Abstract

β, β-Dimethylacrylshikonin, um dos componentes ativos nos extratos de raiz de Lithospermum erythrorhizon, possuem actividade antitumoral. Neste estudo, foram discutidos os mecanismos moleculares de β, β-dimethylacrylshikonin na apoptose de células SGC-7901. β, β-Dimethylacrylshikonin reduziu a viabilidade celular de células SGC-7901 numa dose e modo dependente do tempo e da apoptose celular induzida. β, tratamento β-Dimethylacrylshikonin em células SGC-7901 regulada negativamente a expressão de XIAP, cIAP-2 e Bcl-2 e sobre-regulada a expressão de Bak e Bax e causou a perda de potencial de membrana mitocondrial e a libertação de citocromo c . Além disso, β, tratamento β-dimethylacrylshikonin conduziu à activação de caspases-9, 8 e 3, e a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), que foi abolido por pré-tratamento com o inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK . β, β-Dimethylacrylshikonin induziu a fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK) em células SGC-7901. U0126, um inibidor da MEK específica, bloqueou a activação de ERK pela β, β-dimethylacrylshikonin e β revogada, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin. Nossos resultados demonstraram que β, inibiu o crescimento de células SGC-7901 câncer gástrico através da indução de via de sinalização ERK, e forneceu uma pista para avaliação pré-clínica e clínica de β, β-dimethylacrylshikonin para terapia de câncer gástrico-dimethylacrylshikonin β.

citação: Shen XJ, Wang HB, Ma XQ, Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin Induz mitocôndrias Dependente apoptose através ERK Caminho no gástrico humano células cancerosas SGC-7901. PLoS ONE 7 (7): e41773. doi: 10.1371 /journal.pone.0041773

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de março de 2012; Aceite: 25 de junho de 2012; Publicação: 27 de julho de 2012

Direitos de autor: © Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China para X-QM (LY12H28005), ea fundação da ciência de Zhejiang chinês University Medical a H-BW (2011ZY05). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro gástrico é um dos tumores malignos agressivos, embora com o desenvolvimento de radioterapia, quimioterapia e bioterapia, os efeitos secundários graves são inevitáveis ​​[1], por conseguinte, drogas anti-tumor mais eficazes com menos efeitos secundários para o tratamento de câncer gástrico são necessários.

Lithospermum erythrorhizon é uma importante erva chinesa. Ele tem alguns componentes ativos: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (Fig. 1a) e shikonin [2]. Na medicina tradicional chinesa, exibe várias funções biológicas, incluindo anti-microbiano, anti-inflamatória, anti-tumoral, regulação imune e propriedades anti-HIV [3] – [6]. O efeito anti-tumoral de shikonin e seus derivados foram primeiro provado pela sua actividade contra o crescimento do tumor em sarcoma murino-180 [7]. Shikonin exposições efeito não apenas por matar células tumorais directamente, mas também por inibição da angiogénese tumoral [8]. Estudos revelaram que shikonin apoptose induzida em melanoma humano maligno, cancro da bexiga, cancro cervical, cancro do pulmão e cancro do fígado, e assim por diante [9] – [13]. No entanto, tem menos efeitos colaterais e efeitos mais proteção sobre as células normais humanos [14], [15]. Hsu PC et ai mostraram que shikonin levou à célula apoptose através de sobre-regulação de p27, p53, Bax e sub-regulação de Bcl-2 e Bcl-xL em carcinoma colorrectal humano COLO 205 células [16]. A invasão tumoral inibida por shikonin em algumas células cancerosas podem através da infra-regulação de NF-kB mediada por MMP-9 expressão [17]. Shikonin também induz apoptose via produção de ROS em carcinoma hepatocelular [12]. Singh et al F também descobriram que shikonin diminuição dos níveis de EGFR fosforilados, ERK e cinases de tirosina de proteína e um aumento dos níveis intracelulares de proteínas relacionadas com a apoptose, o que causou células de carcinoma epidermóide a sofrer apoptose [18].

(A) a estrutura química do β, β-dimethylacrylshikonin (MW. 370,4). (B) Efeitos de β, β-dimethylacrylshikonin sobre a inibição de viabilidade celular de células SGC-7901. As células foram tratadas com diferentes concentrações de β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 h e 48 h. A viabilidade celular relacionada foi determinada por ensaio MTT. A viabilidade do grupo de controlo (DMSO a 0,1%) foi definida como 100%. Os dados representam a média ± desvio padrão obtido a partir de três experiências independentes. * Indicada p 0,05 comparado com o grupo de controlo, respectivamente

A evidência recente mostrou que β, β-dimethylacrylshikonin teve efeito anti-tumor significativo no carcinoma hepatocelular por activação da caspase-3 [19].. No entanto, tal efeito de β, β-dimethylacrylshikonin em células de cancro gástrico humano não foi relatada e os mecanismos moleculares ainda não são bem compreendidas. Assim, no presente estudo, vamos discutir efeito do β, β-dimethylacrylshikonin em células de câncer gástrico humano SGC-7901 e sua sinalização relacionada a compreender melhor o mecanismo de β, β-dimethylacrylshikonin sobre o câncer gástrico.

materiais e Métodos

materiais e reagentes

células SGC-7901 foram comprados da Academia chinesa de Ciências Cell Bank of Type Culture Collection (Xangai, China). β, β-Dimethylacrylshikonin foi comprado de Tokyo Chemical Industry (Tóquio, Japão). MTT e DAPI foram adquiridos a partir de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). U0126 foi adquirido a Cell Signaling (Boston, MA, EUA). inibidor pan-caspase (Z-VAD-FMK) foi comprado de Beyotime Instituto de Biotecnologia (Xangai, China). Anticorpo para o citocromo c foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos contra ERK, fosfo-ERK, a Bcl-2, Bcl-XL, XIAP, cIAP-2, survivn, Bax, Bak, caspase-9, caspase-3 clivada, clivado da PARP e β-actina foram adquiridos a partir de Cell Signaling ( Boston, MA, EUA). Kit de FITC-anexina V de detecção da apoptose foi adquirido da Becton Dickinson (San Diego, CA, EUA).

Cultura de células e ensaio de proliferação de células

células SGC-7901 foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, UT), e mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Em seguida, as células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração final de 5 x 10

3 células /poço e incubadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS durante 24 h, após o que, as células foram tratadas com a concentração indicada de β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 h e 48 h. O meio foi removido e foi adicionado meio fresco a cada poço, juntamente com 20 jil de solução de MTT (5 mg /ml). Após 4 h de incubação, 150 uL de DMSO foi adicionado a cada poço. As placas foram lidas a comprimentos de onda de 570 nm, utilizando Varioskan flash multimodo Reader (Thermo Scientific, EUA). Quatro reduplicate poços foram utilizados para cada tratamento, e as experiências foram repetidas três vezes.

alterações morfológicas

células SGC-7901 foram colocadas na cavidade de uma placa de seis poços. Após 24 h de cultura de células, que foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin para os períodos de tempo indicados. A morfologia celular foi observada utilizando um microscópio invertido. (Modelo IX70; Olympus, Tóquio, Japão)

DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole) coloração

células SGC-7901 foram colocados na cavidade de uma placa de seis poços. Após 24 h de cultura de células, que foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin para os períodos de tempo indicados, em seguida, as células foram fixadas em acetona fria durante 30 minutos, e incubada com DAPI (1 mg /ml) durante 30 min. Os núcleos apoptóticos caracterizado como intensivamente coradas foram detectados por microscopia fluorescente. (Modelo IX71; Olympus, Tóquio, Japão)

anexina V /PI ensaios para apoptose

Para anexina V /PI ensaios, células foram coradas com AnnexinV-FITC e PI, e avaliadas quanto a apoptose por citometria de fluxo de acordo com o protocolo do mannufacturer (BD PharMingen, San Diego, CA, EUA). Resumidamente, 1 x 10

5 as células foram lavadas duas vezes com PBS, e coradas com 5 ul de AnnexinV-FITC e 5 ul de PI em 500 ul de tampão de ligação durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células apoptóticas foram determinadas usando o software diva BD FACS (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Anexina V coloração serve como uma medida de externalização fosfatidilserina e células que são anexina V

+ /PI

-. Representam células início apoptóticos

A medição do potencial de membrana mitocondrial

Cells ( 5 × 10

5 células /ml) foram tratados com ou sem β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 24 h e manchados com JC-1 (BD MitoScreen JC-1 Kit, Becton Dickinson, EUA) para 15 min a 37 ° C. potencial de membrana mitocondrial foi detectada por citometria de fluxo (FACSCanto II, Becton Dickinson, EUA).

Bloting análise ocidental

As células foram tratadas com a concentração indicada de β, β-dimethylacrylshikonin durante o tempo indicado em meio RPMI 1640 com FCS a 10%. As células foram recolhidas em PBS arrefecido em gelo, e os extractos celulares foram preparados em tampão RIPA com o cocktail inibidor de proteinase a partir de Calbiochem (San Diego, CA). As concentrações proteicas dos lisados ​​de células foram determinadas e fervido com tampão de gel de carga durante 10 min a 100 ° C. As amostras contendo 30 ug de proteína total foram sujeitas a electroforese em géis de 10% SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de PVDF (Millipore, Temecula, CA). Após transferência, a membrana foi bloqueada em TBST (TBS contendo 0,1% de Tween 20) contendo 5% de leite desnatado durante 2 horas, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários apropriados. Após lavagem três vezes em TBST, as membranas foram incubadas durante 2 h a 37 ° C com anticorpos secundários conjugados com peroxidase apropriados 1:5000 rábano. Finalmente, as membranas foram visualizadas utilizando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Kit Immun-Star WesternC, Bio-Rad, EUA).

Imunofluorescência coloração

Immunofluorescene coloração foi usada para analisar a distribuição subcelular de citocromo C em células SGC-7901 induzidas por β, β-dimethylacrylshikonin. As células cultivadas em coverlips vidro estéreis foram fixadas em acetona fria durante 10 min. Após permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 durante 20 min à temperatura ambiente, as células foram bloqueadas em 3% de albumina de soro de bovino durante 30 minutos e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo anti-citocromo C (01:30). Após lavagem três vezes em PBS, as células SGC-7901 foram marcadas com o anticorpo secundário conjugado 488-Alexa Fluor. DAPI foi subsequentemente adicionado para coloração nuclear. A análise microscópica foi realizada utilizando um microscópio fluorescente (modelo IX71; Olympus, Tóquio, Japão).

A análise estatística

Os dados reportados são a média ± desvio padrão (SD) de três experimentos independentes. Eles foram avaliados por análise de uma via de variância (ANOVA). Diferenças significativas foram estabelecidos em p . 0,05

Resultados

β, β-Dimethylacrylshikonin inibe a viabilidade das células SGC-7901

A fim de determinar o efeito citotóxico de β, β-dimethylacrylshikonin em células de câncer gástrico. células SGC-7901 foram tratados com 2,5, 5, 7,5, 10 nmol /L de β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 h e 48 h, a viabilidade reduzida das células tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin foi 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82%, e 61,76 ± 0,18%, respectivamente, às 24 h em comparação com as células tratadas com veículo (Fig. 1B). Para o tratamento de 48 horas, a viabilidade celular foi de 52,03 ± 9,45%, 38,99% ± 1,43, 30,70 ± 1,58%, e 27,4 ± 0,31% (Fig. 1B). A metade da concentração máxima inibitória (IC

50) de β, β-dimethylacrylshikonin para células SGC-7901 foi 11,04? M e 2,89? M às 24 h e 48 h, respectivamente.

β, β-Dimethylacrylshikonin induz SCG -7901 células apoptose

células SGC-7901 foram primeiro tratados com β, β-dimethylacrylshikonin, os resultados mostraram que as células marcadas foram submetidos a alterações morfológicas após tratamento com 10 nmol /L β, β-dimethylacrylshikonin em comparação com o controlo não tratado para 24 h. Na presença de β, β-dimethylacrylshikonin, o número de células SGC-7901 reduziu as células e tornou-se rodada para cima e pequena em forma, e separando a partir da placa em comparação com o grupo de controlo negativo (Fig. 2A). β, β-dimethylacrylshikonin também induziu a condensação nuclear com DAPI coloração intensiva em comparação com o nuclear de células de SGC-7901 de controlo durante 24 h (Fig. 2B).

(a) Morfologia celular foi detectado usando um microscópio invertido com 200 × ampliação. (B) a condensação de ADN (seta branca) foi medida através da coloração de DAPI e analisado sob um microscópio de fluorescência com ampliação de 200 x. (C) O estado apoptótico foi avaliada pelo ensaio de ligação de anexina V-FITC. A parte inferior direita (anexina V-FITC

+ /PI

-) foi considerado como estágio inicial de células em apoptose e parte superior direita (anexina V-FITC

+ /PI

+) foi considerada como fase tardia de células apoptóticas. A parte esquerda inferior (anexina V-FITC

– /PI

-) foi considerado como células viáveis ​​e a parte superior esquerda (anexina V-FITC

– /PI

+) foi considerado como necrótica células.

para determinar se a citotoxicidade de β, β-dimethylacrylshikonin envolvido apoptose, foi avaliado o efeito apoptótico de β, β-dimethylacrylshikonin em células SGC-7901 por citometria de fluxo para a Anexina V e iodeto de propídio ( PI) coloração. A percentagem de células apoptóticas precoces (anexina V

+ /PI

-) foi de 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3%, e 24,4% em resposta ao veículo, 2,5, 5, 7,5, e 10 umol /L β, β-dimethylacrylshikonin respectivamente, durante 24 h (Fig. 2C). Interessantemente, as células apoptóticas tardias (anexina V

+ /PI

+) foram significativamente aumentados em células SGC-7901 (29,7% com 7,5 mmol /L e 33,6% com 10 pmol /L β, tratamento β-dimethylacrylshikonin ) (Fig. 2C).

β, β-dimethylacrylshikonin induz eventos mitocondriais associadas com a apoptose em células SGC-7901

proteínas da família Bcl-2 incluem proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bak e bid) e proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, CIAP-2, XIAP e survivina). Eles podem activar ou inibir a libertação dos factores a jusante que conduzem à activação de caspase-3 e PARP na execução da apoptose [20]. A fim de detectar as proteínas relacionadas com a apoptose, proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bak) e proteínas anti-apoptóticas (XIAP, CIAP-2, Bcl-2, Bcl-xL, survivina) foram detectados por transferência de Western após SGC-7901 As células foram tratadas com diferentes concentrações de β, β-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5 e 10 umol /L) durante 24 h. Os resultados indicaram que β, β-dimethylacrylshikonin diminuir a expressão de XIAP, cIAP-2, Bcl-2 (Fig. 3A). No entanto, a sub-regulação de XIAP e Bcl-2, foi menos pronunciada, enquanto a sub-regulação de cIAP-2 foi bastante dramática e dependente da dose. Não houve alteração significativa da Bcl-xL e survivn em células SGC-7901. Se β, β-dimethylacrylshikonin pode modular a expressão de proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bak) foi também examinada. Descobrimos que β, β-dimethylacrylshikonin aumentou a expressão de Bak de uma forma dependente da dose, mas teve pouco efeito sobre o Bax (Figura 3B).

análise de transferência de Western de proteínas anti-apoptóticas:. Bcl-2, Bcl-xL, cIAP-2, XIAP e survivina (a), e as proteínas pró-apoptóticas: Bax, Bak (B), e PARP clivada, caspase-9 clivada, caspase-8, caspase-3 (C) em os extractos celulares totais após as células SGC-7901 foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 h. Os níveis de proteína de actina também foram medidos como controlos. (D) de detecção de potencial de membrana mitocondrial por citometria de fluxo. células SGC-7901 foram tratadas com ou sem β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 24 h e foram coradas com JC-1 durante 15 min a 37 ° C e submetido a citometria de fluxo. (E) células SGC-7901 foram fixados e rotulado para citocromo c (verde) e DNA (azul). (F) células SGC-7901 foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin na presença ou ausência de Z-VAD-FMK (10 umol /L) durante 24 h. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio de transferência de Western utilizando anticorpos contra a caspase-3 clivada, PARP clivada. Os níveis de proteína de actina também foram medidos como controlos. (G) As células SGC-7901 foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin na presença ou ausência de Z-VAD-FMK (10 umol /L) durante 24 h. O estado apoptótico foi determinada por anexina V-FITC ensaio de ligação. A parte inferior direita (anexina V-FITC

+ /PI

-) foi considerado como estágio inicial de células em apoptose e parte superior direita (anexina V-FITC

+ /PI

+) foi considerada como fase tardia de células apoptóticas. A parte esquerda inferior (anexina V-FITC

– /PI

-) foi considerado como células viáveis ​​e a parte superior esquerda (anexina V-FITC

– /PI

+) foi considerado como necrótica células.

proteínas da família caspase são enzimas críticas para executar apoptose. Entre os membros da família da caspase, caspase-3 é um executor chave para a apoptose em células de mamíferos [21]. Ele pode ser activada através da morte mediada por receptor extrínseca da caspase-8 e as mitocôndrias via dependente de caspase-9 via intrínseca [22], [23]. A fim de melhor compreender o mecanismo molecular da apoptose, as células SGC-7901 foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin e detectada por análise de transferência de Western para a mudança de caspase-3 expressão, caspase-8 e caspase-9, os resultados mostraram um elevação dependente da dose da caspase-3 clivada, caspase-8 e clivada, β-dimethylacrylshikonin tratada células caspase-9 em β. clivagem de PARP, outra característica bem conhecida da apoptose, também foi encontrada em β, as células tratadas β-dimethylacrylshikonin (Fig. 3C). disfunção mitocondrial induzida por apoptose que é, muitas vezes a consequência de uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial. Tem sido mostrado para ser central para a via apoptótica. As células SGC-7901 foram tratadas com ou sem β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 24 h, os resultados mostraram o potencial de membrana mitocondrial foi reduzida de 98,6% para 56,9% depois de β, β-dimethylacrylshikonin foi tratado com o SGC- 7901 células (Fig. 3D). A seguir, examinou a distribuição e localização subcelular de citocromo c para descobrir se a via de mitocôndrias está envolvido em β, β-dimethylacrylshikonin apoptose induzida. Depois de células SGC-7901 foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 24 h, a distribuição do citocromo c foi visualizado com um microscópio confocal a laser, as células tratadas β, β-dimethylacrylshikonin apresentaram morfologia turva (Fig. 3E) em contraste com a aparência obviamente clara nas células de controlo, indicando a translocação de citocromo c a partir da mitocondria para o citoplasma em β, β-dimethylacrylshikonin células tratadas.

para determinar o papel da activação da caspase em β, β-dimethylacrylshikonin- apoptose induzida, que trataram células SGC-7901 com inibidor pan-caspase Z-VAD-FMK (10 mmol /L) antes de β, o tratamento β-dimethylacrylshikonin. O inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK pré-tratamento diminuiu a expressão de caspase-3 clivada, PARP clivada e β reduzida, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin (Fig 3F . L). Estes dados mostraram que a via da cascata de caspases mitocondrial mediada joga um papel muito importante na β, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin.

β, β-Dimethylacrylshikonin sustentada induz a activação de ERK em células SGC-7901

Verificou-se que MAPK sinalização envolvidos em diversos acontecimentos de estresse celular e a apoptose induzida por estímulos de células [24], [25]. Estudámos, portanto, a activação de ERK, JNK e p38 após β, tratamento β-dimethylacrylshikonin. Como mostrado na Fig. 4A B, os níveis de fosforilação de ERK e JNK foram aparentemente aumentada em resposta ao β, tratamento β-dimethylacrylshikonin durante 2 h, e os níveis de fosforilação exibiu um modo dependente da dose. Além disso, os níveis de fosforilação de ERK últimos vinte e quatro horas. No entanto, não se observaram alterações significativas dos níveis de fosforilação de p38 após a β, tratamento β-dimethylacrylshikonin (Fig. 4C). Estes resultados sugerem que a activação sustentada do ERK está envolvida na β, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin em células SGC-7901.

células SGC-7901 foram tratados com o β indicado, a concentração β-dimethylacrylshikonin ou o indicado intervalo, extractos celulares totais foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de formas fosforiladas de ERK (a), de JNK (B) e p38 (C). As membranas foram sondado com anticorpos contra ERK total, a JNK e p38 para a normalização.

A via de sinalização ERK está envolvida em β, β-dimethylacrylshikonin apoptose induzida em células SGC-7901

em seguida examinado se a β, activação sustentada β-induzida por dimethylacrylshikonin da via de sinalização de ERK desempenha um papel na apoptose. Como mostrado na Fig. 5A B, ensaio de mancha de Western revelou que U0126 (um inibidor de MEK específica) inibiu a activação de ERK sustentada e a clivagem de caspase-3, a PARP em β, tratamento β-dimethylacrylshikonin enquanto o inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK não teve efeito sobre β, activação de ERK (Fig. 5D) β-dimethylacrylshikonin-induzida. Além disso, U0126 reduzida, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin β em células SGC-7901 (Fig. 5C). Estes resultados mostraram que β, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin em células SGC-7901 são mediadas pela activação sustentada da via de sinalização de ERK.

(A) células SGC-7901 foram pré-tratadas ou não pré-tratadas com U0126 ( 10 umol /L), em seguida, adicionado com DMSO (veículo) ou β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 2 h, 24 h, respectivamente. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de ERK fosforilada. Os níveis de proteína do total ERK foram também medir como controles. (B) As células SGC-7901 foram pré-tratadas ou não pré-tratadas com U0126 (10 umol /L), em seguida, adicionado com DMSO (veículo) ou β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 24 h. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio de transferência de Western utilizando anticorpos contra a caspase-3 clivada, PARP clivada. Os níveis de proteína de actina também foram medidos como controlos. células (C) SGC-7901 foram tratadas com β, β-dimethylacrylshikonin na presença ou ausência de U0126 (10 umol /L) durante 24 h. O estado apoptótico foi determinada por anexina V-FITC ensaio de ligação. A parte inferior direita (anexina V-FITC

+ /PI

-) foi considerado como estágio inicial de células em apoptose e parte superior direita (anexina V-FITC

+ /PI

+) foi considerada como fase tardia de células apoptóticas. A parte esquerda inferior (anexina V-FITC

– /PI

-) foi considerado como células viáveis ​​e a parte superior esquerda (anexina V-FITC

– /PI

+) foi considerado como necrótica células. (D) As células SGC-7901 foram pré-tratadas com ou sem Z-VAD-FMK (10 umol /L) foram posteriormente incubadas com β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /L) durante 24 h. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de ERK fosforilada. Os níveis de proteína de ERK foram também medidas como controles.

derivados Discussão

shikonin são os componentes ativos isolados do erythrorhizon Lithospermum tradicional chinesa [5]. Estes compostos são promissores candidatos a fármacos que tenham sido referidos como tendo múltiplos efeitos anticancro in vivo e in vitro [5], [26]. Entre os componentes de Lithospermum erythrorhizon, β, β-Dimethylaerylshikonin tem importantes efeitos anti-tumorais em comparação com outros ingredientes activos [27]. No que diz respeito à actividade anti-cancro, a apoptose das células-rendido shikonin através da activação da via dependente de caspase foi encontrada em muitos tumores malignos. Neste estudo, nós investigamos o efeito de β, β-dimethylacrylshikonin em células SGC-7901 câncer gástrico humanos. Os nossos resultados indicam que o tratamento de células SGC-7901 com β, β-dimethylacrylshikonin apresentou um efeito citotóxico significativo contra células SGC-7901 numa dose e forma dependente do tempo, e β, β-dimethylacrylshikonin apoptose induzida em células de SGC-7901 foi evidenciado pela um aumento de células início apoptóticos (anexina V

+ /PI

-). e células tarde apoptóticos (anexina V

+ /PI

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O rácio de anti-e a expressão da proteína pro-apoptótica, tal como a Bcl-2 /Bax, é crucial para a indução de apoptose, e que determina a susceptibilidade das células à apoptose [28]. As mitocôndrias desempenham um papel importante na transdução de sinal de apoptose [29]. O translocalização de proteínas apoptóticas do citosol para a mitocôndria conduz à libertação de citocromo c e segundo activador derivado de mitocôndrias de caspases por um decréscimo no potencial da membrana mitocondrial [30], [31]. Shikonin tem sido relatado para induzir a apoptose pela via mitocôndrias em células HepG2 [32]. No presente estudo, mostrou que β, β-dimethylacrylshikonin regulada negativamente a expressão de XIAP, cIAP-2 e Bcl-2 e sobre-regulada a expressão de Bak e Bax, e causou a perda de potencial de membrana mitocondrial e libertação de citocromo c em células SGC-7901, consistente com mitocôndrias apoptose dependente. A observação de β, β-dimethylacrylshikonin mediada por activação de caspase-9, caspase-3, e subsequente clivagem de PARP, bem como o resultado de que o pan-caspase inibidor de Z-VAD-FMK reduz β, apoptose β-induzida por dimethylacrylshikonin em células SGC-7901, sugerindo que a via da cascata de caspases mediada por mitocondrial desempenha um papel fundamental na β, a apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicaram que β, β-dimethylacrylshikonin regula os níveis de proteínas relacionadas à apoptose expressão, faz com que o citocromo c liberação e trigs morte apoptótica celular dependente de caspase.

proteínas quinases Mitógeno-ativadas (MAPK) regular diversificada programas celulares, incluindo embriogénese, a proliferação, a diferenciação e a apoptose [33]. As proteínas da família da MAPK são compostas por três proteínas cinases: ERK1 /2 (quinases reguladas por sinais extracelulares 1 e 2), a JNK (quinase c-Jun N-terminal) e p38 [34], [35]. Em geral, a activação de ERK transiente conduz à proliferação celular, mas a activação de ERK é sustentado assoctiated com diferenciação [36]. Emergindo evidência sugere que a activação da ERK contribui para a apoptose. Jeong et ai. mostrou que kaempferol causada células de cancro a sofrer apoptose através de uma via dependente de ERK [21], [37], [38]. Recentemente, foi relatado que icaritin induz a inibição do crescimento e apoptose em PSMCs humanos pela via de sinalização de ERK [39]. Li et al. demonstrado que a activação da via de sinalização /MEK /ERK RAF desempenha um papel crucial na apoptose induzida por cálcio de células epiteliais do cristalino [40]. Aqui também descobrimos que a activação de ERK sustentada está envolvido em β, a inibição do crescimento induzida por β-dimethylacrylshikonin e apoptose em células SGC-7901. U0126, um inibidor específico da MEK (MAPK /ERK-quinase), β eficazmente bloqueada, a activação de ERK e β atenuada, apoptose β-induzida por dimethylacrylshikonin, sugerindo que os efeitos pró-apoptóticos de β, β-dimethylacrylshikonin em β-induzida por dimethylacrylshikonin células SGC-7901 são mediadas pela activação sustentada da via de ERK1 /2 de sinalização.

em conclusão, observou-se que β, β-dimethylacrylshikonin inibiu o crescimento celular e a apoptose induzida em células de SGC-7901. Estudamos também os mecanismos subjacentes envolvidos na β, apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin. Os nossos resultados indicaram que β, apoptose β-induzida por dimethylacrylshikonin envolve na redução de XIAP, cIAP-2, e a expressão da proteína Bcl-2 e a indução da expressão da proteína Bak e Bax, e causou a perda do potencial de membrana mitocondrial e a libertação de citocromo C em células SGC-7901. Os nossos resultados também demonstraram que β, a apoptose induzida β-dimethylacrylshikonin envolve a activação de caspase-3, caspase-8 e caspase-9 e a clivagem de PARP. Além disso, via de sinalização ERK também participou de β, apoptose induzida por β-dimethylacrylshikonin. Nossos resultados indicaram que β, β-dimethylacrylshikonin poderia ser desenvolvido como um potencial agente anticancerígeno contra o cancro gástrico humano.

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer H-BW por sua assistência técnica e também agradecer X -QM e J-HC pelos comentários sobre este artigo.