Sumário

A heterogeneidade das células de tumor e a sua modificação durante o curso da doença acentua a necessidade da caracterização tempo real, das células tumorais individuais para melhorar a avaliação de opções de tratamento. Novas gerações de terapias são frequentemente associadas com alterações genéticas específicas que impulsionam a necessidade de determinar a composição genética das células tumorais. Aqui, apresentamos um dispositivo microfluídico para toda célula única amplificação do genoma paralelo (pscWGA) para obter cópias suficientes de um único genoma da célula para investigar a presença de alvos de tratamento e a frequência de sua ocorrência entre as células tumorais. As células individuais foram primeiro capturado e carregado em oito unidades de amplificação paralelos. Em seguida, as células foram lisadas num chip e o seu ADN amplificada através da introdução sucessiva de reagentes dedicados ao misturar activamente com a ajuda do botão-válvulas integradas. O volume da câmara de reacção para scWGA 23,85 nl, e começando 6-7 pg de DNA contido em uma única célula, cerca de 8 ng de DNA foi obtida após WGA, representando mais de amplificação de 1.000 vezes. Os produtos amplificados a partir de células de cancro da mama individuais foram recolhidas a partir do dispositivo, quer investigar directamente a amplificação de genes específicos por qPCR ou para re-amplificação do ADN para se obter material suficiente para a sequenciação do genoma inteiro. Nosso dispositivo pscWGA fornece DNA suficiente a partir de células individuais para a sua caracterização genética, e, sem dúvida, permitir a preparação de amostras automatizado para a caracterização genômica única célula cancerosa

Citation:. Yang Y, Swennenhuis JF, Rho HS, Le Gac S, Terstappen LWMM (2014) Cancer Cell único paralelo Whole Genome Amplification Usando Button-Válvula Assistida mistura em nanoliter Chambers. PLoS ONE 9 (9): e107958. doi: 10.1371 /journal.pone.0107958

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 30 de abril, 2014; Aceito: 16 de agosto de 2014; Publicação: 18 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo é financiado pela NanoNextNL, um micro e nanotecnologia consórcio de o Governo dos Países Baixos e 130 parceiros. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este estudo é financiado pela NanoNextNL, um micro e nanotecnologia consórcio de empresas, universidades, institutos de conhecimento e centros médicos universitários. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Para a caracterização dos tumores, a expressão de proteínas ou genes específicos é normalmente fornecido como presente ou ausente, por exemplo, ER + ou ER-, HER2 + ou ela-, e EGFR mutação presente ou ausente. Esta determinação tem consequências importantes para as decisões terapêuticas imediatas e de submeter os pacientes a terapias específicas. Por exemplo, os pacientes cujas células do cancro tem uma amplificação do gene ERBB2 (Her2) são mais susceptíveis de beneficiar de Her2 específica de drogas, tais como trastuzumab. [1] Infelizmente, os tumores são muito mais complexos: os níveis de expressão podem variar amplamente dentro de um tumor e estão sujeitos a alterações durante o curso da doença. [2] – [4] Por exemplo, as mutações somáticas podem estar presentes apenas em um pequeno subconjunto do tumor [5] e as células tumorais podem tornar-se resistentes à terapia associada a alterações genéticas. Para demonstrar a presença e extensão dessa heterogeneidade na análise de células tumorais no nível da célula única é necessária para não perder esta informação importante [5] – [7].

Para investigar o genoma de uma única célula em um forma extensa e fiável, todo o genoma tem de ser amplificado, mantendo a representação inicial dos genes para realizar a análise a jusante, tais como toda a sequenciação do genoma [6] – [8], hibridação matriz genoma comparativa (aCGH) [9], [10] , ou PCR em tempo real quantitativo (RT-qPCR) [11], [12]. Neste momento todas estas técnicas requerem dezenas de nano-gramas para alguns micro-gramas de material de todo o genoma. amplificação múltipla deslocamento phi 29 polimerase é uma abordagem atraente para toda amplificação do genoma única célula sob condições isotérmicas. [13] a amplificação de ADN utilizando a enzima phi29 tem a vantagem de que podem produzir cadeias de ADN longo ( 10 kb) em grandes quantidades (até 1~2 ug) em um tempo relativamente curto (2 horas). [14] – [16] No entanto, a concentração extremamente baixa de ADN encontrado em um único genoma da célula na ainda grande volume da mistura WGA (20-50 ul) muitas vezes dá origem a desvios de amplificação e de amplificação não específicos. [17] – [19] Além disso, a triagem e a manipulação das células individuais para realizar a análise de célula única pode ser muito difícil e cada manipulação pode dar origem a perda de material. de células activadas por fluorescência (FACS) [8], [20], micromanipulação [10], [11], microdissecção de captura de laser (LCM) [9], [21] e DEP Array [22], [23] foram todos aplicado para o isolamento de células individuais, mas o processamento das células para se obter o ADN para análise a jusante (por exemplo, lise, o isolamento de ácido nucleico e amplificação) não tem ou não pode ser integrado. Por outro lado, microfluidos e estruturas microfabricados para permitir a manipulação da célula única ao ser facilmente acoplado a um único passo de análise de células. [24] – [26] Além disso, a microfluídica apresenta uma tecla de vantagem para WGA, já que reações ocorrem em um volumes muito menores do que quando se utiliza pipetagem e microtubos (pico-litros contra micro-litros) tradicional. Esta vantagem foi particularmente destacado para WGA de células bacterianas individuais usando volumes de reacção de 60 nl, resultando em um fundo mais baixo e maior cobertura com viés de amplificação menos [27].

Em dispositivos microfluídicos, a mistura ocorre naturalmente por difusão passiva . Especialmente a difusão das moléculas grandes, tais como a polimerase do phi29 leva mais tempo do que as moléculas mais pequenas e limita a velocidade de reacção e fiável nos dispositivos de microfluidos. misturador Rotary tem sido utilizado para acelerar este processo de mistura em microcanais. [28], [29] No entanto, o tamanho global destas estruturas limita o número de reactores em paralelo, que podem ser colocados em um dispositivo de mistura e a amostra tem de ser transportado para um outro reactor para o próximo passo da análise. Além disso, a área de superfície de um reactor é muito maior, o que pode aumentar os problemas de perda de amostras devido à fixação nas paredes do canal. Alternativamente, as estruturas de válvula pode ser implementado em um reactor contínuo para a mistura activa dos reagentes.

Aqui, nós apresentamos um dispositivo de microfluidos para WGA única célula paralelo. Para demonstração um dispositivo com câmaras de reacção paralelos 8 foi desenvolvido e testado para carregar oito células tumorais individuais que foram subsequentemente lisadas sob condições alcalinas, seguida pela etapa de neutralização e WGA. ADN a partir de células individuais foram amplificados utilizando a polimerase phi29 na câmara de PDMS confinado para análise off-chip a jusante. Botão de válvula-assistida mistura obtida WGA de células tumorais individuais com um volume de reagente de ~ 20 nl, em comparação com 20 ul em reacções WGA tradicionais.

E. coli

DNA foi usado pela primeira vez como um sistema modelo para se adaptar WGA, utilizando polimerase phi29, seguido de células individuais a partir de linhas celulares de cancro da mama para scWGA tumor. Qualidade do chip no DNA amplificado foi avaliada por qPCR segmentação 10 genes diferentes.

Métodos Experimentais

fabricação de chips e dispositivo de preparação

Os dispositivos microfluídicos foram fabricados por multicamadas macia técnica de litografia. [30], [31] Em primeiro lugar, os desenhos de máscara foram preparados por software CleWin (software WieWeb, Hengelo, NL) e impresso em um copo lime 5 “soda por um gerador de máscara LBPG Heidelberg DWL200 (Heidelberg Instruments Mikrotechnik GmbH). O mestre moldes foram fabricadas através de uma técnica fotolitográfica à base de fotorresistente. fotorresistente positiva (AZ 40 XT, Microchem Corp.) foi sobre uma bolacha de 4 “de silício revestido de rotação, e modelado usando fotolitografia. Para as operações de confiança dos microválvulas, a forma da secção transversal de microcanais nos canais principais fluídicos foi arredondada através do aquecimento do molde a 140 ° C durante um minuto após o desenvolvimento. A camada fluidificada superior foi produzido por vazamento de PDMS não curado (GE RTV 615, de elastómero de ligação cruzada: = 05:01) para o molde para se conseguir uma espessura de 7 ± 0.5 mm. A camada de controlo de fundo foi feito por PDMS não curado-spin coating (elastómero: reticulante = 20:01) para o molde mestre, a 2500 rpm durante 1 min. A espessura resultante da camada de controlo foi de 25 ± 2 uM. As camadas de fluidos e de controlo foram curadas durante 45 min e 30 min, respectivamente, a 80 ° C. A camada fluídica foi arrancada do molde e furos para entradas e saídas foram perfurados com um soco de calibre 25 (Syneo Co., Angleton, TX, EUA). Subsequentemente, a camada fluidificada foi alinhada sobre a camada de controlo usando as marcas de alinhamento em ambos as camadas sob um estereomicroscópio e as camadas foram alinhados ligados por cozedura-los a 80 ° C durante 60 min. As camadas foram então ligados descascados fora do molde, e furos para portas de controle foram perfurados. Finalmente, o dispositivo multi-camada de PDMS foi coberto por uma lamela de vidro pré-limpo (Fisher Scientific, Landsmeer, NL) e mantido em estufa a 80 ° C durante 12 h para aumentar a adesão. Antes de usar os dispositivos foram pré-revestidos por fluir uma solução de BSA (0,5 mg /ml) por meio dos canais durante 20 min. soluções BSA foram expulsos por via aérea.

Whole Genome Amplification

Kit Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) foi utilizado para WGA. A lise (KOH 400 mM, EDTA 10 mM, DTT 100 mM), neutralização (0,4 ml de HCl 1 M e 0,6 ml de 1 de Tris M-HCl, pH 7,5), e tampões empurrando (1X Tris · EDTA, 0,2% de Tween -20) foram introduzidas para as entradas dedicadas no dispositivo. A reação de amplificação foi realizada em um slide de cycler AmpliSpeed ​​(Advalytix AG, Munique, Alemanha) durante 2 h conjunto a 34 ° C. Após a amplificação, as amostras foram recolhidas a partir das unidades de amplificação individuais e transferidas para uma placa de PCR seguido por um passo de inactivação a 65 ° C durante 10 min. Para re-amplificação das amostras amplificadas on-chip, 17 uL da mistura de WGA foi adicionado a 1 jil de amostra no chip amplificado com base no protocolo do fabricante e a reacção foi levada a cabo a 30 ° C sobre uma coluna Bio-Rad CFX 384 do sistema em tempo real (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), durante 70 min. Isto foi seguido por um passo de inactivação a 65 ° C durante 10 min.

A quantificação e qualificação

Qubit 2,0 Fluorómetro e Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Breda, NL) foram usadas para quantificar ADNcd. Em tempo real SYBR Green qPCR foi usada para a quantificação de ADN especifica de alvo. Para

E. coli

WGA, primers contra a subunidade pequena (SSU), 369 pb, do gene de ARNr 16 S foram utilizados a uma concentração de 500 nM. Para a amplificação única célula cancerosa, iniciadores desenhados para a segmentação pequena subunidade da GAPDH (12p3), ERBB2 (17p12), CCND1 (11q13), MyC (8q24.21), PRMT2 (21q22.3), URB2 (1q42.13), FGFR1 (8p12), P53 (17p13.1), TRAM1 (8q13.3), e PAK1 (11q13-q14) foram usadas a uma concentração de 500 nM.

Cultura de células e Preparação

a linha celular de cancro da mama, SKBR-3 (ATCCHTB-30) e células MCF-7 (ATCCHTB-22), foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, NL), suplementado com 10% de soro Fetal bovino (Sigma Aldrich), 2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich), 1% de penicilina-estreptomicina (Sigma Aldrich) a 37 ° C em 5% de atmosfera de CO2. Antes da experimentação, as células foram coradas com laranja CellTracker CMTMR (Molecular Probes, Breda, Países Baixos), a 37 ° C durante 30 min e isolada por 0,05% de tripsina /EDTA (Gibco, Paisly, UK). Em seguida, as células foram lavadas uma vez com o meio de cultura e re-suspensos em solução de PBS.

A fluorescência in situ fluorescente (FISH)

SKBR-3 e células MCF-7 foram cultivadas e colhidas como descrito acima. Ambas as linhas celulares foram fixados em suspensão, com fixador de Carnoy (Metanol (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido): ácido acético (Merck, Hohenbrunn, Alemanha), 3:01) e cair sobre uma lâmina de microscópio simples. As lâminas foram deixadas a secar durante 30 min antes de ser incubada durante 15 min em 2 x SSC (20x SSC = 3 M de cloreto de sódio (Merck), 0,3 M de citrato de sódio (Merck), pH 7,0), 0,5% Igepal (Sigma Aldrich), após o que as lâminas foram desidratadas em etanol graduado (70%, 85%, 100%) durante um minuto cada um. 3,5 ul de Her2 /neu (ERBB2) (Kreatech, Amsterdam, NL) mistura de sondas foi aplicada às lâminas seguido por uma lamela Ø 12 mm (Thermo Scientific, Breda, Países Baixos). Depois da extremidade da lamela foi selada com cimento de borracha (Kreatech), sondas e alvo foram desnaturadas durante 10 min a 76 ° C e deixada a hibridizar durante 16 h a 37 ° C. Após a hibridação as lamelas foram removidas e uma lavagem rigorosa foi aplicado usando SSC 0,4x, 0,3% Igepal a 72 ° C durante 2 min. As lâminas foram lavadas durante 5 min em 2 x SSC 0,1% Igepal e desidratadas em etanol graduado (70%, 85%, 100%) durante 1 min cada. As lâminas foram finalmente montados em DAPI /Antifade (Kreatech).

Resultados e Discussão

Caracterização de dispositivos

A concepção e princípios de funcionamento do dispositivo WGA única célula paralela são ilustrados na Figura 1. O dispositivo inclui 8 unidades de amplificação com 6 entradas (abrir círculos azuis) e 10 lojas (círculos azuis sólidos) (Figura 1A), e consiste em duas camadas, uma camada fluídica (em azul) e uma camada de controle (em vermelho e rosa). Cada unidade de amplificação (ver Figura 1B) consiste em três câmaras circulares (1,2 nl) e uma câmara quadrada (20,25 nl). As válvulas de corte (em vermelho) são operados pneumaticamente e permitir tanto a manipulação de células e de carregamento das soluções. As válvulas de mistura (em rosa) localizadas no centro das três câmaras circulares são operados da mesma maneira. O canal principal possui três entradas para a respectiva introdução da suspensão de células, o tampão de lise e o tampão de neutralização, que estão ligados a canais de multiplexagem para empurrar o conteúdo para os 8 unidades de amplificação individuais no lado oposto. Os produtos WGA podem ser recolhidos em 8 reservatórios de saída individuais. O processo de funcionamento do dispositivo é ilustrada na Figura 1C, em que corantes de cor foram introduzidos no dispositivo para efeitos de visualização, e fotografadas sob um microscópio. O corante azul representa a mistura de WGA, o corante laranja a suspensão de células, o corante verde de tampão de lise, o corante vermelho do tampão de neutralização e o corante roxo o buffer de empurrar. Em primeiro lugar o corante azul foi usada para encher todas as câmaras rectangulares. Em seguida, o corante laranja foi carregado no canal principal e empurrado nos primeiros oito câmaras circulares. A mesma operação foi realizada para o verde e os corantes vermelhos. Finalmente, a solução presente nas três câmaras circulares e o corante azul na câmara quadrada foram misturados. Os reagentes foram misturados alcançada após actuação das válvulas de três botões, e este procedimento de operação é mostrado em um filme (Filme S1). Para scWGA, utilizou-se o botão de actuação de válvula única para o passo de reacção de WGA na Figura 1 (C-J). Por causa do baixo número de Reynolds encontrados nos canais de microfluidos, a mistura ocorre na difusão passiva. Para melhorar a eficiência de mistura de amplificação de ADN, válvulas de botão-forma foram integradas nas unidades de amplificação fechada do dispositivo, no centro das três câmaras circulares. Pressurizar a três válvulas de botão ajuda a misturar os reagentes sequencialmente a partir das câmaras circulares e quadrados. A eficiência de mistura das válvulas de botão foi avaliada pela primeira vez em misturando testes utilizando um corante de cor azul. Depois de a câmara de WGA quadrado foi preenchido com corante de cor azul, as três câmaras circulares foram cheias com água MiliQ e a válvula de fecho foi aberto entre as câmaras circulares e quadrados. Em seguida, as válvulas de botão foram abertas e fechadas sequencialmente a uma dada frequência. Observando-se a mistura das cores a sequência de abertura e fecho de válvulas botão foi optimizado. Para aceder a eficiência de mistura, o valor do brilho da primeira câmara círculo foi gravado durante a mistura na área indicada como uma linha círculo vermelho na Figura 2A. O tempo para a mistura completa por difusão apenas verificou-se ser aproximadamente 30 minutos, enquanto válvula de botão assistida mistura a 2 Hz foi muito mais rápido e apenas levou aproximadamente quatro minutos, como mostrado na Figura 2B. Conclusão de mistura foi regulada de tal modo que o valor de brilho medido usando o software Image J. na primeira câmara atingiu 110 (cor azul) a partir do 220 medido a partir do MilliQ transparente. As válvulas foram testadas a operarem a frequências entre 0,1 e 30 Hz, durante 5 min e os resultados de mistura são apresentados na Figura 2C. A eficiência de mistura diminuiu abaixo de 0,5 Hz e acima de 5 Hz e, pelo menos, 4 min de actuação de válvula era necessária para uma mistura óptima. À medida que o peso molecular influencia o coeficiente de difusão molecular e uma vez que o peso molecular do corante cor de alimento é consideravelmente menor do que a da polimerase phi29 (MW 68.000), também utilizado Rodamina dextrano conjugado (MW 70.000) e acridin laranja ADN marcado para avaliar a mistura no dispositivo por meio de microscopia de fluorescência. A mistura era de fato mais lento em comparação com o corante cor de alimentos e chegou a conclusão em cerca de 20 min a 1 Hz. (Figura S1).

(A) Representação esquemática do dispositivo. O dispositivo contém 8 unidades de amplificação com 6 entradas e 10 saídas. (B) de visualização ampliada de duas unidades de amplificação. A cor azul representam os canais de fluxo, a cor vermelha representam as camadas de controle para as válvulas de corte ea cor-de-rosa representam as camadas de controle das válvulas de botão. As unidades de amplificação composto por três câmaras circulares (1,2 nl) para suspensão de células, tampão de lise, e tampão de neutralização e uma câmara quadrada (20,25 nl) projetado para mistura WGA. válvulas de mistura estão localizados no centro das três câmaras circulares. processo de operação (C) do dispositivo. imagens de campo brilhante de uma unidade de amplificação com corantes de cor demonstram processo de operação. (A-j).

imagem de campo brilhante de uma unidade de amplificação onde a câmara quadrada é preenchido com corante de cor azul e três câmaras circulares com água, tomada em t = 0. Média (A) valor de brilho da primeira câmara (círculo vermelho) foi monitorizada como uma função do tempo após a abertura da válvula. (B) Misturar a eficiência das válvulas de botão. Medidos valores médios de brilho na primeira câmara circular com válvula de operação-indicada como preto e sem misturar a operação da válvula indicado como verde mistura. (C) Mistura teste de eficiência em várias freqüências de mistura operação da válvula. Os valores médios de brilho da primeira câmara medida durante 5 min.

Whole Genome Amplification on a Chip

A adaptação do protocolo WGA para amplificação de DNA isotérmica com a enzima phi29 em um dispositivo microfluídico foi realizada utilizando

E.coli

todo genoma como uma amostra do modelo. Em primeiro lugar, um

E. coli

solução de ADN (6 ng /mL) foi carregado para dentro do canal principal, e pelo fecho das válvulas no canal principal um volume exacto de 1,2 nl poderia ser medido e carregado no primeiro câmaras das unidades de amplificação do dispositivo, correspondente à quantidade de DNA (7,2 pg) encontrada numa única célula cancerosa. A solução tampão (1X Tris · EDTA, 0,2% de Tween 20) foi empurrado através da primeira câmara de cada unidade de amplificação para preencher as três câmaras circulares, tendo o cuidado das válvulas entre as câmaras circulares e quadradas foram devidamente fechada para isolar o mix WGA Chambers. O mix WGA foi posteriormente introduzida a partir da entrada directa a todas as câmaras praça diante da reação. válvulas laterais de câmaras quadrados separou as unidades de amplificação individuais. Depois de abrir as válvulas de isolamento entre a circular e câmara quadrada, a mistura de reacção de amplificação consistindo de polimerase phi29, hexâmeros aleatórios e dNTPs na câmara de praça e da

E.coli

DNA nas câmaras circulares começou a se difundir e foram activamente misturada, com a ajuda das válvulas de botão accionado a 1 Hz. Depois de 2 h, as amostras foram empurrados para uma ponta de pipeta de carregamento de gel colocado na saída do canal através da inserção de 5 ul de tampão que empurra a partir da entrada, e o conteúdo da ponta de pipeta foi em seguida transportado para uma placa de PCR. Após inactivação das amostras recolhidas a 65 ° C durante 10 min, qPCR segmentação do SSU de 16 rRNA gene S foi realizado para verificar a qualidade do produto amplificado. As curvas de tempo real usando qPCR dezasseis amostras de 1 ul de DNA amplificado no chip são apresentados na Figura 3 (linhas verdes), e correspondem a uma Cq média de 14,77 ± 0,55 (n = 16). Para comparação, catorze amostras de 6 ng /uL de solução de ADN na câmara nl 1,2 foram analisadas sem qualquer amplificação. Aqueles são representados pelas linhas pretas na figura 3, e resultou num valor Cq média de 23,43 ± 0,02 (n = 14). Maior quantidade de show de DNA começando mais tarde valor Cq na RT-qPCR e da diferença de valores Cq (ΔCq) pode quantificar a diferença do valor entre as amostras com base nas curvas padrão. ΔCq de amostras sem amplificação e amostras após a amplificação foi de aproximadamente 9. Por conseguinte, o qPCR segmentação SSU de 16 rRNA gene S resultou numa amplificação de ADN especifica de alvo de 512 vezes (2

ΔCq = 2

9, 100% eficiência). Experiências semelhantes realizadas sem se misturar com as válvulas de botão resultou num valor de Cq média de 20,18 ± 2,07 (n = 7), que demonstra claramente a vantagem da mistura activa durante o passo de amplificação (Figura S2)

.

Real- curvas de tempo de qPCR de segmentação 16 SSU rRNA gene S de amostras colhidas individuais a partir do dispositivo. On-chip amostras amplificadas são representados como curvas verdes (n = 16), enquanto as amostras de controlo sem amplificação são representados como curvas de preto (n = 14).

WGA de células tumorais

para demonstrar a possibilidade de caracterização genética de células tumorais individuais no dispositivo de microfluidos que usamos células a partir da linha celular de cancro da mama SKBR-3 e MCF-7. À medida que a quantidade de ADN (6-7 pg) contida dentro de uma única célula é demasiado baixo para uma análise directa da sua composição, todo o genoma foi amplificado como descrito anteriormente. No canal principal a morfologia e a imunofenotipagem de células pode ser examinado e após verificação de que as células se encaixa nos critérios de selecção as células individuais podem ser movidos dentro da primeira câmara das unidades de amplificação. Uma suspensão de células de SKBR-3 e MCF-7 de células coradas com laranja CellTracker foi injectada no interior do canal principal, e identificou-se as células a ser submetida para análise posterior por sua coloração por fluorescência e morfologia, tais como tamanho e forma. Após o carregamento das células individuais dentro da primeira câmara de uma unidade de amplificação, o ar foi empurrado para esvaziar o canal principal. Como as linhas de fluxo são multiplexados ligada ao canal principal cada linha pode ser aberta individualmente por combinação das válvulas e apenas as células de interesse pode operar ainda ser processado. [32] As fotografias de uma célula de SKBR-3 em uma câmara de amplificação estão apresentados nas Figuras 4A B. Após a célula foi transferida para a unidade de amplificação de um outro, o tampão de lise foi carregado, tal como mostrado na Figura 1C, medido pelo fecho das válvulas, e empurrado utilizando 1X Tris · EDTA, 0,2% de Tween-20 a misturá-lo com a célula . Para acomodar o volume da válvula entre as primeira e segunda câmaras círculo foi aberto e lise teve lugar nas duas primeiras câmaras durante 10 minutos por difusão. Do mesmo modo, o tampão de neutralização foi apresentada e neutralização tomou lugar nas três câmaras de círculo, também durante 10 min, com base na difusão. de actuação de válvula para a mistura não era necessário para a lise e neutralização como o tempo de difusão entre 2 ou 3 câmaras circulares foi suficientemente rápido para realizar a reacção. A real lise das células foi monitorizada por microscopia. A mistura WGA foi carregado para dentro das câmaras quadrados usando entradas e saídas separadas, e a seguir, as válvulas foram botão operado a 1 Hz durante 2 h de reacção para misturar o lisado celular e a mistura de WGA, e amplificar o ADN. Cerca de 8,27 ng de ADN foi obtida a partir da amplificação on-chip, e, como uma única célula contém 6-7 pg de ADN, amplificação mais do que 1000 vezes foi alcançado. Validação do ADN específico do modelo foi realizado por qPCR segmentação do locus do gene de GAPDH como alterações da GAPDH não têm sido relatados em ambas as linhas celulares. A linha celular de cancro da mama SKBR-3 e MCF-7 foram utilizados para demonstrar diferenças na amplificação do gene de ERBB2. A Figura 4C mostra as curvas de tempo real de qPCR de GAPDH de seis células individuais SKBR-3 (curvas de preto) e seis células MCF-7 individuais (curvas verdes), analisados ​​utilizando dois dispositivos diferentes. valores CQ para a amplificação GAPDH quantificados com base nas curvas padrão foram 23,22 ± 0,6. Isto implicava que 33% da quantidade total de ADN, medida pelo ensaio de Qubit, era produto dependente do molde. Nas Figuras 4D e imagens Fish e após a hibridização de sondas ERBB2 (vermelho) e centrômero do cromossomo 17 (verde) de uma célula SKBR-3 e MCF-7 são mostrados. Considerando 2 cópias do cromossoma 17 e 2 cópias do gene ERBB2 foram observados na célula MCF-7, quatro cópias do cromossoma 17 e 10 cópias do gene ERBB2 foram encontrados na célula SKBR-3. Em seguida, a mesma análise foi levada a cabo usando scWGA no nosso dispositivo de microfluidos usando ERBB2 qPCR específico, para SKBR-3 individual e células MCF-7. Como mostrado na Figura 4 M, o valor ERBB2 Cq média no ADN amplificado de células individuais SKBR-3 foi 24,95 ± 0,68 (n = 6) contra 29,80 ± 1,96 (n = 5) para células MCF7 individuais, enquanto o valor de GAPDH Cq para ambas as linhas celulares foi 23,22 ± 0,6 (n = 12) mostrados na Figura 4C. O valor mais baixo Cq medida para as células SKBR-3 correlaciona-se bem com as cópias múltiplas do gene de ERBB2 observado por FISH (Figura 4D), o que sugere que a WGA on-chip seguido por qPCR para genes específicos pode ser usado para determinar se ou não um gene é amplificado.

imagem de microscópio de campo brilhante de uma única célula SKBR-3 isolado numa câmara de microfluidos (a), fundida com uma imagem de fluorescência. (B) Imagem de fluorescência de uma única célula SKBR-3 coradas com laranja CellTracker na câmara de microfluidos. (C e F) qPCR segmentação GAPDH e genes ERBB2 de On-chip de DNA para a quantificação e caracterização amplificado utilizando um ul de amostras on-chip amplificados (5 ul) de indivíduo SKBR-3 (n = 6) e células MCF-7 (N = 6) como modelos. (C) em tempo real qPCR curvas de amplificação do gene GAPDH. O ADN amplificado de único SKBR-3 é representada por meio de curvas pretas, enquanto que o de células MCF-7 individuais são representados como curvas verdes. linha limite é em cinza. (D e E) Imagens de hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas ERBB2 (vermelho) e centrómero do cromossoma 17 sondas (verde) para indivíduo SKBR-3 (D) e MCF-7 (E). Os núcleos foram corados com Hoechst (azul) valores (F) Cq de gene ERBB2 em um gráfico de caixa. Cq valores de ErbB2 foram representada como caixa preta no SKBR-3 (n = 6) e a caixa vermelha em células MCF-7 (n = 5, * Cq de uma amostra em falta é devido a um erro de PCR). . (25% -75%: □, Valor médio: -, o valor médio: □, Min /Max: °, Faixa de Min /Max: I)

Para a análise genética, como a sequenciação ou a análise de matriz de alto rendimento, maior quantidade de ADN (microgramas) são necessários. Para avaliar a adequação dos produtos amplificados-re para representação do gene, foi amplificado fora do chip 1 uL de 5 ul no chip de ADN amplificado a partir de uma única célula de SKBR-3 em 17 ul de WGA mistura, seguido por qPCR segmentação 10 loci diferentes no genoma inteiro. Para isso, escolher 10 genes que são de interesse para o campo de pesquisa do câncer e localizados em cromossomos diferentes. Os produtos amplificados destes genes pode fornecer informações sobre a representação do DNA a partir dos produtos amplificados. 10 ng de 8 amostras amplificadas-re recolhidos a partir de dois dispositivos (4 amostras por dispositivo) foram comparados com 10 ng de ADN genómico (ADNg) de SKBR-3. A Figura 5A mostra o coeficiente de variação (CV%) dos valores Cq em 4 amostras em cada um dos dispositivos apresentados como barras verdes e pretas para os loci 10 consideradas. A média do CV para os 10 genes foram de 3,8% para o primeiro dispositivo (verde) e 2.9% para o segundo dispositivo (preto), e a variação inferior a 7% foi observado nos genes any10 entre as amostras no mesmo dispositivo. Os valores ΔCq para o indivíduo 8 amostras em comparação com gDNA foram determinados para os 10 genes (ver Figura 5B). As linhas individuais na Figura 5B corresponder a uma reação no chip. ΔCq variou entre genes, mas todos os 10 genes foram amplificados em 10 ng de amostras scWGA (n = 8). Os números de cópias dos genes alvo foram estimados com base em qPCR curvas padrão de gDNA. As barras cinzentas na Figura 5C representam os números de cópias de scWGA indivíduo em 10 ng de ADN enquanto que as barras pretas representam os números de cópias de ADN genómico de 10 ng. Os números de cópias média para os 10 genes em 10 ng de ADN são: 128 cópias de ErbB2, 47 cópias de CCND1, 140 cópias de MYC, 201 cópias de PRMT2, 213 cópias de URB2, 1182 cópias de FGFR1, 42 cópias de P53, 348 cópias de TRAM1, 332 cópias de PAK1, e 513 cópias de GAPDH, o que corresponde a percentagens de representação de 4,8%, 1,4%, 6,6%, 7,5%, 5,4%, 34,1%, 1,5%, 9,1%, 10,7%, e 15,5%, respectivamente. valores Cq atrasadas e amplificação de fundo resultou em menos número de cópias de genes em comparação com gDNA em 10 ng. Desde o mesmo resultado foi observado quando pequenas cópias de gDNA foram amplificados, assumimos esse viés é um artefato causado pelo kit comercial. Em adição, a quantificação de ADN baseada em fluorescência, re-amplificação, procedimentos qPCR, quantificação e com base nas curvas padrão de ADN genómico pode variar os resultados. Outros não-isotérmico e métodos de amplificação de DNA isotérmicos pode ser implementado no nosso dispositivo de microfluidos, embora os volumes de reacção e os passos de reacção terá de ser adaptado e para controle de temperatura não isotérmicos terá de ser introduzido.

Valores

Cq 10 ng de moldes de ADN são determinadas por qPCR SYBR verde de segmentação 10 genes. (A) O coeficiente de variação (%) dos valores Cq de 4 amostras amplificadas no mesmo chip. Amostras de 2 dispositivos diferentes são indicados como barras verdes e pretas. (B) A linha individual representa uma amostra amplificada num chip de uma única célula. eixo Y representa os valores Cq delta entre 10 ng de ADN amplificado num chip de célula única e de ADN genómico. (C) os números da cópia estimado de amostras individuais são representadas como barras cinza. (N = 8) As barras pretas representam números de cópias estimadas de DNA genômico em 10 ng.

Conclusões

Aqui, nós apresentamos um dispositivo microfluídico para o processamento paralelo de células individuais para obter quantidades suficientes de ADN por amplificação do genoma inteiro para análise a jusante. membranas em forma de botão foram implementadas como válvulas de mistura, e actuação sequencial dessas válvulas aumentou a eficiência de mistura. WGA num volume de reacção 23,85 nl foi optimizada através da utilização de

E. coli

gDNA.