semelhantes aos genes comuns sítio frágil. Para testar essa ideia de forma independente, usamos métodos de aprendizado supervisionado (máquinas de vetores de suporte e da floresta aleatório [RF]) para classificar os 4.823 genes em CFS-similares ou tumorais categorias supressores. Os resultados destes dois métodos foram significativamente correlacionados (r = 0,72) e ambas classificadas como a maioria dos genes de supressão tumoral, como, de acordo com a análise não supervisionada (Figura 5B). As três variáveis ​​que foram mais importantes na classificação RF foram tamanho exclusão, separação exclusão e isolamento supressão (Tabela S6). Com apenas essas três variáveis, geramos um novo classificador RF que produziu resultados que estavam 99% idêntico com o classificador originais, estabelecendo estas três propriedades como os determinantes mais críticos quanto a saber se um determinado padrão de deleções focais é CFS-like ou supressor de tumor -como.

os genes que tinham 15 ou mais deleções focais (4.823) foram analisadas pelo método de aprendizado não supervisionado de Análise de componentes Principais (PCA) e classificadas por dois métodos de aprendizagem supervisionadas, Support Vector Machine (SVM) e aleatórios floresta (RF). (A) Representação gráfica dos 4.826 genes com base nos seus valores para os três primeiros componentes principais derivadas das propriedades de eliminação de sete genes que distinguem sítio frágil comuns a partir de genes supressores de tumores. genes sítio frágil comuns conhecidos são mostrados em azul, supressores de tumor conhecidos são mostrados em vermelho, e todos os outros são mostrados em verde. supressores de tumor mais conhecidos estão enterrados dentro do grande grupo de genes, enquanto os genes sítio frágil comuns conhecidos, com uma exceção (

GRANDE

), são claramente separados do grupo principal de genes pelo seu primeiro e segundo componente principal valores. Há apenas um punhado de outros genes que estão localizados perto dos genes sítio frágil comuns conhecidos. (B) Representação gráfica da classificação dos 4.826 genes com base em sua probabilidade de estar genes comuns sítio frágil pela Random Floresta (

y

-axis) ou Support Vector Machine (

x

-axis ) classificadores. Ambos os classificadores foram treinados sobre os 35 genes conhecidos CFS ou supressores de tumor (Tabela S4). A probabilidade de ser um supressor de tumores é um menos a probabilidade do CFS. A maioria dos genes são agrupadas no quadrante inferior esquerdo; Portanto, ambos os classificadores prever com grande probabilidade de que a maioria destes genes são supressores tumorais.

Validação de

MACROD2

como um sítio frágil Comum Gene

Para testar se nossa classificação pode predizer com sucesso os novos genes de genes sítio frágil comuns, examinamos se indução de estresse replicativo em uma linha de células de câncer de cólon pode gerar eliminações em

MACROD2

ou

A2BP1

, que, juntamente com o conhecido gene gene local comum frágil

FHIT, Quais são os três genes mais frequentemente afectadas por eliminações focais em câncer de cólon. Nós projetamos uma matriz de telha feita sob encomenda para estes três genes e, em seguida, realizada aCGH, comparando o ADN da linha celular original para DNA a partir de oito diferentes clones isolados após uma breve indução de estresse replicativo. Quatro dos oito clones mostrou deleções dentro

MACROD2

, e dois dos oito clones mostrou deleções dentro

FHIT

(Figura 7). Isto estabelece que

MACROD2

, que não foi previamente mostrado como sendo um gene sítio frágil comum em linfócitos, é de facto um gene comum sítio frágil quando ensaiado numa linha celular de cancro do cólon. O fato de que

MACROD2

foi prontamente detectado como um gene sítio frágil comum em células cancerígenas do cólon, mas não em linfócitos é consistente com evidências anteriores de que diferentes tipos de células apresentam diferentes perfis de sites frágeis comuns [24].

(a) um diagrama esquemático do experimento, que usou uma matriz de azulejos personalizado para determinar se a indução afidicolina de estresse replicativo poderia gerar deleções focais em três locos (

A2BP1

,

MACROD2

, e

FHIT

) em células de cancro epitelial do cólon. Não há exclusões que afetam

A2BP1

foram observados nos 8 clones examinados; 4 de 8 clones apresentou deleções afetando

MACROD2

; e 2 clones apresentou deleções afetando

FHIT

. (B) Um exemplo de uma deleção focal induzida afetando o

MACROD2

lócus. O

x

-axis representa uma região de aproximadamente 1 Mb abrangendo

MACROD2

. As linhas azuis representam os valores de número de cópias de ADN normalizados, e as linhas de laranja representam os valores de número de cópias de ADN segmentados. (C) Um exemplo de uma deleção focal induzida afetando

FHIT

. (D) Um exemplo de um locus inalterado (o locus HLA em 6p cromossomo).

Diferentes tipos de tumores têm diferentes freqüências e espectros de eliminações dentro CFS-like Genes

Curiosamente, verificou-se que os tumores do cólon foram, de longe o mais frequentemente afectadas por eliminações focais nos genes CFS-like, com frequências de eliminação tão elevadas quanto 21% para

A2BP1

, 17% para o

MACROD2

, 9 % para

FHIT

e 9% para

PARK2

(Figura 8A). Nenhum dos outros nove tipos de tumor foram tão freqüentemente afetados. O câncer de pulmão foi o próximo mais afetados, mas curiosamente tinha um espectro de frequências diferente, com

LRP1B

sendo o gene CFS-como mais frequentemente suprimida em 4% (Figura 8A). Vários cânceres não pareceu ser afetada em tudo, incluindo glioblastomas, CLL, e cancros da próstata, e muitos tiveram muito baixa freqüência de deleções de genes CFS-like, incluindo o cancro da mama, que mostrou

PARK2

como seu mais frequentemente excluídos gene CFS-like pouco acima de 2% (Figura 8A).

(a) a frequência com que o sítio frágil comum indicada ou gene CFS-like é excluído em diferentes tumores primários. (B) A frequência com que o gene indicado comum sítio frágil ou CFS-like for excluído em linhas celulares de cancro.

A frequência e espectro de deleções em genes CFS-como foi diferente para todos os tipos de tumores quando se compara a linhas celulares de tumores primários (Figura 8B). Em linhas celulares de cancro do cólon, deleções afectada

FHIT

em mais de 60% das linhas de células em comparação com 9% dos tumores primários. Em linhas celulares de cancro da mama,

FHIT

foi eliminada em 10% das amostras, mas não em todos em tumores primários (Figura 8B). Parece possível que isto pode refletir a plasticidade do genoma em

FRA3B

(o

FHIT

sítio frágil) em condições de cultura, eo mesmo pode ser verdade para o aumento da incidência de supressões no outro CFS-como genes quando comparando linhas de células para tumores primários.

Os genes site semelhante frágeis eliminados com mais frequência e genes supressores de tumor-like

a capacidade de prever novos supressores de tumor é mais pertinente para biologia do câncer do que a capacidade de prever novos genes sítio frágil. Nós fundamentado que esses genes supressores de tumor-like mais frequentemente afectadas por eliminações focais seria entre os candidatos mais fortes (Tabela 1). Curiosamente, deleções focais em apenas dois dos dez melhores genes foram previamente descritos (

CDKN2A /B Comprar e

MAP2K4

[25]). Dos outros oito genes, um é um supressor tumoral que se sabe ser inactivado por outros mecanismos genéticos [26] (

MEN1), e quatro são supressores tumorais candidatos com base em qualquer análise mutacional (

CSMD1

[27]), a análise funcional (

CDKN2AIP /CARF

[28],

MAD1L1

[29]), ou hipermetilação promotor específico do cancro (

RRAD

[30]). Por outro lado, dois genes propostos recentemente para ser supressores de tumor com base em sua eliminação focal no cancro,

PDE4D

[31] e

LRP1B

[32], estão entre os dez mais frequentemente CFS-como afetados genes e consequentemente não pode ser supressores de tumor funcionais (Tabela 1)

Discussão

Iniciamos este estudo para conciliar duas conclusões díspares:. ausência de candidatos supressores de tumor a partir de dois loci frequentemente afectadas por eliminações focais, ea capacidade de deleções focais para enriquecer supressores de tumor em uma tela funcional. Através da análise computacional e estatística de deleções focais presentes em mais de 1000 amostras de câncer, definimos duas classes distintas de eliminações em câncer que resolver essa incongruência: a classe que representa genes semelhantes a genes comuns sítio frágil, e outro que é supressor tumoral-like . Estes dois tipos de exclusões são susceptíveis de resultar de diferentes mecanismos, com base em seus tamanhos de exclusão diferentes e sua tendência a co-ocorrer. A uma classe de deleções, quando altamente recorrente, se sobrepõem um local comum e afectam significativamente a expressão dos genes subjacentes, indicando que a recorrência é accionado por vantagem selectiva às células tumorais em evolução. Em contraste, as deleções em local semelhante genes frágeis comuns não se sobrepõem um local comum nem têm efeitos significativos sobre a expressão do gene subjacente, todos que é consistente com a sua recorrência sendo impulsionado pela instabilidade inerente do locus genómico ao invés de seletiva vantagem.

Nossos resultados estabelecem que a maioria das exclusões focais pertencem à classe que representa genes supressores de tumor-like e não os genes comuns sítio frágil. Este é o único desacordo que temos com um estudo recente que sugere que a maioria das exclusões focais no cancro são frágeis-como base, em parte, em parte, na sua propensão para ser heterozigotos, em vez de homozigotos [16]. No entanto, acreditamos que essa propriedade não é útil como um classificador porque vários supressores de tumor, incluindo

TP53

e

CDH1

, são afetados por eliminações heterozigotos focais. Pode haver muitos supressores tumorais haploinsufficient, tais como

p27KIP1

[33], continuam a ser descobertos e ferramentas computacionais que descontar estes seriam equivocada. Em alguns casos, deleção homozigótica de um supressor de tumor pode ser letal, o que pode ser o caso para o gene checkpoint montagem do fuso

MAD1L1

que encontramos aqui a ser muito frequentemente afectados por deleções focais heterozigotas. Embora

MAD1L1

ainda não está no banco de dados COSMIC de supressores tumorais, eliminação heterozigotos de

MAD1L1

foi mostrado para aumentar a incidência de tumores causados ​​por perda parcial da

TP53