Abstract

O cancro do pulmão é o tumor maligno mais letal do mundo, e todos os anos milhares de pessoas morrem devido a esta doença. A detecção precoce provou aumentar a sobrevivência de 5 anos para este cancro, em geral, independente do local de origem no pulmão. Para enfrentar este desafio, temos utilizado com base em células SELEX (evolução sistemática de ligantes pela Exponencial Enriquecimento) para selecionar um painel de aptâmeros capazes de distinguir células de adenocarcinoma de pulmão de células epiteliais do pulmão normais. Estes aptâmeros ligar pelo fisiológica e condições fixados em formol e afinidade de exibição para seus alvos com aparente K

d’s no intervalo nanomolar. Nossos resultados sugerem que os aptâmeros selecionados têm o potencial para ser utilizado em ambientes clínicos, bem como para melhorar a classificação de amostras não-cirúrgicos, outro desafio atual no cancro do pulmão

Citation:. Jiménez E, Sefah K, López- Colón D, Van Simaeys D, Chen HW, Tockman MS, et al. (2012) Geração de Adenocarcinoma pulmonar de DNA Aptamers de Estudos do Câncer. PLoS ONE 7 (10): e46222. doi: 10.1371 /journal.pone.0046222

editor: Muy-Teck Teh, Barts A London School of Medicina e Odontologia, Queen Mary University of London, Reino Unido

Recebido: 07 de maio de 2012; Aceite: 28 de agosto de 2012; Publicado: 17 de outubro 2012 |

Direitos de autor: © Jiménez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Publicação de este artigo foi financiada em parte pela Universidade da Flórida Fundo Publishing Open-Access e pelos Institutos Nacionais de Saúde concede # 69953, Washington, DC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é o segundo tipo de câncer mais comum ea principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Nos Estados Unidos, estima-se que 226,160 novos casos e 160,340 mortes ocorrerão em 2012 (para não-pequenas células e de pequenas células combinadas). Comparado a outros tipos de câncer, neoplasias pulmonares são altamente heterogêneo, com tumores exibindo mais de um subtipo como uma característica comum [2]. A grande maioria das neoplasias pulmonares são os carcinomas, que são geralmente classificadas quer como carcinomas não-pequenas do pulmão (NSCLC) ou de carcinomas de pulmão de células pequenas (SCLC), com base em análise morfológica de amostras histológicas coradas [3] – [4]. NSCLC é o tipo de câncer de pulmão mais comum, compreendendo 85% de todos os casos de câncer de pulmão; no entanto, é um tipo de câncer mais passiva. NSCLC é composto de três subtipos diferentes: adenocarcinoma (ADC), o carcinoma de células escamosas (SCC), e carcinoma de células grandes (LCL). Por outro lado, SCLC é menos comum, que compreende 15% de todos os casos de cancro do pulmão, mas é mais agressiva. O tabagismo é um fator de risco fortemente associado ao câncer de pulmão, especificamente SCC [5] – [10]. Adenocarcinoma pulmonar é comumente desenvolvido por pacientes que nunca fumaram, e as alterações genéticas são frequentemente associados com o seu aparecimento.

Uma vez que a maioria das pessoas com câncer de pulmão na fase inicial não apresentam sintomas, mais de 70% de câncer de pulmão casos são diagnosticados em fases posteriores, para o qual a taxa de sobrevida em 5 anos é pequena. Portanto, a pesquisa visando à detecção precoce, que é crucial para a redução da mortalidade e morbidade, voltou-se para o desenvolvimento de aptâmeros adequados. Os aptâmeros são curtas de ADN ou ARN, oligonucleótidos de cadeia simples que são altamente específicas de elementos de reconhecimento do alvo com base nas suas formas tridimensionais exclusivos, [11] – [12]. Enquanto o processo conhecido como SELEX (evolução sistemática de ligandos por Exponential Enrichment) foi originalmente usado para seleccionar aptâmeros contra alvos tais como as proteínas purificadas [13] – [14], SELEX baseado em células tornou-se o mais novo método de selecção de aptâmeros contra células inteiras , especialmente os aptâmeros alvo proteínas de superfície sobre-expressos em células cancerosas.

Entre as suas muitas vantagens, aptâmeros não mostraram nenhum, ou muito baixa, imunogenicidade, permitindo

In vivo

estudos utilizando estas sondas [15] – [18]. Eles também têm sido popularizado como alternativas aos anticorpos, por causa do baixo custo ‘aptâmeros (nenhum animal) necessários para a produção, a modificação química fácil, e a capacidade de absorção celular. Além disso, porque aptâmeros são pequenos em comprimento com geralmente de 15 a 100 nucleótidos (nt), que têm uma melhor penetração do tecido em comparação com anticorpos. Em 2004, Macugen, um anti-VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) inibidor, tornou-se o primeiro aptâmero aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para macular relacionada à idade (DMRI) [19]. Outros aptâmeros permanecem em ensaios clínicos [20], e têm demonstrado grande potencial na área biomédica, incluindo a separação, a entrega de drogas e medição alvo-sonda. Este relatório descreve o uso de células-SELEX para selecionar um painel de aptâmeros capazes de distinguir entre adenocarcinoma de pulmão e células epiteliais do pulmão normais.

Resultados e Discussão

Desde a sua descoberta, aptâmeros foram gerados contra diferentes alvos, incluindo proteínas, péptidos, e as células vivas [21] – [22]. Para isolar aptâmeros capazes de diferenciar células de adenocarcinoma de pulmão de células epiteliais normais do pulmão, utilizou-se a estratégia SELEX baseado em células. adenocarcinoma do pulmão H23 e HBE 135-E6 /E7 pulmonar epitelial normal foram usados ​​como linhas celulares positivas e negativas, respectivamente. Uma biblioteca aleatória ADNcs inicial contendo aproximadamente 10

14 diferentes sequências de 80 nucleótidos (nt) foi enriquecida por ligação sequencial com as células-alvo, eluição e subsequente amplificação por PCR durante 18 ciclos. Estas sequências de DNA poderia reconhecer proteínas de membrana da superfície celular H23 que são potenciais marcadores para terapia-alvo. Em fases anteriores do processo, selecção contador foi introduzida, a fim de remover possíveis sequências de ligação de proteínas comuns tanto no alvo e linhas de células negativas. Este procedimento foi realizado qualquer outra rodada em toda a seleção. Sequências de ligação a células alvo foram eluídos e amplificados por PCR, após o que ADNcs foi recuperado e utilizado para monitorizar o processo de selecção por citometria de fluxo. Uma vez que os pools de ssDNA foram enriquecidos com sequências específicas para o alvo, um aumento na intensidade de fluorescência foi observado pela primeira vez no redonda 12 (Figura 1A), indicando que as sequências mostrou melhor ligação na superfície de células de H23 em comparação com a biblioteca inicial. À medida que a selecção progrediu, a intensidade de fluorescência das piscinas subsequentes aumentada gradualmente até se observar um estado estacionário na intensidade de fluorescência em círculos 17 e 18 (Figura 1B), o que indica que a ligação máxima foi alcançada. Em contraste, tal enriquecimento não foi observado quando os conjuntos enriquecidos foram testados contra células epiteliais normais do pulmão (Figura 1D), o que implica que as sequências contidas nesses piscinas foram capazes de distinguir células de adenocarcinoma de pulmão a partir de células epiteliais de pulmão normais. Portanto, piscinas 14, foram selecionados 16 e 18 a ser sequenciado como candidatos aptâmero (Figura 1C).

Ensaio de ligação de piscinas 11-18 com H23 (A-B) e piscinas 15-18 com HBE135 E6 /E7 (C). A citometria de fluxo de ensaio para monitorar a ligação de piscina seleccionado com H23 (células alvo) e HBE135 E6 /E7 (células negativas). A curva verde representa a ligação da biblioteca de DNA não selecionada fundo. Para H23 células, houve um aumento da capacidade das piscinas de ligação como a seleção progrediu, ao passo que houve pouca mudança para as células de controlo, HBE 135 E6 /E7. Aponte a figura 1: O objetivo desta figura é mostrar como o processo de seleção de célula foi enriquecido por linha de células H23, mas não para a linha de células HBE135E6 /E7

O processo de seqüenciamento começou com a construção de. a biblioteca 454 sequenciação por PCR de adição de iniciadores específicos para os 454-3′- e 5′- extremidades dos conjuntos enriquecidos. Para identificar o pool para cada sequência, um código único de identificação (código de identificação do meio, MID) foi também PCR-introduzidos à biblioteca 454 sequenciamento. A inserção de iniciadores nos conjuntos enriquecidos foi confirmada por electroforese em gel (resultados não apresentados). Após 454 sequenciamento no núcleo UF ICBR, cerca de 7.000 seqüências foram recuperados e analisados. Eles foram agrupados na base do MID correspondente à mesma piscina, e os iniciadores foram removidos por um programa Perl. As sequências contendo apenas a região aleatória foram então alinhadas utilizando o programa em linha MAFTT 6.0 [23], e seis famílias de aptâmeros correspondentes às sequências mais abundantes foram escolhidos como candidatos de aptâmeros. Eles foram sintetizados quimicamente, na extremidade 3 ‘, purificado por HPLC e quantificada marcado com biotina. Todos os aptâmeros de ligação exibida com células de adenocarcinoma do pulmão H23, enquanto nenhuma ligação significativa foi observada com a linha celular de controlo HBE 135 E6 /E7, células epiteliais normais do pulmão (Figura 2 e Figura S1). Estes resultados indicam que a seleção negativa sucesso tinha sido realizado e que os aptâmeros selecionados podia distinguir entre adenocarcinoma de pulmão e células epiteliais do pulmão normais, um resultado que confere estes aptâmeros com potencial para uso em diagnóstico de câncer de pulmão, monitorizar a progressão do tumor e tratamento, ou outra aplicações relevantes.

a citometria de fluxo de ensaio para a ligação do aptâmero EJ4 seleccionado com H23 (linha de células-alvo) e HBE135 E6 /E7 (linha celular negativa). A linha verde representa a ligação de uma sequência aleatória (biblioteca) de fundo. Objectivo Figura 2: O objectivo desta figura é mostrar que os aptâmeros candidatos são, de facto aptâmeros, porque eles se ligam com a linha celular positiva (H23), mas não se ligam com a linha celular negativa (HBE135E6 /E7)

.

Todos os aptâmeros selecionados mostraram afinidades (aparente K

d’s) para a linha de células H23 na faixa nanomolar (45-250 nM) (Tabela 1 e figura S6) vinculativo. Estes resultados sugerem que estes aptâmeros será amplamente aplicável, porque se ligam fortemente ao seu alvo. Outros estudos foram realizados para caracterizar os aptâmeros selecionados. A ligação foi ainda testado contra as linhas celulares de cancro do pulmão, bem como outras linhas celulares, incluindo ovário e cólon, como mostrado na Tabela 2. Os aptâmeros EJ2, EJ4 e ADE1 exibido algum reconhecimento para com uma ou mais das seguintes linhas celulares: TOV21G, DLD1, e H460. No caso de DLD1, uma linha celular de adenocarcinoma de cólon, foi interessante ver algum reconhecimento pelos aptâmeros seleccionados, o que sugere que um possível alvo da superfície celular comum está presente nestas duas linhas de células, uma vez que pertencem ao mesmo grupo histológico. Em um estudo anterior no nosso laboratório, a proteína alvo de Sgc8 aptâmero foi demonstrado ser PTK7 [24], um pseudo-quinase de proteína presente em células CEM (linha de células-alvo para que a selecção), bem como outros tipos de cancro, incluindo ovário , do pulmão, do cólon, da mama e algumas linhas celulares de leucemia, indicando que as proteínas comuns podem estar presentes como um resultado de cancro [25] – [26]. Os aptâmeros, EJ4 ADE1 e também mostrou especificidade particular para a linha celular de adenocarcinoma de pulmão com o aumento significativo da intensidade da fluorescência em relação a uma sequência aleatória, mas não para células de pulmão normal. Estes resultados sugerem que estes aptâmeros poderia ser usado para estudos de câncer de pulmão.

flexível de ligação de aptâmeros em diferentes temperaturas podem expandir seu repertório de aplicações. Uma vez que a selecção foi realizada a 4 ° C, foram realizados ensaios de ligação a 25 ° C e 37 ° C (Figura 3 e Figura S2). Como mostrado na Figura 3 e Figura S3, aptâmeros ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 e EJ7 conservado de ligação a 25 ° C e 37 ° C, com intensidades de fluorescência similares àquelas a 4 ° C. Isto é particularmente importante em ensaios realizados em condições fisiológicas, tais como aqueles que avaliam a

In vivo para aplicativos.

A citometria de fluxo ensaio para aptâmero selecionado EJ4 com H23 (linha de células-alvo) na temperatura fisiológica ( 37 ° C). A ligação a 4 ° C foi utilizado como o controlo positivo. A linha verde representa a ligação de uma sequência aleatória (biblioteca) de fundo. Objectivo Figura 3: O objectivo desta figura é demonstrar a ligação do aptâmero seleccionado EJ4 a 25 ° C e à temperatura fisiológica, 37 ° C

detecção do cancro baseia-se na análise de tecidos a partir de biópsias. , que são fixados em condições químicas para preservar a integridade e antigenicidade de amostras de tumores para uso posterior. Um ensaio importante no diagnóstico do cancro é a imunocoloração, em que os tecidos dissecados de fresco são fixados antes do tratamento com sondas, tais como anticorpos e aptâmeros, especificamente para os marcadores tumorais. Estudos anteriores demonstraram que os aptâmeros são capazes de rotulagem tecido fixado em formalina parafina (FFPE) após desparafinização antigénio e recuperação [27] – [28]. Para determinar a capacidade de ligação dos aptâmeros seleccionados sob estas condições, as células foram fixadas com formalina a 10% antes da incubação com aptâmeros rotulados. Como controlo para estas experiências, dois aptâmeros conhecidos para a leucemia, Sgc8 e TD05, e as suas correspondentes linhas celulares de ligação foram usados ​​para mostrar que o processo de fixação não produz qualquer sinal de fluorescência. Por conseguinte, qualquer fluorescência detectado deve ser uma indicação de um evento de ligação entre os aptâmeros e seu alvo. Como se mostra na figura S3, ambos os controlos mantiveram o seu perfil de ligação inicial, indicando que nenhum aumento artificial na intensidade de fluorescência ocorreu como resultado das condições de fixação. aptâmeros EJ2, EJ5, EJ7, ade1, e ADE2 mantida semelhante de ligação ao apresentado a 4 ° C (Figura 4), indicando que aptâmeros podem ligar-se aos seus alvos, mesmo sob condições fixas. Estes resultados sugerem fortemente que os aptâmeros seleccionados têm o potencial para serem utilizados como moléculas de reconhecimento em amostras clínicas.

Ensaio de ligação de aptâmeros com H23 (alvo), as células pré-fixadas com formalina a 10%. coluna da esquerda mostra a ligação de aptâmeros seleccionados com células não tratadas a 4 ° C. coluna da direita mostra a ligação de aptâmeros seleccionados células fixadas. A curva de luz verde representa a ligação de uma sequência aleatória (biblioteca) de fundo. Aponte a figura 4: O objetivo desta figura é mostrar a capacidade de ligação do aptâmero selecionado EJ4 às células que foram fixados com formalina a 10%

Durante a seleção de células, espera-se que os aptâmeros interagir. especificamente com as superfícies das células alvo; Este comportamento foi avaliado em diversos estudos [29] – [31]. Na nossa experiência, as células foram tratadas com duas enzimas, tripsina e proteinase K, durante 3 e 10 minutos, lavou-se com PBS, e depois incubado com aptâmeros. Todos os aptâmeros seleccionados perdido de ligação após o tratamento com as duas proteases (Figura 5 e Figura S5 Para todas as experiências, a intensidade de fluorescência foi significativamente reduzida;. No entanto, o sinal correspondente para os ensaios com proteinase diminuiu para o fundo, o que indica que a proteína alvo foi completamente removido . após tratamento

a citometria de fluxo para ensaio de aptâmeros seleccionados após o tratamento com proteases; as células não tratadas foram usadas como controlo positivo (a) células tratadas com tripsina para 3 e 10 min antes de ligação com aptâmero seleccionado EJ4 (B).. as células tratadas com proteinase K, durante 3 a 10 minutos de ligação prévia com aptâmero EJ4 objectivo figura 5:. a finalidade desta figura é a provar que os alvos dos aptâmeros seleccionados são proteínas presentes na superfície celular das células de cancro (H23).

conclusão

Em conclusão, nós selecionamos um painel de aptâmeros capazes de distinguir o carcinoma pulmonar de células epiteliais do pulmão normais. Estes aptâmeros mostram alta afinidade para a linha de células H23 com aparente K

d ‘

s na gama nanomolar, mas nenhuma afinidade detectável para as células epiteliais de pulmão normais. Os aptâmeros também mostrou ligação em condições fisiológicas, bem como após a fixação química, sugerindo que eles podem ser aplicados para

In vivo

experiências. tratamento proteinase indicaram que todos os aptâmeros neste painel de ligação a proteínas na superfície da célula alvo. Todos estes resultados sugerem amplas aplicações potenciais dos aptâmeros seleccionados devido à sua especificidade para tecidos cancerosos, mas não para as células saudáveis. Estes aptâmeros também podem ser usados ​​como sondas moleculares em amostras clínicas, tais como tumores recém-extraídos e amostras histológicas preservadas.

Materiais e Métodos

Design Library

Os iniciadores foram desenhados para satisfazer as seguintes características: uma estrutura mínima hairpin, temperatura de fusão semelhante (T

m) e emparelhamento de bases mínima. Os iniciadores e uma biblioteca de 80-mer foram concebidos utilizando o software 3.1 IDT Oligo Analyzer [32]. O iniciador directo foi marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) na extremidade 5 ‘, e o iniciador inverso foi marcado com biotina na extremidade 5’. A biblioteca consistia em uma região de 44 nt randomizado flanqueada na extremidade 5 ‘do iniciador marcado com FITC e flanqueada na extremidade 3’ da cadeia não marcada complementar do iniciador inverso.

Instrumentação e Reagentes

Bibliotecas e iniciadores foram sintetizados utilizando o sintetizador de ADN 3400 (Applied Biosystems). Todos os reagentes para a síntese de ADN foram adquiridos a Glen Research. As sequências de ADN foram purificados por HPLC de fase reversa (Varian Prostar utilizando uma coluna C18 de etilo e acetonitrilo /trietilamónio como fase móvel). A PCR foi realizada em um termociclador Biorad, e todos os reagentes foram adquiridos a partir de Takara. O acompanhamento do processo de seleção, os ensaios de ligação, e determinação das constantes de dissociação para os aptâmeros selecionados foram realizados por análise de citometria de fluxo utilizando um citómetro FACScan (BD Immunocytometry Systems).

Cultura Celular e Tampões

Um total de oito linhas celulares estabelecidas, foram usadas neste projecto, todos adquiridos a partir da cultura de tecidos na Colecção americana (ATCC). H23 (CRL-5800) Adenocarcinoma NSCLC foi escolhida como a linha celular positiva, enquanto que a linha celular negativa escolhido foi HBE135-E6 /E7 (CRL-2741), as células epiteliais brônquicas humanas normais. A linha celular H23 foi mantida em meio RPMI-1640 (ATCC) de cultura suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS inactivado pelo calor) e 1% de penicilina-estreptomicina. A linha de células de pulmão brônquica normal foi mantida num meio de queratina Serum-Free suplementado com 5 ng /ml de EGF humano recombinante, de 0,05 mg /mL de extracto de pituitária de bovino (Invitrogen), 0,005 mg /ml de insulina, e 500 ng /ml de hidrocortisona (Sigma -Aldrich). As células foram incubadas a 37 ° C sob 5% de CO

2 atmosfera. Outras linhas celulares utilizadas para o ensaio de selectividade foram o CAOV3 e linhas celulares de cancro do ovário TOV21G, adenocarcinoma de pulmão A549, carcinoma de células escamosas H520 pulmão, carcinoma do pulmão de células H460 grande, e DLD1 adenocarcinoma de cólon, e todos foram mantidos de acordo com as especificações ATCC. Durante a selecção, foram utilizados dois tampões: Tampão de Lavagem (WB) (glicose a 0,45% w /v e MgCl

2 5 mM em PBS) e tampão de ligação (BB) (1 mg /ml de ARNt e 1 mg /mL de BSA em WB). Todos os reagentes anteriores foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

In vitro

Seleção

Uma vez que ambas as linhas celulares utilizadas durante a seleção, adenocarcinoma e células epiteliais brônquicas humanas normais, são aderentes linhas de células, a selecção foi realizada em monocamadas de células. Cerca de 20 nmol da biblioteca sintetizada foi dissolvido em 700 ul de tampão de ligação. Antes do processo foi iniciado, o conjunto de ADN foi desnaturado por aquecimento a 95 ° C durante cinco minutos, seguido por arrefecimento rápido em gelo. Isto forçou as sequências de ADN a adotar as estruturas secundárias mais favoráveis. A biblioteca de DNA foi então incubada com cerca de 3 × 10

6 células alvo (H23) a 4 ° C durante 30 minutos. Subsequentemente, as células foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem para remover as sequências de não ligados. Em seguida, as sequências ligadas foram recuperadas por aquecimento a 95 ° C durante 10 minutos e depois centrifugando a 14000 rpm para remover os detritos celulares.

O sobrenadante contendo as sequências de ADN foi recolhida, e a piscina seleccionado foi amplificado por PCR utilizando FITC e iniciadores marcados com biotina. Em seguida, a geração de ADN de cadeia simples (ADNcs) foi conseguida por incubação com pérolas de sefarose revestidas com estreptavidina, a obtenção da cadeia biotinilada. Contador de selecção foi efectuada depois de observar algum enriquecimento com as células alvo. A fim de seleccionar aptâmeros com elevada especificidade e selectividade, o rigor das lavagens (número de lavagens, tempo de lavagem, e o volume de tampão de lavagem) foi aumentada em ciclos subsequentes. O enriquecimento das piscinas foi monitorada através de citometria de fluxo, sequenciado com 454 tecnologia, e analisadas para candidatos de aptâmeros.

Análise de citometria de fluxo

A citometria de fluxo foi utilizada para monitorar o enriquecimento de sequências de ssDNA-bound dentro das piscinas durante o processo de selecção, bem como para avaliar a afinidade de ligação e especificidade dos aptâmeros seleccionados. As células cultivadas foram lavadas com BM antes e após a incubação com a piscina de ADNcs com FITC ou sequências de ADN seleccionadas. A intensidade da fluorescência foi determinada em um FACScan citômetro (BD Immunocytometry).

454 Seqüenciamento e Análise

Depois de 18 rodadas de seleção, piscinas enriquecidas 14, 16 e 18 foram escolhidos para sequenciação. iniciadores específicos e MID-454 foram amplificadas por PCR e adicionou-se a cada sequência contida em cada conjunto, obtendo-se um produto de 125 pb. As reações foram confirmados por eletroforese em gel, limpa utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen), e submetidos ao núcleo ICBR na Universidade da Flórida para análise.

Cerca de sete mil seqüências foram recuperados e analisados. Em primeiro lugar, as sequências foram agrupadas com base na sua MID para determinar o conjunto enriquecido correspondente. Em segundo lugar, primers e MID foram removidos pelo programa Perl, a fim de deixar apenas a parte aleatória da sequência para a análise de homologia com o programa mafft 6.0.

Ensaios de ligação

Diferentes famílias de sequências recuperadas a partir de sequências múltiplas análises foram sintetizados, biotina marcado na extremidade 3 ‘, e testados quanto à ligação com a linha de células positiva e negativa. Além disso, a selectividade de ligação de cada candidato foi determinada por incubação de uma solução 250 nM de aptâmero com 4 × 10

5-alvo ou anti-células durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram lavadas duas vezes com WB e incubadas com esferas de estreptavidina PE durante 20 minutos a 4 ° C. Após lavagem, as células foram suspensas em 200 mL de WB. A fluorescência foi determinada com um citómetro FACScan por contagem de 3 × 10

4 eventos. Uma sequência de 80-mer aleatório foi utilizada como um controlo.

Ensaios de ligação com células fixadas

para determinar a capacidade dos aptâmeros de se ligar a células fixadas, procedimentos semelhantes aos descritos acima foram seguidos , com a excepção de o tratamento inicial das células. Resumidamente, as células aderentes foram H23 destacada do prato por incubação com uma solução de dissociação de células não enzimática, e em seguida fixadas com solução de formalina a 10% durante 15 min a 4 ° C, lavadas, e suspensas em tampão de ligação.

ensaios de selectividade e especificidade

Para determinar a especificidade destes aptâmeros, diferentes linhas celulares, incluindo CAOV3, DLD1, A549, H520, H460, e TOV21G, foram usadas em ensaios de ligação. A intensidade de fluorescência foi medida, a fim de confirmar a ligação. Todas as experiências seguiram a citometria de fluxo procedimento experimental descrito acima.

efeito da temperatura sobre a ligação aptâmero

A selecção foi realizada a 4 ° C.To determinar se a temperatura iria afectar a ligação entre aptâmero e as células alvo , ensaios de ligação foram realizados em duas temperaturas adicionais, 25 ° C e 37 ° C.

Determinação da constante de dissociação

a afinidade do aptâmero e o seu alvo foi avaliada por ensaio de saturação. Uma amostra contendo 5 × 10

5 H23 foi células lavadas e incubadas com diferentes concentrações de aptâmero até à saturação foi atingido. Todos os ensaios de ligação foram repetidas três vezes, e a intensidade de fluorescência média foi calculada por subtracção da intensidade de fluorescência de uma sequência mexidos. Os dados foram coletados, e a constante de dissociação (K

d) foi obtido pela montagem de um modelo único local de ligação de saturação usando SigmaPlot 11.2v (Jandel, San Rafael, CA).

Protease Digestão

tripsina e proteinase K tratamento.

H23 células foram lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas com 3 ml de tripsina a 0,05%, quer /EDTA 0,53 mM em solução salina equilibrada de Hank (HBSS), Cellgro, ou 0,1 mg /mL de proteinase K em PBS a 37 ° C durante 3 e 10 minutos. FBS foi adicionado para extinguir a actividade da proteinase. As células foram lavadas com BM e subsequentemente utilizada para os ensaios de ligação descritos acima.

Apoiando informação

Figura S1.

Caracterização de aptâmeros seleccionados. A citometria de fluxo de ensaio para a ligação dos aptâmeros ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 e EJ7 com H23 (linha de células-alvo) e HBE135 E6 /E7 (linha celular negativa). A curva verde representa a ligação de uma sequência aleatória (biblioteca) de fundo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s001

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Figura S2.

Aptamer obrigatório em condições fisiológicas. A citometria de fluxo de ensaio para a ligação de aptâmeros ADE1, ADE2, EJ4, EJ5 e EJ7 com H23 (linha de células alvo) a 25 ° C e 37 ° C. Neste conjunto de experiências, a ligação a 4 ° C foi utilizado como controlo positivo. A curva verde representa a ligação de uma sequência aleatória (biblioteca) de fundo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s002

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Figura S3.

experimento de controle para as células tratadas fixos. Ensaio de ligação de Sgc8 aptâmero com CEM (A) células (alvo) e células (B) Ramos (controle) antes (esquerda) e após fixação (direita), mostrando que nenhum sinal de fluorescência artificial foi produzido

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s003

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Figura S4.

ensaios de ligação, depois de fixação com formalina a 10%. Ensaio de Ligação de aptâmeros com H23 (alvo), as células pré-fixadas com formalina a 10%. colunas da esquerda mostram a ligação de aptâmero ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 EJ7 e com células não tratadas a 4 ° C. coluna da direita mostra a ligação dos mesmos aptâmeros EJ5 com células fixadas. A curva de luz verde representa a ligação de uma sequência aleatória (biblioteca) de fundo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s004

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Figura S5.

Ensaios de ligação após o tratamento com proteinase. Citometria de fluxo ensaio para aptâmeros ADE1 e ADE2, EJ5 e EJ7 após o tratamento com proteases; células não tratadas foram usadas como controlo positivo. (A) e (C) As células tratadas com tripsina para 3 e 10 min antes de ligação com aptâmeros ADE1 e ADE2, EJ5, e EJ7 respectivamente. (C) e células (D) tratados com proteinase K para 3 e 10 min antes de ligação com aptâmeros respectivamente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s005

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Figura S6.

aparente Kd é para aptâmeros selecionados. Saturação curvas para aptâmeros selecionados ADE1, ADE2, EJ2, EJ5 e EJ7 vinculativo. As células foram incubadas com diferentes concentrações do aptâmero em triplicado. A intensidade de fluorescência média de biblioteca não seleccionada foi subtraído de cada concentração de aptâmero correspondente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s006

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Reconhecimentos

Agradecemos Dr. Tahir Bayrac para o conselho útil que contribuíram para este trabalho, Dr. Kathryn Williams por sua revisão crítica do manuscrito e do núcleo de sequenciamento de DNA, ICBR, da Universidade da Flórida por sua ajuda durante 454 sequenciamento.