Abstract

A história familiar é um importante fator de risco para o cancro colorectal e muitas famílias segregar a doença como um traço aparentemente monogenic. Uma minoria de cancro colorectal familiar podia ser explicada pelos genes conhecidos e monogénicas loci genéticos. polipose familiar e síndrome de Lynch são duas síndromes onde os genes que predispõem são conhecidos, mas muitas famílias foram testados sem encontrar o gene de predisposição. Foi realizada uma ampla análise de ligação genoma em 121 famílias colorretais com um aumento do risco de câncer colorretal. As famílias foram apurados a partir do departamento de genética clínica no Hospital Universitário Karolinska, em Estocolmo, na Suécia e foram consideradas negativas para Polyposis familiar e síndrome de Lynch. No total, 600 indivíduos foram genotipados usando de nucleotídeo único fichas de matriz polimorfismo. Parametric- e análises de ligação não paramétricos, foram computados utilizando MERLIN em todos e subconjuntos de famílias. Não houve resultado significativo foi visto, no entanto, houve HLODs positivos sugestivos acima de dois em análise de ligação paramétrica. Isto foi observado em um modelo recessivo para famílias de alto risco, em 9q31.1 loco (Hlod = 2,2, rs1338121) e para as famílias de risco moderado, no lócus Xp22.33 (LOD = 2,2 e Hlod = 2,5, rs2306737). Usando famílias com início precoce, a análise recessivo sugeriu um locus em 4p16.3 (LOD = 2,2, rs920683) e um no 17p13.2 (LOD /Hlod = 2,0, rs884250). Sem avaliação acima NPL dois foi observado para qualquer uma das famílias. Nosso estudo de ligação dado um apoio adicional para a região sugerido anteriormente no cromossomo 9 e sugeriu loci adicional a ser envolvidos no risco de câncer colorretal. Sequenciamento de genes nas regiões será feita em estudos futuros

Citation:. Kontham V, von Holst S, Lindblom A (2013) a análise de ligação em famílias Familial não-Lynch Syndrome Cancer Colorectal da Suécia. PLoS ONE 8 (12): e83936. doi: 10.1371 /journal.pone.0083936

editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de outubro de 2013; Aceito: 18 de novembro de 2013; Publicação: 11 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kontham et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro foi fornecido através do acordo regional sobre a formação médica e de pesquisa clínica (ALF) entre o Conselho do Condado de Estocolmo e Karolinska Institutet (20.110.483), o sueco Cancer Society (110.439), do Conselho de pesquisa sueco (20.103.543), a Fundação do Câncer Estocolmo (111.232) e Fundação Nilsson-Ehle. A plataforma de tecnologia SNP em Uppsala é suportado por Knut Alice Fundação Wallenberg através do Consórcio Wallenberg e da Universidade de Uppsala. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) está aumentando em incidência e é classificado como o segundo e terceiro tipo de câncer mais comum no mundo ocidental e na Suécia, respectivamente. CRC tem um risco de vida de 5% e afeta igualmente homens e mulheres. Um importante fator de risco é uma história familiar da doença e 20-25% de todos os casos de CRC têm um parente próximo com a mesma doença [1]. síndromes conhecidas, tais como polipose adenomatosa familiar (FAP) e síndrome de Lynch é responsável por menos de 5% dos casos de cancro colo-rectal [2], o que deixa a maioria dos casos de cancro colo-rectal familiar inexplicadas. A herança frequentemente sugere uma transmissão dominante da doença, mas a herança recessiva e até mesmo uma herança complexo ter sido sugerido [3]. A síndrome, familial CRC tipo X, tem sido sugerido para as famílias que preenchem os critérios para a síndrome de Lynch, mas sem mutações germinativas [4]. No entanto, as famílias negativos após diagnóstico síndrome de Lynch só raramente cumprir esses critérios rigorosos, principalmente porque um início mais tardio ou penetrância reduzida. Recentemente Genoma largas Estudos de associação (GWAS) foram utilizados para encontrar loci genético associado a um certo risco de desenvolver CRC. Estes loci; 6p21, 8q23.3, 8q24.21, 9p24, 10p14, 11q13.4, 11q23.1, 14q22.2, 15q13.3, 16q22.1, 18q21.1, 19q13.1 e 20p12.3, 1q41, 3q26. 2, 12q13.13, 20q13.33, Xp22.2 [5-14] podia para algum apoio grau a explicação do CRC como uma doença complexa. Historicamente, a análise de ligação tem sido uma ferramenta bem sucedida encontrar doença monogenic causando genes de câncer colorretal como APC [15], MSH2 [16] e MLH1 [17]. Também novas regiões candidatas para a existência adicional de moderada a alta penetrante loci CRC têm sido relatados em estudos de ligação, mas nenhuma mutação ocasional foi encontrado ainda. Os loci no cromossomo 9q [18-20], 3T [21,22] e 14q [23,24] foram relatados mais de uma vez. Um estudo anterior na neoplasia ligação serrilhada familiar sugeriu um locus no cromossoma 2q [25]. Recentemente, quatro loci diferentes com um Hlod significativa acima de 3; nos cromossomos 12q24 em todas as famílias de CRC, 4q21 no início onset-, 15q22.31 em high-risco e 8q13.2 em famílias de risco moderado foi sugerido [26]. O presente estudo realizado uma varredura de ligação genética genômicas (GWL), utilizando 600 indivíduos de 121 famílias CRC suecos e analisadas todas as famílias, no início onset-, de alto risco e famílias de risco moderado separadamente.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O estudo foi realizado de acordo com a legislação sueca da permissão ética e de acordo com a decisão da comissão de ética regional de Estocolmo (2008 /125-31,2). Todos os participantes leram e assinaram o consentimento para participar do estudo informou.

Os pacientes

As famílias foram apurados através do departamento de genética clínica no Hospital Universitário Karolinska, em Estocolmo, na Suécia entre 1990 e 2005. FAP foi excluídos usando registros médicos de indivíduos afetados e síndrome de Lynch foi excluído usando o nosso protocolo clínico atual [27]. As famílias foram incluídas no estudo se houvesse pelo menos dois parentes afectados informativa para análise de ligação, assim, pelo menos, um de pares de irmãos. Os detalhes sobre as famílias estão apresentados na tabela 1. famílias início precoce foram definidos como as famílias com uma média da idade de diagnóstico menos de 50, as famílias de alto risco foram definidos como as famílias com três ou mais afetados indivíduos em parentes próximos. famílias de risco moderado foram definidos como as famílias com dois ou mais irmãos afetados. Oito famílias preenchiam os critérios para o tipo CRC X [4] (dois sobreposto com famílias de início precoce), mas não foram analisados ​​separadamente

total

. 3 CRC

médios 50

Sibs única

No. families12127849Mean age64624866No. famílias com qualquer 5027886No. famílias com qualquer. 607221822Table 1. Descrição das famílias em análise de ligação

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A genotipagem

O DNA genômico foi extraído de sangue periférico utilizando procedimentos padrão. A genotipagem foi feito separadamente nos dois conjuntos diferentes de material de família. Genotipagem de 548 pacientes com 6090 marcadores foi realizada pelo ensaio Illumina Infinium [28,29] usando a análise de DNA chip de talão Illumina HumanLinkage-12. A reprodutibilidade global nos dados genótipo foi 99,996% com base em 6,25% de genotypings duplicados. A taxa média de chamadas por SNP foi 99,57%. Além disso, 52 indivíduos foram genotipados utilizando o ensaio Illumina Golden Gate [30] ea Illumina Linkage Painel IV-B (6008 marcadores). A reprodutibilidade global no genótipo de dados foi de 100% com base em 2,2% de genotypings duplicados. A taxa média de chamadas por SNP foi 97,27%. Arrays foram processados ​​de acordo com a fabrica protocolo na plataforma tecnológica SNP em Uppsala e está disponível mediante solicitação.

A análise de ligação

Pedcheck [31] foi usado para verificar a análise herança mendeliana inicial entre as famílias. O modelo genético de base familiar foi utilizado para análise de ligação paramétrica para todos os cromossomos, incluindo X. cromossomo como uma análise suplemento não paramétrico usando estatísticas Whittemore e Halpern NPL foi feito [32]. LOD, bem como dezenas de LOD heterogeneidade foram computados utilizando MERLIN (versão 1.1.2) [33] e foi dado para todas as posições genotipados. As análises foram feitas assumindo traços tanto dominantes e recessivos. Para o modo autossômico dominante e recessivo de herança a frequência alelo da doença foi definido para 0,0001. As taxas de penetrância para o modo dominante e recessivo de herança para homozigoto normal, heterozigotos e homozigotos afetados foram de 0,05, 0,80, 0,80 e 0,001, 0,001, 1,0, respectivamente.

Indivíduos com câncer colorretal ou um pólipo com alta displasia grau foram codificadas como afetados. Os membros da família com status incerto foram codificados como desconhecido. Famílias foram apurados assumindo um traço dominante e cônjuges foram, portanto, codificada como não afetada. Quatro diferentes análises foram realizadas utilizando diferentes conjuntos de famílias e pacientes; todas as famílias, todas as famílias com pelo menos três casos (de alto risco), todas as famílias com CRC entre irmãos (de risco moderado) e famílias com uma média de idade inferior a 50 (precoce) para ser comparável com os resultados da ligação recente estudo realizado por Cicek et al.

todas as 121 famílias, incluindo todos os assuntos de ambas as sessões de genotipagem, foram utilizados para a análise de ligação. Assim, dois ficheiros de marcadores foram fundidos e 7256 marcadores foram utilizados na análise. Merlin por padrão permite um máximo de 24 bits para cada família, por quatro grandes famílias teve de ser dividida. As famílias foram divididas de modo que cada sub-família usou um ancestral comum e colocada dentro do limite como definido durante a execução do programa. Os 121 famílias originais foram analisados ​​como 126 (uma família teve que ser dividido em três).

Desde presença de desequilíbrio de ligação (LD) pode inflar as estatísticas de ligação multiponto, um limiar de r

2 = 0,1 foi usado para evitar que os resultados falsos positivos inflar as estatísticas [34]. LD entre os SNPs com r

2 0,1 foi contabilizada, por MERLIN organizar os marcadores em clusters. MERLIN faz uso das frequências de haplótipos população a assumir LD dentro de cada cluster. Para manter a uniformidade nos subconjuntos de estudo, os mesmos grupos foram continuamente utilizado em todas as análises.

Resultados

Um total de 600 indivíduos de 121 famílias foram genotipados com sucesso. As análises foram realizadas para todos e cada um dos três subgrupos diferentes; De alto risco, de risco moderado e famílias de início precoce (tabela 1). Não havia nenhum indivíduo estatisticamente significativa (superior a três) pontuação LOD Hlod ou em qualquer das análises (Figura 1). No entanto, houve dois HLODs positivos acima (Tabela 2).

a) Lote de HLODs para todas as famílias no estudo, os modelos dominantes (em vermelho) e recessiva (em azul) (n = 121).

b) LOD /Hlod lote de estudo grupo com mais de 3 indivíduos afetados (n = 27)

c) LOD /lote Hlod do grupo de estudo com idade média de diagnóstico 50 (n = 8).

d) LOD /lote Hlod do grupo de estudo com irmãos afetados (n = 49).

* valores -negative de pontuação não são plotados mostrado.

Para B, C, d – LODs são representados em vermelho, HLODs são representados em Cyan

Estudo Grupo

No.. Das famílias

referenciados Região de cM, SNP

Modelo

Hlod (α)

Todos families121 —- Mais de 3 affected279q31.1102.68, RS1338121Recessive2.212 (0,66) A média de idade no momento do diagnóstico 5084p16.37.17, RS920683Recessive2.184 (1,00) 17p13.211.51, RS884250Recessive2.086 (1,00) Famílias com Sibs49Xp22.337.42 afetado RS2306737Recessive2.486 (0,79) Tabela 2. Resumo das colorretais resultados de ligação do cancro com HLODs máximas observadas superior a 2.

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Para as famílias de alto risco (no total 27 famílias) um locus no cromossoma 9q31.1, mostrou um Hlod acima de dois assumindo herança recessiva e uma estimativa de 66% das famílias ligadas (tabela 2). Máximo foi para o rs1338121 marcador com um Hlod de 2,2. LOD no mesmo lugar em modelo recessivo foi de 0,7. Para a doença dominante neste locus mostrou um escore LOD de 1,4 e um Hlod de 1,6.

Para as famílias de risco moderado (no total 49 famílias, analisada como 50) um locus na ponta do cromossomo Xp tinha LOD e Hlod acima de dois com o máximo de 2,2 e 2,5, respectivamente, para os rs2306737 marcador em análise recessivo ( mesa 2). pontuação LOD e Hlod para análise dominante foram 1.8.

Finalmente, para o grupo de famílias com início precoce (apenas 8 famílias) dois loci apresentaram escores LOD positivos e HLODs acima de dois em análise recessivo (tabela 2). Um era distal no cromossomo 4p com um LOD máximo e Hlod de 2,2 para rs920683 eo outro estava em 17p13.2 cromossomo com um LOD máximo e Hlod de 2,0 para rs884250. O LOD e Hlod para análise dominante era 0,976 no cromossomo 4p e 1,25 em 17p13.2 cromossomo. Os limites de determinação foram similares em paramétrica e análise não paramétrica e 100% ligados famílias foram assumidos por ambos os loci.

Sem avaliação dos NPL acima de dois foi observada para qualquer uma das famílias. HLODs 2 acima são apresentados na tabela 2. Todos os loci com um Hlod 1,0 na análise paramétrica são mostrados na Tabela 3.

Grupo de Estudo

No. Das Famílias e região Linked

cM, SNP

Modelo

Hlod (α)

Todos Families1211q32.1204.36, RS2032018Dominant1.191 (0,46) 5p15.233.99, RS879253Dominant1.258 (0,48) 9q22. 3197,96, RS4534181Dominant1.602 (0,59) 94,37, RS7037744Recessive1.632 (0,32) Xp11.2179.25, RS2015312Dominant1.414 (0,72) 4p16.32.97, RS736455Recessive1.653 (0,38) 6p21.164.36, RS722269Recessive1.892 (0,28) 8p2233.01, RS334206Recessive1.479 (0,26) 18p11.2140.13, RS1043925Recessive1.351 (0,27) Mais de 3 affected271q32.2211.46, RS1507765Dominant1.414 (0,61) 2p16.277.83, RS1483869Dominant1.438 (0,60) 4q28.3134.94, RS426029Dominant1.045 (0,54) 5p15 .134.80, RS1505034Dominant1.678 (0,71) 9q31.1102.68, RS1338121Dominant1.672 (0,79) 12q13.1263.98, RS7532Dominant1.086 (0,51) 16q12.265.68, RS1990637Dominant1.556 (0,77) Xp11.2179.24, RS1560514Dominant1.788 (1,00) 1q25 .2178.47, RS227530Recessive1.554 (0,55) 4p16.32.97, RS736455Recessive1.903 (0,68) 18p11.2140.13, RS1043925Recessive1.605 (0,48) Xp11.367.42, RS1137070Recessive1.267 (0,56) a média de idade no momento do diagnóstico 5082p16.374.90, RS1394207Dominant1.145 (1,00) 9p21.345.61, RS10757309Dominant1.614 (1,00) 10q22.186.06, RS1227938Dominant1.200 (1,00) 16q2180.78, RS17822576Dominant1.181 (1,00) 17p13.124.87, RS1391766Dominant1.258 (1,00) 1p3372.10, RS1934405Recessive1.244 (1,00) 6p21.167.58, RS4714772Recessive1.335 (1,00) 9p21.345.61, RS10757309Recessive1.501 (1,00) 10q26.3166.39, RS7072831Recessive1.239 (0,90) 18q11.242.92, RS12959039Recessive1.279 (1,00) famílias com Afectado Sibs494p15.238.72, RS216113Dominant1.112 (0,96) 6q23.3136.59, RS975676Dominant1.848 (1,00) Xp22.3311.69, RS749706Dominant1.860 (1,00) 6q14.191.67, RS885582Recessive1.241 (0,33) 12q23.1107.90, RS17290272Recessive1.034 (0,26) 14q24.378.12, RS888412Recessive1.032 (0,29) 20q13.3193.25, RS186659Recessive1.410 (0,37) Tabela 3. Resumo das colorretais resultados de ligação do câncer com HLODs máximas observadas entre 1 e 2.

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discussão

Nós usamos SNP genotipagem para executar uma análise de ligação em 121 famílias CRC e não encontrar quaisquer resultados globais estatisticamente significativos com uma LOD ou Hlod mais de 3. algumas famílias grandes foram divididas para ser capaz de usar MERLIN, e perdeu um pouco de seu poder na análise. O efeito desta foi de pouca importância.

No entanto, conseguimos encontrar LODs e HLODs acima de 2, sugestivos de ligação. Um estudo de ligação anterior usou 356 famílias e mostrou um locus com Hlod 3 (12q) e 4 com Hlod 2 (nos cromossomos 4T, 15q, 17q e 12q), todos na análise dominante [26]. Nós não encontrou apoio para qualquer uma destas regiões em nossa análise.

Em nossa sub-estudo de famílias grandes, de alto risco (mais de três affecteds), foi encontrado um local no cromossomo 9q31. A mesma região foi sugerido antes, embora em modelos dominantes, e foi aqui novamente identificados por nós utilizando análise de ligação em um modelo recessivo. Este lugar foi previamente sugerido por um estudo de pares de irmãos e um estudo utilizando ligação em muitos parentes e também previamente por nós em uma grande família com câncer e adenomas rectal [18-20]. Esses três estudos utilizaram microssatélites para genotipagem, enquanto estudos de ligação anteriores usando SNPs eram incapazes de replicar o locus [18,26,35]. Um estudo também mostrou apoio para a região utilizando um haplótipo de cinco SNP na região [36]. Dois genes têm sido até agora sugerida como os genes que predispõem para esta região. Em primeiro lugar, foi sugerido que a expressão específica de alelo da linha germinal resulta na expressão reduzida do gene mediada alterando-SMAD sinalização de TGF-beta [37]. Em segundo lugar, um estudo do gene GALNT12 demonstrado truncando mutações somáticas e da linha germinativa em pacientes com CCR, mas nenhum dos controles e defeitos genéticos na via de O-glicosilação em parte subjacente glicosilação aberrante, e, assim, contribuir para o desenvolvimento de um subconjunto de CRC [38] . A região sugerido pelo nosso presente estudo sobrepõe bem com a região sugerida por uma família antes [19]. A região se estende ao longo de quase 9 Mb e inclui os genes acima mencionados e numerosos outros. Quatro famílias contribuem principalmente para a pontuação positiva, dominantes e recessivos Hlod. Apenas uma família tinham doença de início precoce. O estudo Cicek definido para um grupo similar de 67 famílias, um loco com Hlod 3 (15q) e 4 com Hlod 2 (cromossomos 12q, 14q, 17q e XP) alguns usando modelo dominante ou recessivo (cromossomo 14). Nós não encontrou apoio para qualquer uma dessas regiões do nosso estudo. No entanto, tivemos um Hlod 1 perto da região do cromossomo X.

Para as famílias de risco moderado, com a SIBS afetadas somente, uma região na ponta do cromossomo X foi sugerida em modelo recessivo (max Hlod = 2,2) e semelhante ao cromossomo 9 lócus há também foi positivo, mas menor LOD usando um modelo dominante (0,7). Esta região é quase 6 Mb, não foi sugerido antes e contém numerosos genes candidatos. O estudo Cicek incluiu 200 famílias de risco moderado e também usando modelo recessivo eles identificaram um locus com uma Hlod 3 (8q) e 4 loci com um Hlod 2 (cromossomos 1T, 6p, 8q e 22q). Nós não conseguimos encontrar suporte para qualquer um desses loci.

Finalmente observamos usando um recessivo modelo de dois loci com HLODs elevadas (4p e 17p) para as famílias de início precoce. No entanto, este grupo era composto por apenas 8 famílias. Família 8 também estava entre as famílias de alto risco ligados ao cromossomo 9 lócus e para este tamanho de família espera-se que um estudo genoma inteiro deve gerar a ligação a muitas regiões e, portanto, maior será falsos positivos. Nós não poderíamos replicar qualquer um dos loci de Cicek et al. utilizando o modelo dominante ou recessivo (cromossomos 4T, 14q, 15q e 22q).

Um estudo anterior com foco em adenoma e adenoma colorretal e carcinoma encontrada ligação para cromossômica regiões nos cromossomos 18q21 e 2p22 em 69 famílias, enquanto a sub- análise de 55 famílias com câncer só mostrou ligação ao cromossoma 3q21-24 [21]. Nenhuma destas regiões foram confirmadas pelo estudo Cicek ou por este estudo. É surpreendente que 4 estudos de ligação incluindo este, todos usando SNP-marcadores, não geram qualquer loci sobreposição [21,26,35]. Existem várias diferenças entre os estudos porém, que são possíveis explicações para esta discrepância. A etnia dos indivíduos nos estudos é diferente, um estudo é de EUA, um é do Netherland do, um do Reino Unido e nosso estudo é baseado na população sueca. Os tamanhos de amostra também são diferentes, o estudo norte-americano tem um total de 356 famílias, os holandeses apenas sete família numerosa, o estudo UK 69 e nossas famílias estudo 121. O processo de recrutamento também diferiram entre todos os quatro estudos, mas em geral a maioria dos diferentes resultados pode ser explicada também pela biologia e diferentes elementos predisponentes em cada conjuntos de amostras. experiências futuras precisam considerar essa heterogeneidade na sua concepção.

Um pouco para nossa surpresa, poderíamos ver também LOD-scores paramétricos positivos neste estudo em relação aos nossos anteriores [22,23], onde foram obtidos apenas HLODs. Isto pode estar relacionado com o facto de que foi utilizado em vez de SNPs microssatélites neste estudo. Os microssatélites são muito mais informativo e, portanto, muitas vezes muito baixos LODs negativas são vistos quando uma família não está ligada. Nesta experiência orientada SNP poucas famílias tinham LODs abaixo de -2 e, assim, o poder de excluir ligação em nosso experimento foi baixa. No entanto, o poder de detectar ligação foi retida (que foi testado usando a família 24, com um LOD de 3 para o cromossoma 9 lócus) [19]. O resultado também pode estar relacionada com o fato de que as famílias neste estudo foram menores em comparação com os nossos estudos anteriores usando 20 e 30 grandes pedigrees [22,23]. Aqui usamos uma estratégia diferente com 121 famílias menores e em contraste com os nossos estudos de ligação anteriores poderíamos encontrar apoio para a região do candidato no cromossomo 9. Nós utilizado anteriormente SimWalk2 para análise de ligação com marcadores microssatélites, mas não foi propício para a análise de dados de SNP . Para justificar o uso MERLIN, analisamos a família 24 e cromossomo 9 usando SimWalk2 (dados não mostrados), que levou três semanas para ser concluído, mas obteve resultados idênticos.

Em conclusão, nosso estudo de ligação fornecido apoio adicional para a região do cromossomo 9, algumas evidências para novos loci de estar envolvido no risco de câncer colorretal e não há suporte para outros estudos previamente relatados loci. Isto sugeriu heterogeneidade se familial CRC deve influenciar a concepção de futuros estudos de associação e de ligação.

Reconhecimentos

A genotipagem foi realizada pela Plataforma SNP Tecnologia em Uppsala, (www.genotyping.se). Suporte por Bioinformatics infra-estrutura para as Ciências da Vida (BILS) é reconhecido agradecimento.