Abstract

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos (± 22 nucleotídeos) RNAs não-codificantes que regulam uma miríade de processos biológicos e são frequentemente desregulado no câncer. microARNs associada ao cancro têm sido detectados no soro e no plasma e uma promessa como biomarcadores de cancro minimamente invasivas, potencialmente para avaliar as características da doença, em pacientes com doença metastática que é difícil de biópsia. Aqui foi utilizado para identificar perfis de miARN miARNs associadas a cancro que são expressos diferencialmente em soros de pacientes com cancro da próstata metastático resistente à castração (mCRPC) em comparação com controlos saudáveis. De 365 miRNAs perfilados, identificamos cinco miRNAs séricas (miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-210 e miR-375), que foram elevados em casos em relação aos controles em toda a duas coortes independentes. Um destes, o miR-210, é um alvo da transcrição conhecido da via de sinalização de HIF-1α hipóxia-responsivas. A exposição de células de cancro da próstata em cultura a hipóxia levou à indução de miR-210 e a sua libertação para o ambiente extracelular. Além disso, descobrimos que o soro miR-210 níveis variaram amplamente entre os pacientes submetidos à terapia mCRPC, e correlacionados com a resposta ao tratamento, avaliada pela alteração do PSA. Nossos resultados sugerem que (i) a hipóxia associada a cancro é uma característica frequente, anteriormente subestimado de mCRPC, e (ii) de soro miR-210 pode ser desenvolvido como um biomarcador preditivo em pacientes com este biologia doença distinta.

Citation: Cheng HH, Mitchell PS, Kroh EM, Dowell AE, Chéry L, Siddiqui J, et al. (2013) Circulação microRNA Profiling Identifica um subconjunto de metastáticas da próstata doentes oncológicos com evidência de câncer Associada à hipóxia. PLoS ONE 8 (7): e69239. doi: 10.1371 /journal.pone.0069239

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril 2013; Aceito: 06 de junho de 2013; Publicação: 30 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida por Canary Foundation (de MT), Damon Award Runyon-Rachleff Inovação (para MT), DOD Award Prostate Cancer New Investigator (de MT), Institutos Nacionais de Saúde (NIH) CA093900 (a KJP), NIH CA143055 (a KJP) , NIH PO1 CA085859 (a RLV), NIH SPORE P50 CA69568 (a KJP e AMC), NIH SPORE P50 CA97186 (a PSN, MT, e RLV), NIH TR01 5R01DK085714 (de MT), NIH T32CA009515-28 (a HHC) , Prêmio Prostate Cancer Foundation Criatividade (de MT), e Richard M. Lucas Foundation (para RLV). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Muneesh Tewari é um inventor chamado no pedido de patente pendente intitulado “Uso de Extracelular RNA medir a doença, “# 12/993828. H.H.C., P.S.M., E.M.K., A.E.D., L.C., J. S., P.S.N., B.S.K., R.L.V., A.M.C., K.J.P., e C. M. declaram que não há interesses concorrentes. Os autores confirmam que isso não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A história natural de pacientes com câncer de próstata resistente à castração metastático (mCRPC) varia amplamente, sugerindo uma biologia doença heterogênea nesta população de pacientes. No entanto, pouco se sabe sobre a heterogeneidade biológica em mCRPC e abordagens para estratificação clínica dos pacientes são limitados, em grande parte porque o tecido metastático não é rotineiramente disponível para o estudo. Minimamente invasiva (por exemplo, à base de sangue) se aproxima que pode ajudar a estratificar pacientes com base na biologia tumoral distinta poderia ajudar a informar a escolha da terapia, o que é especialmente relevante com a recente introdução de vários novos tratamentos eficazes para mCRPC.

microRNAs (miRNAs circulantes) são uma classe emergente de biomarcadores à base de sangue com o potencial de fornecer informações sobre a biologia do tumor distinto nos pacientes individuais [1]. miRNAs são pequenos (± 22 nucleotídeos), de codificação não-moléculas de RNA que o pós-transcricional regulam a expressão gênica pela repressão ou degradação de transcritos alvo de translação [2]. miARNs específicos têm sido encontrados para regular uma variedade de processos críticos na fisiologia do tumor, incluindo a angiogénese [3], epitelial para mesenquimal transição [4], metástase [5] e a resposta do tumor à hipoxia [6]. miRNAs têm demonstrado ser eficazes à base de tecidos biomarcadores-no cancro diagnosticar cânceres de tecido de origem desconhecida e em prever os resultados clínicos [7] – [9]. Nós e outros autores demonstraram que circula, miARNs, derivadas de tumor isentos de células são altamente estáveis ​​e é detectável no soro de pacientes com cancro [1]. Em trabalhos anteriores, foi utilizada uma abordagem miRNA candidato para identificar elevação significativa de miR-141 no soro de pacientes com câncer de próstata metastático resistente à castração (mCRPC) [1].

A fim de identificar de forma mais abrangente do câncer de próstata -associated miRNAs circulantes, no presente estudo, perfilado miRNAs de soro de pacientes com mCRPC. Foram identificados cinco miRNAs de soro que foram significativamente elevados em casos em comparação com controles saudáveis, incluindo a associada à hipóxia miR-210. A fim de determinar se as células cancerosas da próstata pode liberar miR-210 em resposta à hipóxia, expusemos linhas celulares de cancro da próstata para condições de hipoxia e descobriram que miR-210 foi induzida e libertados no ambiente extracelular. Na análise de espécimes clínicos e os resultados, verificou-se evidência de que um subconjunto de pacientes mCRPC ter aumentado os níveis de miR-210 e que esta está correlacionada com a resposta ao tratamento, o que sugere que o aumento da hipoxia é uma característica de mCRPC que podem definir um subconjunto de pacientes com uma distinta biologia doença.

Materiais e Métodos

Cultura de células

LNCaP (ATCC CRL-1740 ™) e VCaP [10] linhas de células cancerosas humanas da próstata foram cultivadas em RPMI 1640 e DMEM, respectivamente, cada uma suplementada com FBS a 10% (ou em condições isentas de soro, como observado), a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. condições de hipoxia (1% O

2) foram estabelecidos em um Thermo Scientific 3595 Incubadora (ThermoFisher), com células mantidas em condições de normóxia (20% O

2) em paralelo.

Isolamento de RNA a partir de As células em cultura e meio condicionado

O meio condicionado foi removido a partir de células cultivadas durante 24, 48 ou 72 horas, sob condições de hipóxia ou de normóxia. As células foram lavadas com 5 ml PBS e lisadas em gelo diretamente na placa de cultura com 600 mL de tampão de lise /Encadernação do

mir

kit de isolamento Vana miRNA (Ambion). Os lisados ​​foram colhidos manualmente com um raspador de células estéril e transferido para um tubo de microcentrífuga de 2 ml de RNase /DNase-livre. O ARN foi extraído a partir de lisados ​​de células, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante para o isolamento de ARN total. Os detritos celulares foram removidos a partir de uma alíquota de 500 ul de meio condicionado (10 ml de volume total) por filtração através de uma unidade de filtração de 0,2 um NanoSep (Millipore) a 14000 ×

g

, 5 min, à temperatura ambiente. 400 ul de amostra de filtrado foi combinado com 400 ul de 2X desnaturação Solution (Ambion) e vortex.

C. elegans

encrespados em oligonucleótidos foram introduzidos (como uma mistura de 25 fmol de cada oligonucleótido em 5 ul de volume total por amostra líquida), após desnaturação e utilizado para normalização da variabilidade no isolamento de ARN entre amostras, tal como previamente descrito [1]. RNA foi extraído a partir de lisados ​​de meio condicionado usando o

mir

kit Vana PARIS (Ambion) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante para isolamento de RNA total.

Declaração de Ética

Todas as amostras clínicas foram obtidas de indivíduos que forneceram consentimento informado por escrito. Os estudos foram realizados em conformidade com a declaração de diretrizes de Helsínquia e com a aprovação ética dos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Washington, Fred Hutchinson Cancer Research Center e da Universidade de Michigan.

Processamento de Sangue e isolamento de soro de Clínica amostras

Todas as amostras clínicas obtidas na Universidade de Washington e da Universidade de Michigan foram coletadas e processadas como descrito anteriormente [1], [11].

Isolamento de RNA de amostras de soro clínicos

o ARN total foi isolado de 400 ul de soro recolhidas na Universidade de Washington, utilizando o kit miRvana PARIS (Ambion) como anteriormente descrito [1]. Volumes iguais de cada tipo de amostra foram combinados para criar mCRPC e pools de soro de doadores saudáveis ​​(n = 25 para cada pool) para TLDA profiling. O ARN total foi isolado a partir de amostras de soro colhidas na Universidade de Michigan, utilizando o kit de isolamento de ARN miRNeasy (Qiagen) como se segue: 400 ul de soro foi dividida em quatro alíquotas de 100, ul. Cada alíquota foi desnaturado utilizando 10X de volume (1 ml) Qiazol, que foi submetida a vórtice e incubada à temperatura ambiente durante 10 min.

C. elegans

encrespados em oligonucleótidos foram introduzidos (como uma mistura de 25 fmol de cada oligonucleótido em 5 ul de volume total por amostra líquida), após a desnaturação, as quais foram utilizadas para a normalização da variabilidade no isolamento de ARN entre amostras, como descrito anteriormente [1] . O ARN foi extraído usando 0.2X volume de clorofórmio (220 ul), e o ARN total foi isolado seguindo o protocolo do fabricante. Para uma dada amostra, o ARN isolado a partir de cada alíquota de 100 ul foi reunido e concentrado a 100 mL de volume ao longo Microcon YM-3 unidades de filtro (Millipore) a 14000 ×

g

, 1,5 h, 4 ° C, o que eram invertido carregado em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga pesado previamente e eluiu-se a 1000 ×

g

, 3 min, 4 ° C. Os tubos mais eluato foi pesada numa balança analítica e trazido para 100 ul com tampão de eluição. RNA foi armazenado a -80 ° C.

Recolha e Tratamento de secções de tecido clínicos

Laser de captura de micro-dissecção (LCM) de secções de tecido congelado.

Secções de próstata congelado-flash e linfonodo obtido a partir de prostatectomia radical e autópsia rápida, respectivamente, foram avaliadas por um patologista para definir regiões de células epiteliais tumorais. Para a captura de laser microdissecação 5 uM secções de tecido congelado foram feitas num criostato Leica CM3050 S ™ a -20 ° C (Leica, Wetzlar, Alemanha), colocadas em lâminas de PEN Quadro membrana (MDS Inc., Ontario, Canadá), em seguida, marcadas e fixadas de acordo com o protocolo HistoGene ™ LCM congelada Secção coloração Kit (MDS Inc.). Para cada amostra de aproximadamente 2000 células foram a laser capturado em 200x ampliação (Veritas, Arcturus MDS Inc., Ontario, Canadá). A amostra capturada foi colocado em 300 ul de tampão de lise a partir do RNAqueous® Kit de Isolamento de RNA (Ambion, Austin, Texas), incubadas durante 30 minutos a 42 ° C e armazenado a -80 ° C até o isolamento de RNA foi realizada. miARN foi então isolado utilizando o kit de isolamento de ARN RNAqueous® (Ambion).

isolamento de ARN a partir de amostras de tecido de LCM.

O ARN total foi isolado a partir de amostras de tecido de LCM, utilizando o kit de isolamento de ARN RNAqueous-Micro (Ambion) como se segue: os lisados ​​congeladas foram descongeladas em gelo, turbilhonamento e centrifugou-se a 16100 x g, 30 segundos, temperatura ambiente.

C. elegans

-cravado em oligonucleótidos foram introduzidos (como uma mistura de 25 fmol de cada oligonucleótido em 5 ul de volume total por amostra líquida) e utilizado para normalização da variabilidade no isolamento de ARN entre amostras, como descrito anteriormente [1], seguido pela adição de 3 ul LCM Aditivo. O ARN foi precipitado a partir da mistura de lisado com 1,25 volumes de 100% de grau molecular de EtOH, e foi subsequentemente ligada ao conjunto do cartucho de filtro de microfibra (prewet com 30 ul de lise solução durante 5 min) por centrifugação a 10.000 x g, 1 min. O filtro foi lavado (180 uL de solução de lavagem 1, 10000 ×

g

, 1 min; 2 × 180 uL de solução de lavagem 03/02, 16100 ×

g

, 30 s; apenas ar, 16.100 ×

g

, 30 seg). O ARN foi eluído a partir da coluna duas vezes com 10 ul de Tampão 95 ° C eluição em tubos pré-pesados. Os eluatos foram pesados ​​numa balança analítica e trazido para 20 ul com tampão de eluição. O ARN foi armazenado a -80 ° C.

Profiling MicroRNA utilizando TaqMan Low-Density matriz miARN qRT-PCR e selecção de candidatos Biomarcador

ARN a partir de soro reunido de pacientes mCRPC ou controlos saudáveis ​​(composto de volume de RNA igual de cada uma das 25 amostras por piscina) foi reverso transcrito em reações duplicados a partir de 2 ul de RNA agrupados usando o kit TaqMan miRNA transcrição reversa ea TaqMan miRNA Multiplex RT Ensaios (pool Humano Set). Uma abordagem amostra colectiva foi escolhido para a descoberta de custo-eficiente de biomarcadores de miRNA. expressão miARN foi perfilado de cada replicado reacção de RT usando a matriz de TaqMan de baixa densidade (TLDA, v1.0) como anteriormente descrito [1]. Multiplex de transcrição reversa-TLDA de qRT-PCR foi realizada em um termociclador Applied Biosystems 7900HT usando as condições dos ciclos recomendados pelo fabricante. Os dados foram analisados ​​com SDS a quantificação relativa Software versão 2.2.2 (Applied Biosystems), com um limite mínimo atribuído automaticamente, o que era acima da linha de base de todos os ensaios que mostram a amplificação mensurável acima do fundo. Os valores que estavam abaixo do limite mínimo foram arbitrariamente atribuído um valor limiar de ciclo (CT) de 40.

P

-Valores foram atribuídos pelo teste t de Student avaliar perfis de replicar os dados de cada conjunto para determinar as diferenças significativas na expressão de miARN entre piscina mCRPC e amostras saudáveis ​​RNA piscina controle. Fold-change valores (FC) foram obtidos através de computação 2

∧ (AveCT

mCRPC pool-AveCT

piscina de controle saudável). biomarcadores MicroRNA candidatos foram selecionados por critério de FC 5 e

P

. 0,05

Medição de miRNA e mRNA níveis, individual TaqMan quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR)

miARN-derivado de amostras de soro foram sujeitos a transcrição reversa utilizando o kit TaqMan miARN Transcrição reversa (Applied Biosystems) e quantificado por TaqMan miARN qRT-PCR utilizando conjuntos de iniciador /sonda específica para um miARN (Applied Biosystems), como descrito anteriormente [ ,,,0],1]. Uma descrição completa de ensaios TaqMan utilizados neste estudo é apresentado na Tabela S4.

miARNs derivados a partir de amostras de soro obtidas a partir da Universidade de Michigan foram quantificados por TaqMan miARN qRT-PCR, utilizando curvas padrão de miARN sintéticos para a quantificação absoluta idêntica ao descrito para o conjunto de amostras Universidade de Washington [1] com a excepção de que o passo de pré-amplificação foi excluído de todo miARN quantificação diferente de miR-210 (isto foi baseado em evidência empírica que a pré-amplificação não aumenta a cópia absoluta número de miARN detectável para outros ensaios TaqMan miARN aqui utilizados, dados não mostrados)

Gene-expressão foi quantificada por TaqMan qRT-PCR como se segue:. RNA foi transcrito de forma reversa utilizando o TaqMan Gene Expression-kit de transcrição reversa (Applied Biosystems), numa reacção de RT de pequena escala [composta por 0,5 ul de 10X tampão de transcrição reversa, 0,5 uL 10X aleatórios Primers, 0,2 ul de dNTPs 100 mM de dTTP, com 0,25 ul MultiScribe da transcriptase reversa e ARN 3,55 ul de entrada; com excepção do ARN de entrada componentes foram preparados como uma mistura principal de maior volume], utilizando uma Thermal Cycler Tetrad2 Peltier (BioRad) a 50 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 10 min, 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 60 seg. ADNc resultante foi combinado com 3,75 ul reagentes do ensaio de pré-amplificação [composto de 2,5 ul TaqMan PreAmp Master Mix e 1,25 ul TaqMan Gene Expression Assay-(GUSB ou KRT18) diluído em TE 1:100; outros do que o ADNc de entrada componentes foram preparados como uma mistura principal de volume maior para gerar um 5,0 ul de volume total de reacção de PCR], utilizando uma Thermal Cycler Tetrad2 Peltier (BioRad) a 95 ° C durante 10 min, seguido por 14 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 4 min. produtos de reacção de pré-amplificação GUSB ou KRT18 foram combinados com 2,75 ul de reagentes de ensaio de PCR [composto de 2,5 ul TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, n AmpErase UNG e 0,25 ul de 20X TaqMan Gene-Expression Assay) para gerar um 5,0 ul de volume total de PCR reacção para GUSB ou KRT18, respectivamente. PCR em tempo real foi realizada em um termociclador Applied BioSystems 7900HT a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Os dados foram analisados ​​com SDS Relativa Quantificação Software versão 2.2.2 (Applied Biosystems), com o ajuste automático de CT para a atribuição de linha de base e limite para a determinação de CT (Ver Tabela S3 para resultados de medições de RNA mensageiro).

Resultados e discussão

a fim de forma eficiente descobrir miRNAs soro que são diferencialmente abundante entre os casos vs. controles, usamos baseados em PCR em tempo real Arrays miRNA TaqMan de baixa densidade (TLDA) para triagem de abundância diferencial de 365 miRNAs câncer em RNA soro reunido de pacientes mCRPC (

n =

25) versus controles pareados por idade (

n =

25; todos os controles teve PSA normal e achados do exame do toque retal normais). Após a normalização dos dados usando spike-in miRNAs de controle e comparação de RNA soro reunido a partir de casos mCRPC ao de controles (Fig. 1

A

e

inserir

), foram identificados nove miRNAs demonstrando uma maior do que a mudança de 5 vezes em abundância (não ajustados

P Art 0,05, teste t de Student). A seguir, medidos individualmente estes nove miARNs a partir do ARN de soro de casos e controlos mCRPC individuais utilizando ensaios Taqman qRT-PCR miARN específicos de. Os níveis séricos de cinco miRNAs foram confirmados para ser significativamente elevados em casos mCRPC comparação com os controles (MIR-141:

P Art 0,0001, miR-200a:

P = 0,007

, miR-200C :

P = 0,017

, miR-375:

P = 0,009

e miR-210: análise

P = 0,022

, postos sinalizados de Wilcoxon). A dobra-diferença média entre casos e controles variou de 4,6 (miR-375) a 27,9 (miR-141) (Fig. 1

B

,

superior e Tabela S1). Além disso, characteristic (ROC) parcelas operacional do receptor demonstrar a capacidade desses miRNAs para discriminar entre os dois grupos (miR-141 área sob a curva (AUC) = 0,899; AUC miR-200a = 0,699; miR-375 AUC = 0,773 ; miR-200c AUC = 0,721 e miR-210 AUC = 0,678) (Fig 1

B

,

menor

).. Importante, verificou-se que miRNAs de controlo não foram expressos diferencialmente entre as duas populações (Fig. S1).

(

A)

Medição de miRNAs em soros reunidos de pacientes com câncer de próstata avançado como circulantes em comparação com dadores saudáveis ​​(incluindo um conjunto Discovery) por TLDA profiling. Blue- e círculos cheios representam Brown-miARNs soro aumentada ou diminuída (não ajustado com valor de p 0,05), respectivamente, em pacientes mCRPC em comparação com controlos saudáveis.

Detalhe:

Nove miRNAs demonstrado mudança de 5 vezes (não ajustados

P Art 0,05, teste t de Student). FC, dobre-a mudança. (

B)

Confirmação de miRNAs soro mCRPC-associados em amostras individuais a partir do conjunto Descoberta das amostras Universidade de Washington.

Alta

: miRNA candidatos biomarcadores foram medidos em amostras individuais por TaqMan miRNA qRT-PCR (

valor P

atribuído pela Wilcoxon signed-rank), onde miRNA abundância é dada em termos de miRNA cópias /soro ul. As barras vermelhas, média +/- SEM de miRNA cópias /mL de soro para cada grupo.

Baixa

: operating characteristic (ROC) Receptor traçar sensibilidade vs. (1 – especificidade) para avaliar a capacidade de cada biomarcador miRNA para distinguir casos de controles.

(C)

Validação de miRNAs soro mCRPC-associados em um conjunto de validação independente.

Alta

: A concentração sérica (cópias /mL) de miR-141, miR-375, miR-200c, miR-200a e miR-210 foi medida por TaqMan miRNA qRT-PCR. Dot-enredo associado

valores

P foram atribuídos pelo Wilcoxon signed-rank. gráficos de pontos e curvas ROC foram geradas como descrito para a Fig. 1.

Baixa

:

Red

, os resultados do conjunto de amostra de validação obtido a partir da Universidade de Michigan.

Black

, os resultados do conjunto de amostras primários obtidos a partir da Universidade de Washington reproduzida a partir da Fig. 1

B

, menor

. AUC, área sob a curva; mCRPC, próstata soros de pacientes de câncer; FC, fold-change; CTL, soros de controlo (de indivíduos do sexo masculino da mesma idade com PSA normal e exame de toque retal negativo).

Para validar esses achados em um conjunto de amostras independentes coletadas em uma instituição diferente, medimos miR-141 , miR-200a, miR-200c, miR-375 e miR-210 a partir do soro de um 21 pacientes mCRPC adicionais e 20 controles saudáveis ​​pareados por idade recolhidos na Universidade de Michigan. Todos os cinco miRNAs foram elevadas em soros de casos mCRPC relativos a controlos que este conjunto de validação independente. MiR-141, miR-375 e miR-210 foram significativos em um

P

-valor limiar da 0,01 na segunda coorte (

P = 0,001

,

P =

0,021,

P =

0,022, respectivamente) e miR-200a e miR-200c tendeu à significância (

P = 0,073

,

P =

0,055, respectivamente) (Fig. 1

C

,

superior

). Curvas ROC foram geralmente concordantes entre os conjuntos de amostras das duas instituições (Fig. 1

C

,

menor

). Análise dos marcadores de miARN no soro em várias combinações demonstrado que a adição de soro miARNs adicionais para miR-141 (que tinha o melhor desempenho sozinha) não melhorou a capacidade de distinguir entre casos e controlos (dados não mostrados). Consistente com esta observação, verificou-se que entre os casos de cancro em que a expressão de miR-141, miR-200a, miR-200c, e miR-375 foi mais elevada do que todos os controlos saudáveis, estas miARNs também estavam significativamente correlacionados uns com os outros e com soro PSA (Tabela S2). Em contraste, o miR-210 não apresentaram correlação significativa com qualquer um destes quatro miRNAs (Tabela S3) nem com PSA sérico, sugerindo que ele fornece informações distintas sobre a biologia da doença.

Para determinar se os cinco marcadores miRNA do soro de mCRPC são expressas em tecido de cancro da próstata e podem, por conseguinte, ser plausivelmente derivadas de células de cancro, que mediu a sua expressão em células epiteliais que tinha sido captura laser de micro-dissecadas a partir de tecidos de cancro da próstata primário (

n =

8) e metástases linfáticas (

n =

8). Detectamos miR-141, miR-200a, miR-200c, o miR-375 e miR-210 em todos os tipos de tecidos analisados ​​(Tabela S3), sugerindo que estas cinco miARNs, quando encontrados na circulação, podem ser originários de cancro da próstata, embora outras fontes adicionais não podem ser excluídos.

Três dos miARNs associados ao cancro da próstata no soro identificados (miR-141, miR-200a e miR-200c) são específicas do epitelial, altamente relacionado em sequência e têm papéis conhecidos em manter o estado epitelial, pela supressão da transição epitelial-mesenquimal-a [4]. Nossa hipótese é que os níveis circulantes elevados de miR-141, miR-200a e miR-200c refletir a origem epitelial de células de câncer de próstata.

A presença de elevados circulando miR-141 e miR-375 em pacientes mCRPC tem também foi observado em recente mCRPC circulando estudos de biomarcadores miRNA [12] – [16]. Curiosamente, elevou miR-210 não foi relatada nesses outros estudos, apesar do fato de que nós observamos isso em conjuntos de amostras independentes de duas instituições diferentes. Isto pode ser devido a diferentes grupos de comparação utilizados (por exemplo, cancro da próstata localizado em vez de controlos saudáveis ​​como o comparador para mCRPC), o uso de plasma em vez de soro, as diferenças na abordagem analítica de dados utilizado para identificar miARNs expressos diferencialmente, bem como potenciais diferenças nas características clínicas dos pacientes mCRPC em diferentes estudos.

os níveis elevados de miR-210 no soro de pacientes com mCRPC foi particularmente interessante, porque este miARN é bem conhecido por ser transcricionalmente activado pelo hipoxia -inducible fator 1 alfa (HIF-1α) [17], [18] e pode contribuir para a adaptação à hipoxia em tumores [19], [20]. Isto levanta a possibilidade de que o miR-210 é produzida e libertada pelas células hipóxicas no cancro da próstata (e /ou por o microambiente do tumor), uma potencial explicação para os níveis elevados de miR-210 observou-se no soro de um subconjunto de pacientes com mCRPC.

Para testar se a hipóxia pode estimular a produção e liberação de miR-210 em células de câncer de próstata, caracterizamos miR-210 abundância em linhas celulares de cancro da próstata LNCaP e capnografia, (bem como em meios condicionados filtrada) sob normóxica (20% O

2) e hipoxia (1% de O

2) condições ao longo de um curso de tempo de 72 horas (Fig. 2). miR-210 níveis foram aumentados por hipoxia em comparação com a normoxia com uma indução inicial em células LNCaP seguido por um nível aumentado subsequente nos meios condicionados (Fig. 2). Em células VCaP, não observamos o mesmo aumento no miR-210 cópias /ng de RNA e os níveis caíram em 72 horas. Especula-se que isto pode ser devido à morte das células ou, alternativamente, que a regulação do miR-210 em resposta a hipoxia em células VCaP podem ser primariamente ocorrendo no nível de liberação. No entanto, nós observamos uma gradual, aumento dependente do tempo do nível de extracelular de miR-210 no meio condicionado de células de capnografia, (Fig. 2). Tomados em conjunto, os resultados indicam que níveis elevados de miR-210 detectado no soro poderia refletir hipoxia tumor.

Coluna da esquerda,

miR-210 cópias /RNA ng em LNCaP e VCaP cancro da próstata humana linhas de células cultivadas em condições de normóxia (20% O

2) (barras brancas) ou hipoxia (1% de O

2) (barras azuis) durante 24, 48 ou 72 horas.

coluna da direita,

miR-210 cópias /mL em meio condicionado filtrado correspondente a amostras celulares. *,

P

valor 0,05; **,

P

valor 0,01; ***,

P

valor. 0,001 (teste t de Student)

Tumor hipoxia é um processo bem caracterizado que contribui para a progressão e metástase de câncer em muitos cancros humanos [21]. Avaliação da hipoxia tumor no mCRPC tem sido limitado até à data devido à amostragem frequente de metástases para atendimento clínico de rotina. Em um estudo imuno-histoquímica da expressão de HIF-1α que incorporou um conjunto de metástases do câncer de próstata, expressão HIF-1α foi observada a variar muito em lesões metastáticas [22]. Aqui, mostramos que um subgrupo de pacientes com câncer de próstata metastático têm aumentado os níveis de soro de miR-210, fornecendo evidências de hipóxia anteriormente subestimado em mCRPC. Embora as fontes de tecidos não tumorais de miR-210 não pode ser excluída, o facto de hipoxemia sistémica não é uma característica típica da mCRPC é consistente com um modelo no qual a hipoxia do tecido tumoral é a origem do excesso de soro de miR-210. Notavelmente, elevada circulando o miR-210 também foi observado em pacientes com adenocarcinoma pancreático [23], uma doença em que a hipoxia do tumor é bem conhecido e é devido à alta pressão intersticial devido à resposta desmoplásica hospedeiro.

Um fenómeno bem documentado associada a hipoxia tumoral é a associação com a resistência ao tratamento com radioterapia, quimioterapia e outras terapias [21]. Para determinar se séricos observados níveis de miR-210 foram associadas com resistência ao tratamento, que, retrospectivamente, se os pacientes estavam respondendo ou resistente à terapia em curso por meio do cálculo% de mudança de PSA /dia, utilizando os valores de PSA clínica disponíveis medido mais recente antes e no momento do soro draw miR-210. Terapias variaram entre doentes nesta população retrospectiva, mas tipicamente envolvida terapia de privação de androgénio utilizando um agonista de GnRH em combinação com um agente quimioterapêutico (e.g., docetaxel, mitoxantrona). Descobrimos que o soro miR-210 níveis foram significativamente correlacionados com a mudança% PSA /dia durante o tratamento (Fig. 3

A

, Pearson r = 0,46,

P =

0,029). Para reduzir o potencial de ruído de pacientes que são menos informativo devido aos baixos níveis de miRNAs no soro associados ao câncer, nós também analisou um subgrupo de pacientes com altos níveis de miRNAs soro mCRPC-associados (ie, “miRNA-alta subconjunto”, definidos como pacientes cujo soro de miR-141, miR-200a, miR-200C e /ou níveis de miR-375 foram maiores do que o valor mais elevado observado em qualquer um dos 25 controlos saudáveis). Neste grupo, a correlação entre os níveis séricos miR-210 e% mudança PSA /dia foi ainda mais forte (Fig. 3

A

, Pearson r = 0,61,

P

= 0,029). Além disso, os níveis séricos de miR-210 foram notavelmente inferior em pacientes cuja doença estava a responder ao tratamento (PSA estável ou diminuição), em comparação com aqueles cuja doença era resistente ao tratamento (PSA aumentando por ≥25%) (Fig. 3

B,

P

=

0,001). Importante, não observamos esta associação com os outros quatro miRNAs soro identificados em nosso estudo (Fig. 3

C

). Nossos dados sugerem um modelo no qual o aumento de sinalização de resposta à hipóxia está presente em um subgrupo de pacientes mCRPC, levando ao aumento de soro miR-210 e resistência à terapia

superior:.

MiR-210 cópias /soro ul relação% PSA mudança /dia. % De alteração de PSA /dia representa uma medida da resposta ao tratamento e foi calculada usando os valores de PSA clínicos disponíveis medidos mais recentemente antes, e no momento de soro de miR-210 sorteio. tempo decorrido entre os dois exames de sangue foi de 30 dias significa. círculos fechados representam o subconjunto de pacientes definidos como “miRNA-alta” com base em maior abundância de miRNAs soro mCRPC-associado em comparação a todos os indivíduos de controle (conforme descrito em Resultados e Discussão). círculos abertos representam os pacientes com mCRPC que não respondam à definição de “miRNA-alta”. linha sólida representa linha de tendência do subgrupo populacional miRNA-alta, linha tracejada representa linha de tendência de todos os pacientes.

Médio:

miR-210 cópias /mL de soro em pacientes com tanto uma resposta PSA (R) ou sem resposta PSA (NR). PSA de resposta é definido como uma diminuição ou PSA estável (uma alteração inferior a um aumento de 25%), e nenhuma resposta a PSA é definida como um aumento de PSA de 25% ou mais, semelhante aos critérios do Grupo de Trabalho do cancro da próstata.

Baixa:.

Cópias /mL de soro de miR-141, miR-200a, miR-200c e miR-375 em pacientes, R e NR

Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório de circulação de miR-210 em associação com mCRPC. Os nossos resultados levantam a possibilidade de que o nível sérico de miR-210 níveis poderia ser utilizado para identificar uma biologicamente distintos, subconjunto de pacientes com hipoxia mCRPC associado a tumores para os quais o desenvolvimento de abordagens terapêuticas alternativas poderiam ser consideradas. Por exemplo, os níveis plasmáticos de miR-210 foram relatados como sendo elevados em pacientes com cancro pancreático, e como um indicador de hipoxia [23], [24], bem como correlacionada com a resposta ao trastuzumab em pacientes com cancro da mama [25]. Além disso, os inibidores de mTOR estão a ser estudados no cancro da próstata, e estudos pré-clínicos demonstraram que a inibição de mTOR pode levar à activação AKT e de activação da transcrição HIF-1α [26].