Abstract
células-tronco pluripotentes induzidas Humano (iPSCs) são reprogramadas por expressão transitória de fatores de transcrição em células somáticas. Aproximadamente 1% de células somáticas podem ser reprogramado em iPSCs, enquanto as restantes células somáticas são diferencialmente reprogramado. Aqui, nós estabelecemos induzida câncer de células-tronco pluripotentes-like (iCSCs) como clones de células pluripotentes auto-renovação. linhas ICSC estáveis foram estabelecidas a partir de linhas instáveis induzida de células-tronco epitelial (IESC) através de re-plaqueamento seguido por formação de corpos embrióides e transplante de série. iCSCs compartilhada a expressão de genes marcadores pluripotentes com iPSCs, exceto para
Rex1
e
LIN28
, enquanto exibia a expressão de genes marcadores somáticos
emp1
e
PPAR
. iESCs e iCSCs poderia gerar teratomas com alta eficiência por implantação em ratinhos imunodeficientes. O segundo iCSCs isoladas a partir de células dissociadas de teratoma de os primeiros iCSCs foram estavelmente mantido, mostrando um perfil de expressão do gene semelhante aos primeiros iCSCs. Nos primeiro e segundo iCSCs, transgene derivado
Oct4
,
Sox2
,
KLF4
, e
c-Myc
foram expressos. Análises comparativas expressão do gene mundial demonstrado que os primeiros iCSCs foram semelhantes aos iESCs, e claramente diferente dos iPSCs humanos e de células somáticas. Em iCSCs, cinética do factor de pluripotência núcleo e o factor relacionado com o gene myc foram tipo pluripotentes, ao passo que o complexo factor Polycomb foi tipo somática. Estes resultados indicam que tumorigenicidade pluripotentes podem ser atribuídas células somáticas através da sobre-regulação da pluripotência núcleo e fatores relacionados-Myc, antes do estabelecimento da rede molecular iPSC pela reprogramação completa através de infra-regulação do fator complexo Polycomb.
Citation: Nagata S, Hirano K, Kanemori M, Sun LT, Tada T (2012) auto-renovação e pluripotência adquirido através Somatic reprogramação para Humano do Câncer Stem Cells. PLoS ONE 7 (11): e48699. doi: 10.1371 /journal.pone.0048699
editor: Martin Pera, da Universidade de Melbourne, Austrália |
Recebido: 18 de julho de 2012; Aceito: 28 de setembro de 2012; Publicação: 08 de novembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Nagata et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado pelo JSPS Kakenhi, número de concessão 23390067. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.
Introdução
células-tronco cancerosas (CSCs), que são sub-populações de células tumorais, função na manutenção de cancros através da iniciação e propagação de perpetuar o crescimento do tumor [1]. CSCs são pensados para ser os principais alvos de terapias contra o câncer, mas os detalhes de suas assinaturas genéticas e epigenéticas são claras. Como um padrão de ouro para definir as propriedades CSC, um ensaio de transplante em série com base na capacidade de auto-renovação e gerar tumores tem sido amplamente utilizado [2]. Um evento crucial na iniciação cancros é a activação do mecanismo de auto-renovação, a qual é normalmente limitada a células estaminais. Portanto, é provável que os CSCs partilham várias assinaturas de expressão de genes detectados em células estaminais pluripotentes. Na verdade, genes marcadores pluripotentes,
Oct4
e
Nanog
, são expressos em alguns tipos de câncer [3], [4], e oncogene
Myc
está envolvida na geração de muitos cânceres [5].
a expressão forçada de uma combinação de fatores de transcrição, Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc (OSKM), pode promover a reprogramação direta de células somáticas humanas e de camundongos em células-tronco pluripotentes induzidas células (iPSCs) [6], [7]. Em reprogramação direta,
Oct4
e
Sox2
, que são fatores de pluripotência núcleo, funcionam como reguladores dos processos de desenvolvimento e associadas a transcrição [8],
Myc
como alvo genes predominantemente envolvida no metabolismo celular, o ciclo celular, e as vias de síntese de proteínas [9]. Além disso,
Myc
funções para aumentar a eficiência através da regulação da via p53 [10]. Esta evidência indica que as vias comuns podem ser usados tanto na aquisição de pluripotência e tumorigênese. Nos seres humanos, as células-CSC como foram transformados a partir de fibroblastos primários da pele pela expressão estável de hTERT, H-RasV12, e SV40 LT e ST antigénios [11]. Em ratinhos, os CSCs foram gerados a partir de células estaminais pluripotentes de rato induzida (IPSCs) por cultura com um meio condicionado de linhas celulares de cancro, que era um mímico do microambiente carcinoma [12]. Assim, a mudança global da assinatura de transcrição através de reprogramação direta ou condições de cultura alternativos poderia promover a transformação para CSCs. Neste contexto, é possível que a expressão forçada de OSKM em células somáticas induz reprogramação direta em CSCs. Para abordar os mecanismos moleculares envolvidos em células estaminais embrionárias (ES) e CSCs, três conjuntos de genes funcionalmente diferentes, chamado de núcleo (fatores de pluripotência Core), RPC (fatores complexos Polycomb repressivas), e Myc (fatores Myc relacionadas com a) módulos, proposto recentemente, foram utilizados para análises comparativas de atividade genética global entre diferentes tipos de células [9].
Aqui, a fim de abordar questões de se o câncer de células estaminais-como humanos induzida (iCSCs) pode ser gerado por reprogramação somática através da indução convencional OSKM viral, e como iCSCs humana, mas não iPSCs, são gerados, primeiro, isolado iCSCs de populações de células, que adquiriu a capacidade de se auto-renovar expressão de OSKM exógena após forçado em fibroblastos somáticas humanas TIG1. iCSCs têm a propriedade de pluripotência como verificado por formação de teratomas através de transplante de série para ratos imunodeficientes. Notavelmente, o assinatura de expressão de genes demonstraram que persistem iCSCs certa memória de células somáticas, mesmo após a sobre-regulação de genes marcadores pluripotentes através de reprogramação. Nossos resultados revelaram que a sobre-regulação de conjuntos de genes para os módulos de núcleo e Myc é suficiente para conferir as propriedades de auto-renovação e pluripotência e sequencial infra-regulação de conjuntos de genes para o módulo RPC é necessário para instalar a assinatura iPSC adequada sobre células somáticas. Estes resultados demonstram que iCSCs e iPSCs compartilhar um caminho reprogramação de núcleos somáticos em pluripotentes e auto-renovável núcleos, e depois divergem para iCSCs ou iPSCs.
Materiais e Métodos
Ética declaração
Experimentos com camundongos foram realizados de acordo com a diretriz institucional da Universidade de Kyoto, no Japão. Nossas experiências com animais (W-3-6) são analisados e autorizados pelo comitê da Universidade de Kyoto, Japão pesquisas com animais.
cultura celular
fibroblastos de pulmão fetal humano (TIG1) fornecidos pelo JCRB Cell Bank foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, EUA) contendo 10% de FBS, e foram infectadas com Oct4, Sox2, KLF4 e retrovírus c-Myc. No dia 4 após a infecção, as células foram re-semeadas numa placa de cultura de 10 cm de células alimentadoras. No dia 5 após a infecção, o meio de cultura foi mudado para meio iPSC (DMEM /Nutrient Mixture F-12 de Ham (DMEM /F12) (Sigma-Aldrich) suplementado com 20% de substituto de soro nocaute (Invitrogen, EUA), 10 ng /mL bFGF (Peprotech, EUA), L-glutamina e aminoácidos não essenciais e 2-mercaptoetanol). Colónias, que podem auto-renovar e expandir, foram apanhados e reseeded em células alimentadoras por volta do dia 30. Para isolar iPSCs humanos e células estaminais epiteliais induzidos (iESCs), cada colônia foi pego e reseeded em pratos Matrigel-revestidas com embrionárias de rato fibroblastos (MEF) climatizados, médio da iPSC.
Para a formação embryoid corpo (EB), pequenos agregados IESC foram formados pela cultura gota em suspensão durante a noite em meio iPSC MEF-condicionado. Os agregados foram cultivados em pratos de cultura bacteriana durante 5-7 dias, e em seguida cultivadas em placa revestida com gelatina com DMEM contendo 10% de FBS.
Para a cultura de células derivadas de tumor, os tumores foram cortados em pequenos pedaços, com dissociado colagenase, e plaqueadas em placas revestidas com gelatina com FBS a 10% contendo DMEM. linhas ICSC estabelecidos foram mantidos no prato revestido com gelatina com DMEM /F12 (Wako, Japão) suplementado com FBS a 15%, 1.000 U /ml de LIF (Chemicon, EUA), L-glutamina, penicilina-estreptomicina, bicarbonato de sódio, o piruvato de sódio, e 2-mercaptoetanol através da passagem usando 0,25% de tripsina /EDTA.
RT-PCR
Para as análises de RT-PCR, o ARN total de células de cultura foi extraído com o reagente TRIzol (Invitrogen). O ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total com Superscript III (Invitrogen), utilizando hexâmeros aleatórios seguindo as instruções do fabricante. Todas as experiências de PCR foram realizadas com a temperatura de recozimento a 57 ° C. As sequências dos iniciadores utilizados neste estudo estão resumidos na Tabela S1.
A imunocitoquímica
As células em cultura foram fixadas com PFA a 4% (paraformaldeído) /PBS (solução salina tamponada com fosfato) durante 10 minutos à temperatura ambiente , lavada com PBST (0,1% de Triton X-100 em PBS), em seguida, pré-tratados com uma solução de (3% de BSA e 2% de leite desnatado (DIFCO, EUA) em PBST) a 4 ° C durante a noite bloqueando. As células foram incubadas com anticorpos primários; anti-OCT4 (01:50; Santa Cruz Biotechnology, EUA), anti-SOX2 (1:500; Abcam, Reino Unido) e anti-NANOG (1:200; ReproCELL, Japão), anti-CDH1 (1:200; TaKaRa , Japão), anti-SSEA4 (1:500; Hybridoma Bank, EUA), e anti-TRA-1-60 (1:500; Millipore, EUA) anticorpos a 4 ° C durante a noite. Eles foram, em seguida, incubadas com anticorpos secundários; IgG anti-coelho ou anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa 488 (1:500; Molecular Probes, EUA) em tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram contrastadas com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) e montado com um kit de luz antifade SlowFade (Invitrogen).
formação de tumores
Uma suspensão de células de 5,0 x 10
5 sub iESCs ou iCSCs em 200 ul de DMEM foi injectada subcutaneamente na região inguinal ou transplantadas para as cápsulas dos rins de ratinhos SCID imunodeficientes (CLEA, Japão). Os tumores foram dissecados cirurgicamente 5-7 semanas após a implantação, fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS e embebido em parafina. Secções 5 mm de espessura foram corados com hematoxilina e eosina.
Microarray e processamento de dados
Para as análises de microarray, 1 pg RNA total foi rotulado de acordo com protocolos padrão Affymetrix e hibridado com o genoma humano Affymetrix U133 mais 2,0 array (amostras de origem humana). Os dados brutos foram normalizados pelo método 5.0 MAS utilizando o pacote bioconductor sobre o programa R (https://www.r-project.org/). mapas de calor do perfil de expressão gênica para todos os genes em cada linha celular foram visualizados por programa MeV (https://www.tm4.org/mev/). agrupamentos hierárquicos foram calculados pelo coeficiente de correlação de Pearson (r) e visualizado pelo pacote pvclust sobre o programa R. Para as análises de gráfico de dispersão, os dados brutos foram normalizados pela Robust Multichip Média (RMA). gráficos de dispersão foram visualizados utilizando o pacote bioconductor no programa de P.
Resultados e Discussão
Isolamento de iESCs e iCSCs
iPSCs humanos foram apanhados como colônias cerca de 30 dias após retroviral transdução de Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para os fibroblastos somáticas TIG1, uma linha celular humana isolada a partir de pulmão fetal (Fig. 1A). A eficiência de geração iPSC era inferior a 1%, e as outras populações de células foram diferencialmente reprogramado. Algumas das células somáticas diferencialmente reprogramadas mostrou a propriedade de auto-renovação de colónias formadas que consiste em células (iESCs) com a morfologia das células epiteliais em meio condicionado iPSC MEF (Fig. 1A). iESCs foram mantidos com a morfologia das células epiteliais para cerca de 10 passagens, uma vez que eram propensos a diferenciação (Fig. S1A). Portanto, para analisar o potencial de diferenciação das iESCs, EB formação foi induzida por cultura em suspensão (Fig. 1B). formado com sucesso IESC EBs mostrando pluripotência tal como analisado por RT-PCR (Fig. 2A) foram ligados no fundo para pratos de cultura para isolar células estaminais auto-renovação. Consequentemente, o primeiro (1º) linhas ICSC isoladas escolhendo aglomerados de células da EBS expandidas em três experimentos independentes foram estavelmente mantido por mais de 20 passagens, ou re-banhado a partir de células congeladas-armazenados (Fig. 1B). Para verificar a identidade do 1º iCSCs, o segundo (2 °) foram isolados a partir iCSCs tumores gerados por transplante em série com injecção do 1º iCSCs nas regiões inguinais de ratinhos SCID imunodeficientes em duas experiências independentes (Fig. 1C). Os 2nd iCSCs assemelhando-se o 1º iCSCs foram estavelmente mantido com as características da morfologia das células epiteliais e crescimento celular robusto para mais do que 20 passagens (Fig. 1C). Em seguida, para explorar a pluripotência das iESCs, 1º iCSCs, e 2º CSCs, as células foram transplantadas em cápsulas renais ou regiões inguinais de ratos SCID. Formação de teratomas contendo ecotoderm, mesoderme, e derivados da endoderme foi detectado com hematoxilina e eosina com elevada frequência em todos os tipos de células (Fig. 2B), indicando que os três tipos de células eram células estaminais aquisição pluripotência, apesar de ter a morfologia das células epiteliais.
(A) Geração de iPSCs e iESCs através de reprogramação direta de fibroblastos fetais primários (TIG1). (B) Geração dos primeiros (1º) iCSCs escolhendo um aglomerado de células (círculo amarelo) através de corpos embrióides iESCs derivadas (EB IESC) formação. (C) geração da 2ª (segunda) iCSCs escolhendo um aglomerado de células (círculo amarelo) através de transplante de série do 1º iCSCs.
(A) Expressão da exógena, marcador pluripotentes, e marcador de linhagem genes em corpos embrióides (EBS) formados com iESCs iPSCs e por RT-PCR análises. seções (B) de parafina de teratomas, que foram gerados por iESCs, 1º iCSCs e implantação 2ª iCSCs, foram coradas com hematoxilina e eosina. NE, neuroepitélio (ectoderma); CA, cartilagem (ectoderme); MU, músculo (mesoderme); RE, epitélio respiratório (endoderme). Perfil
expressão gênica de iESCs e iCSCs
Para examinar a expressão de genes em iESCs e iCSCs, perfis de expressão gênica global detectados por análises de microarray de expressão gênica foram comparados. Entre TIG1, iESCs, 1º iCSCs e iPSCs, iESCs e iCSCs se assemelham entre si. Curiosamente, iESCs e iCSCs eram mais semelhantes às células somáticas, e TIG1 em vez de células pluripotentes humanas (iPSCs e células ES), mesmo com a alta expressão consistente do exógena
Oct4
,
Sox2
,
KLF4
, e
C-Myc
(Fig. S2 e a Fig. 3A e 3B). Coerente com isso, os dados no mapa de calor análises demonstraram que iESCs mantido um estado intermediário entre fibroblastos somáticas TIG1 e iPSCs pluripotentes (Fig. 3A). Em mais detalhe, gráfico de dispersão análises mostraram que, em iESCs, expressão de genes marcadores somáticos
MAB21L1
e
NR2F2
foi elevada para iPSCs, enquanto a expressão de genes marcadores pluripotentes T
DGF1, NANOG, ZIC2,
e
TPD52
semelhante ao iPSCs (Fig. 3A). Semelhante a iESCs, 1 iCSCs foram caracterizadas por expressão de alguns genes marcadores somáticos. análises de RT-PCR verificou-se que a expressão de genes marcadores pluripotentes endógenos,
OCT4
,
SOX2
,
NANOG
,
Rex1
,
LIN28 ,
era obviamente baixo, enquanto genes marcadores somáticos,
emp1
,
PPAR
,
FOXF2
, e
NR2F2
foram altamente expresso na 1ª e 2ª iCSCs (Fig. 3A e 3B), indicando que a reprogramação epigenética foi meio caminho para apagar a memória somática e estabelecer uma rede de transcrição pluripotentes. Baixa expressão de NANOG foi detectada por imunocitoquímica na 1ª e 2ª iCSCs, enquanto a alta expressão de OCT4 endógeno /exógeno Oct4 e endógena SOX2 /Sox2 exógena foi detectada (Fig. 3C). A análise imunocitoquímica demonstrou que os marcadores pluripotentes CDH1 SSEA4 e foram fracamente expressas em iESCs e iCSCs, embora altamente em iPSCs. Além disso, a expressão de TRA-1-60 foi detectada em iPSCs, mas não iESCs e iCSCs (Fig. S3). Colectivamente, iESCs e iCSCs manteve um estado celular entre TIG1 e iPSCs. Microarrays análise de expressão gênica
(A) entre TIG1, iESCs, iCSCs e iPSCs. mapa de calor (painel superior) mostra genes diferencialmente expressos de genes somáticos e pluripotentes. gráficos de dispersão (painel inferior) mostra a comparação de perfis de expressão gênica global. Amarelo; genes no módulo Core, azul; genes no módulo RPC, e vermelho; gene no módulo de Myc. (B) Análise da expressão de genes pluripotentes marcador, genes marcadores células somáticas e genes exógenos em TIG1, iPSCs, iESCs, 1º iCSCs, e 2º iCSCs por RT-PCR analisa. (C) A expressão de proteínas marcadoras pluripotentes (verde) em iESCs, 1º iCSCs, e 2º iCSCs por imunocitoquímica. núcleos celulares são contrastadas azul com DAPI (azul). Exo, exógena; Endo, endógena.
Acquisision de pluripotência antes do estabelecimento de iPSC identidade
No processo de reprogramação de células somáticas em iPSCs, as células alterar progressivamente os seus padrões de expressão e morfologia. Assim, para comparar os perfis de diferentes tipos de células, um sistema integrado para análise perfis de expressão, em termos da cinética da expressão do gene módulos de reprogramação, é necessária. Três módulos ES celulares, Core, RPC, e Myc (CPM), que são funcionalmente desmontável, foram definidos [9]. O módulo Core inclui fatores conhecidos no núcleo circuito regulador, tais como
NANOG, OCT4, SOX2, TCF3
, e
Rex1
. O módulo RPC inclui gene geralmente reprimida em células ES, incluindo
HOX
genes do cluster. O módulo Myc é composto de genes que são alvos comuns de sete fatores, MYC, Max, nmyc, DMAP1, E2F1, E2F4 e ZFX. Além disso, o módulo de células ES-como foi definido para distinguir entre as células embrionárias, células estaminais de tecido adulto, e cancros humanos [13]. Aqui, demonstramos dados com módulos CPM, uma vez que a análise com os dados do módulo ES celular como foi comparável aos dados do módulo de núcleo de módulos CPM, que incluíram genes marcadores pluripotentes.
Para reprogramar TIG1 em iESCs, a sobre-regulação dos módulos do núcleo e Myc foi necessária (Fig. 4 e Fig. S4). iESCs e iCSCs foram caracterizados pela alta atividade da RPC e módulos Myc, enquanto o módulo de núcleo foi alta em iESCs e pobre em iCSCs. Era crucial para impor uma barreira para apagar a memória somática que o módulo RPC manteve elevada actividade em todos TIG1, iESCs e iCSCs como mostrado pela
FOXF2
e
NR2F2
(Fig. 3A). Para ser totalmente reprogramado em iPSCs de TIG1, a indução da infra-regulação do módulo RPC era necessário (Fig. 4 e Fig. S4), indicando que a conclusão da criação da rede iPSC-transcricional está associada com a regulação negativa da o módulo RPC.
Propriedades de auto-renovação e pluripotência estão relacionados com transitória ou contínuo aumento da regulação dos módulos do núcleo e Myc, mas não módulo RPC. C, módulo de núcleo; P, módulo RPC; M, Myc módulo.
linhas celulares estáveis, TIG1, ICSC, e iPSC, foram caracterizados pela atividade recíproca dos módulos do núcleo e da RPC, enquanto iESCs instáveis mostrou simultâneo aumento da regulação dos dois módulos , sugerindo que os genes categorizados nos dois módulos funcionava competitivamente na reprogramação. Notavelmente, a aquisição de auto-renovação e pluripotência foi associada com a regulação positiva do Core e Myc, mas não RPC, módulos (Fig. 4). Estes dados indicam que a propriedade de auto-renovação e pluripotência poderia ser atribuídas núcleos somáticas antes da reprogramação completa em iPSCs. A constatação de que uma certa população de células de iESCs foi reprogramado em iPSCs espontaneamente concordavam com esse conceito (Fig. S1B). Os critérios de auto-renovação e pluripotência são amplamente utilizados para a definição de iPSCs humanos. No entanto, a propriedade de auto-renovação e pluripotência pode ser conferido em uma variedade de tipos de células através de reprogramação mais do que esperávamos, e que são necessárias, mas não suficiente, para a definição da identidade da IPSC.
Para reprogramar células somáticas de iCSCs, a sobre-regulação do módulo de Myc é um acontecimento chave. As regiões do promotor ligados por MYC estão ligados com histona H3 lysin4 trimethylation (H3K3me3), que está correlacionado positivamente com a formação de cromatina aberta, e a activação do gene como uma assinatura epigenética [9]. Além disso, MYC interage com histona acetiltransferase, que são associados com os complexos de activação da transcrição [14]. O módulo de Myc facilita o metabolismo das células através da activação de genes gerais. Genes no módulo Core são também up-regulada através de reprogramação somática para iCSCs.
OCT4
,
SOX2
, e
NANOG
, que são fundamentais jogadores módulo Core, reprimir proteínas homeodomain developmentally importantes através de co-ocupação dos seus genes-alvo, ao mesmo tempo promover a auto renovação e pluripotência pela regulação positiva de genes que codificam componentes de vias de sinalização fundamentais [15]. Levando isso em consideração, os módulos de núcleo e Myc desempenhar um papel em conferir as características de auto-renovação e pluripotência em núcleos somáticos, enquanto continuamente alta atividade do módulo RPC em TIG1, iESCs e iCSCs impede a reposição da memória somática de algumas proteínas homeodomain developmentally importantes (Fig. 4). Os complexos repressivas Polycomb, especialmente Polycomb complexo repressivo 2 contendo EZH2, Eid e Suz12, são repressores cruciais de genes em associação com H3K27me3 [16]. A fim de repor a memória somática de genes com um homeodomain em iESCs e iCSCs e sobre-escrever a assinatura epigenética de células-like ES nos núcleos reprogramadas de iESCs, a atividade do módulo RPC deve ser reduzida continuamente ou transitoriamente. actividade relativamente reduzida do módulo de PRC pode ser um evento chave para reprogramação de células somáticas para iPSCs. Especula-se que a falta de H3K27me3 desempenha um papel importante na promoção da reprogramação de pré-iPSCs para iPSCs na fase tardia de reprogramação [17]. O destino de células somáticas, quer sejam reprogramados para iCSCs ou iPSCs, poderia ser determinada pela atividade do módulo RPC, depois de adquirir a capacidade de auto-renovação e pluripotência (Fig. 4).
Informações de Apoio
Figura S1.
diferenciação espontânea de iESCs e conversão em iPSCs. (A) A diferenciação de iESCs após cultura a longo prazo. (B) convencional iPSCs (painel direito) foram gerados a partir de uma pequena colônia (círculo amarelo no painel da esquerda) aparecem na cultura IESC em alta densidade celular
doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s001
(TIF )
Figura S2.
análise de expressão gênica global de iESCs e iCSCs. Análise comparativa do perfil de expressão gênica global em iPSC,-tronco embrionárias humanas (ES) células, IESC, 1º ICSC, e TIG1 linhas de ensaio de microarray de expressão gênica
doi: 10.1371. /journal.pone.0048699.s002
( TIF)
Figura S3.
expressão de proteínas marcadoras pluripotentes em iESCs e iCSCs. Expressão de proteínas da superfície celular marcador, CDH1, SSEA4 e TRA-1-60 foi detectado como fluorescência verde, enquanto os núcleos das células eram tão azuis com DAPI
doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s003
( TIF)
Figura S4.
Os valores médios de expressão gênica (log2) de módulos de CPM em em células somáticas e células estaminais pluripotentes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s004
(TIF)
Tabela S1.
Primers para RT-PCR analisa
doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s005
(DOC)