Abstract

O antígeno (PSA) teste específico da próstata no soro tem uma alta taxa de falsos positivos. Como um único marcador, PSA fornece informações de diagnóstico limitado. Um ensaio de multi-marcador capaz de detectar não só os tumores, mas também aqueles potencialmente letais fornece uma necessidade clínica não satisfeita. Usando o sistema de expressão do gene nanoString nCounter, um teste de multiplex 20-gene foi desenvolvido com base na contagem de genes digitais de transcritos de ARN na urina como um meio para detectar o cancro da próstata. Neste teste, é anulado urina centrifugada para sedimentar as células e o RNA purificado é amplificado por hibridação com sondas pré-seleccionados. A amplificação do RNA linha de células de teste apareceu não introduzir viés significativo, e as contagens bem combinadas com os níveis de abundância gene como medido por microarranjos de DNA. Para análise de dados, as contagens individuais foram comparadas com a de microglobulina β2, um gene de manutenção. As amostras de urina de 5 casos de pré-operatórias e 2 não-câncer foram analisados. Patologia informação foi então recuperado. Sinais para a maioria dos genes foram baixas para não-câncer e baixa pontuação de Gleason, e 6/6 marcadores conhecidos de câncer de próstata foram positivos nos casos. Um caso de Gleason 4 + 5 mostrou, em contrapartida, sinais fortes para todos os marcadores associados a cancro, incluindo CD24. Um não-câncer também mostrou sinais para todos os marcadores de câncer 6, e este homem pode abrigar um câncer não diagnosticado. Este teste multiplex ensaiar um produto residual natural pode potencialmente ser utilizados para o rastreio, a detecção precoce do câncer e estratificação paciente. Informações de diagnóstico é obtido a partir das assinaturas de ARN que estão associados a tipos de células de tumores de próstata

Citation:. Quek SI, Ho ME, Loprieno MA, Ellis WJ, Elliott N, Liu AY (2012) A Multiplex Ensaio para Meça RNA transcrições de câncer de próstata na urina. PLoS ONE 7 (9): e45656. doi: 10.1371 /journal.pone.0045656

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 de junho de 2012; Aceito: 21 de agosto de 2012; Publicação: 20 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Quek et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer – Early Detection Research Network (NCI EDRN) CA111244 concessão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores gostariam de declarar a filiação de um dos co-autores, Nathan Elliott, para a empresa comercial nanoString Technologies. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Com o envelhecimento da população, o número de casos de câncer de próstata irá aumentar dramaticamente na próxima Duas décadas. O teste de PSA no soro é utilizado para monitorar os homens para o cancro da próstata e muitos tumores foram detectados precocemente através do seu uso. No entanto, quase ¾ homens com PSA anormal vir a ser negativo para câncer sobre biópsia [1]. Assim, muitas das biópsias realizadas são desnecessárias. Além disso, alguns casos de câncer não são detectadas pela PSA. Enquanto PSA é produzido pela abundância da próstata não é específico do cancro, embora formas moleculares de PSA, tais como [-2] proPSA parecem mostrar melhor desempenho [2]. Outros marcadores são necessários para o diagnóstico de câncer definitiva. Além disso, marcadores são necessários para diferenciar tipos de cancro da próstata que pode ser letal daquelas que não estão. Um ensaio de multi-marcador é necessária. A tecnologia nanoString nCounter pode medir diretamente várias transcrições de RNA em biospecimens, ea leitura é digital na contagem de genes [3]. No sistema nCounter, duas sondas de oligonucleótidos são desenhados para cada um dos alvos de transcrição: um conjugado com biotina e o outro código de cores com combinações de moléculas de corante. Após a hibridação solução, as transcrições capturados são imobilizados sobre uma superfície revestida com estreptavidina, alinhados num campo eléctrico, e identificados pelos respectivos códigos de cores individuais. Os códigos são contadas com um dispositivo de microscópio /câmara e tabulados no Excel. Por razões técnicas, o número máximo de genes que podem ser analisadas em cada corrida é logo abaixo 800. A tecnologia tem uma eficiência de amostragem de ~ 1% (ou seja, 1.800 moléculas produzidas 25 contagens), uma faixa de sinal de -25 a 50.000 contagens, e boa reprodutibilidade [3].

o nosso objectivo é desenvolver esta tecnologia nanoString para a detecção do câncer de próstata através da análise de urina anulada desde a próstata é drenada pelo trato urinário. Vários tipos de células, incluindo os doentes pode ser derramado ou liberado a partir de órgãos ao longo deste trato. Para as sondas nCounter, genes informativos câncer de próstata foram identificados através da análise do transcriptoma de células epiteliais câncer e tipos de células do estroma associados ao câncer contra a sua respectiva contraparte não-câncer. Até à data, os tipos de células relevantes incluídas Gleason 3 CD26 células

+ cancerosas, Gleason 4 CD26

+ células cancerosas, CD90 + células estromais associadas a cancro

contrastar com CD26

+ células luminais e CD49a

+ células estromais [4], [5]. genes marcadores selecionados foram incorporados à biblioteca sonda cancro da próstata nanoString para produzir o nCounter codeset. coleta de urina representa a rota menos invasiva de obtenção de material de teste, e sendo um produto de resíduos, várias amostras podem ser convenientemente recolhido, sem risco ou estresse para os pacientes. Uma vez que os tipos de células de tumores tem a expressão do gene distinto, a sua assinatura gene não deve estar presente em não-cancro saudável. Há também a possibilidade de que, devido à histoarquitetura anormal de tumores, cancros, bem como células associadas a cancro são mais susceptíveis de ser libertados para a urina do que as células em condições normais, especialmente em casos em que a matriz extracelular está a ser destruídos pelo tumor-derivada metaloproteinases.

o teste de urina da Gen-Probe de PCA3 é actualmente uma base na presença de células cancerosas na urina para o diagnóstico da doença [6]. Ele mede um RNA não-codificante (PCA3) através de captura de alvo e amplificação, detecção de sonda quimioluminescente com leitura em unidades relativas de luz. Uma avaliação multicêntrico do teste mostrou desempenho analítico aceitável e uma classificação de sujeito correto (cancro

vs

. Biópsia negativa) de pouco menos de 70% [7]. Como um marcador de prognóstico, PCA3 não mostrou uma relação significativa com o escore de Gleason, o volume do tumor, estágio, com base em 70 casos [8]. Outro estudo relatou um link para essas características clinicopatológicas [9]. marcadores adicionais podem ser incluídos usando amplificação toda transcriptoma seguido de reacção em cadeia da polimerase (PCR) [10]. Três outros marcadores (PSMA, HPN, GALNT3) mais de PCA3, por exemplo, podia distinguir do cancro de benigno a 100% em um relatório [11]. Multiplex PCR, no entanto, não é uma tecnologia robusta e pesado para executar num ambiente de alto rendimento. A tecnologia nCounter não só fornece capacidade de análise multi-marcador, mas também a facilidade de uso. Payton

et al

. [12] descreveram a aplicação de nCounter para medir a abundância de ARN de leucemia mielóide aguda. Nosso desenvolvimento de um teste multiplex (PCA3 além de outros marcadores) é motivada por testes semelhantes oferecidos aos pacientes com câncer de mama para a estratificação [13].

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pela Universidade de Washington Institutional Review Board. amostras de urina anulado e excesso de amostras de tecido de cirurgias foram coletadas de doadores com consentimento por escrito.

conjunto de sondas Seleção

As sondas nCounter foram concebidos e sintetizados por nanoString Technologies [3]. De acordo com o desenho nanoString conjunto de códigos, cada par de sonda foi feita complementar a uma região de base 100, do RNA alvo. A sonda de captura foi conjugada com biotina para a imobilização sobre uma placa revestida com estreptavidina, após a hibridação, e a sonda repórter com uma etiqueta de código de cores para a detecção de sinal. Vinte genes marcadores foram seleccionados (Tabela 1). Destes, seis foram os genes relatados por vários grupos para mostrar a expressão aumentada no cancro da próstata: AGR2 (gradiente anterior 2) [14], AMACR (α-methylacyl-CoA-racemase) [15], CRISP3 (proteína de secreção rica em cisteína 3 ) [16], HPN (hepsina) [17], PCA3 [18], e ERG (

v

-ets eritroblastose vírus E26 homólogo oncogene, activado como resultado da fusão do gene ao regulada por androgénio

TMPRSS2

) [19]. B2M (microglobulina β2) foi utilizado como controlo para a qualidade e quantidade de ARN. BRE (cérebro e reprodutiva modulador TNFRSF1A expressa ao órgão), IL24, CCL3 [quimiocina (C-C motif) ligando 3, macrófagos proteína inflamatória 1 subunidade MIP1α] foram detectados como up-regulamentado genes em células cancerosas da próstata [4]. ACPP (fosfatase ácida prostática), AZGP1 (zinco α2-glicoproteína 1), KLK2 [(hK2) e KLK3], ANPEP (aminopeptidase alanilo, CD13), CD24, CD9, DPP4 (dipeptidil-peptidase 4, CD26), MME (membrana metalo-endopeptidase, CD10) foram incluídos como genes celulares luminal da próstata com expressão diferencial entre o cancro e de não-cancro [20]. CD90v (variante CD90 BAD92446, e CD90 /THY1) foi incluído para células estromais associadas a cancro [5], [21], e UPK3A (uroplakin 3A) para as células da bexiga [22].

Prostate linhas celulares de cancro

O linhas celulares de cancro da próstata PC3, C4-2, e C4-2B foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%. Os transcriptomes de PC3 e C4-2 foram relatados anteriormente [23]. C4-2B foi derivado de C4-2 de crescimento no (mouse) osso [24]. PC3 e C4-2 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). C4-2B [25] foi gentilmente fornecido pelo Dr. Robert Vessella no departamento de urologia.

A tabela mostra as contagens de genes normalizados de uma série de diluição de 10.000, 1.000, 100, 10, 1 (3x), as células de PC3

vs

. C4-2. Os genes listados na primeira coluna. A exibição de consulta do conjunto de dados para níveis destes genes em C4-2 e PC3 expressão é mostrado à direita.

Colheita de urina e Processamento

amostras de urina anulados foram coletadas de doadores. Nenhuma preparação especial pré-coleção foi exigido dos pacientes. Dentro de 2 h, a urina (20 a 100 ml) foi vertida a partir de frascos de recolha em tubos cónicos estéreis de 50 mL e centrifugou-se a 1500 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi guardado (por análise de proteínas); o sedimento foi ressuspenso em urina residual e transferidos para 1,5 ml por tubos Eppendorf de 1 min numa microcentrif uga à velocidade máxima. Não mais de 10 ul de tampão de RLT (Qiagen, Valencia, CA) contendo 1% β-mercaptoetanol foi adicionado. Os lisados ​​celulares foram armazenadas a -80 ° C até à análise (ou RNA de hibridação e amplificação extracção nCounter).

É mostrada formato Excel de dados sem amplificação de nCounter

vs.

Amplificado (marcado por * ) de ARN de células C4-2B e PC3. POS e NEG são sondas de controlo. contagens de B. sinal obtido a partir unamplified

vs

. amplificado (marcados com *) são comparados na visualização do histograma. contagem de genes para B2M é fixada em 100 e todas as outras contagens de genes são comparados com a de B2M a partir da mesma amostra. genes de nota com expressão ausente não foram amplificados.

RNA extração e amplificação

RNA A urina foi preparado com RNAqueous Micro (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA). Resumidamente, 90 uL de Solução de Lise foi adicionado aos 10 ul lisados ​​celulares com mistura vigorosa. Cinquenta ul de etanol foi então adicionado, e a mistura foi carregada numa micro-filtro de montagem de cartucho. O cartucho foi lavado, e o ARN foi eluído em 2 × 8 ul de solução de eluição pré-aquecido. Dependendo da concentração de ARN, 3-5 ul do ARN eluído (30-50 ng) foi utilizado para a amplificação de ARN utilizando ARN-sentido RiboMultiplier Amplificação (Epicentre, Ilumina, Madison, WI). A síntese da primeira cadeia de ADNc, a marcação terminal de oligómero, a síntese da segunda cadeia de ADNc,

In vitro

transcrição de ARN senso e a digestão com DNase I foram realizados seguindo o protocolo do fabricante num termociclador. ARN amplificado foi purificado utilizando RNeasy Mini (Qiagen) e ressuspenso em 30 ul de água isenta de RNase. ARN a partir de linhas celulares foi preparado com RNeasy Mini.

NanoString nCounter hibridação e Apresentação do Gene contagens

Sonda de hibridação foi realizada com 4-5 jul de lisados ​​celulares ou RNA 100-2,000 ng de 18 h em uma máquina nCounter automatizado. Todos os genes no nCounter codeset foram analisadas simultaneamente no verdadeiro estilo multiplex. contagens brutas foram primeiro normalizados utilizando a média de seis sondas de controlo interno pico-in positivos para todas as amostras para explicar as diferenças sistemáticas entre ensaios. Estas contagens de controlo normalizada foram, em seguida, em comparação com o nível de expressão de B2M (fixado em 100 por conveniência). Para a apresentação de dados, cada contagem gene foi indicado em relação ao de B2M multiplicando um factor de 100 /(contagem gene B2M). Os dados nCounter foram obtidas antes patologia do câncer foi recuperada, isto é, cego para pontuação de Gleason e estágio dos tumores. Estas características de patologia foram atribuídas aos números de casos na seção de resultados.

A comparação dos valores dos sinais brutos obtidos para (a) PC3 e (b) C4-2 /​​C4-2B células são mostrados. O painel inferior (c) mostra a comparação de fold-change calculada a partir dos valores dos dados obtidos.

Imunohistoquímica

5 mícrons cortes congelados série de tumores foram processados ​​para a imunocoloração com anticorpos para agrupar designação antigénios (CD) da superfície celular ou outros marcadores, como descrito [20]. anticorpo monoclonal contra CD24 (clone ML5, 01:50) foi obtido a partir de BD Pharmingen (San Diego, CA), anticorpo monoclonal para CCL3 (4E7 clone, 01:50) foi de Abnova (Taiwan), e o anticorpo a AGR2 (clone P1G4 , 01:50) foi produzido no nosso laboratório [26]. As seções imunomarcadas foram fotografadas com a Olympus BX41 (Melville, NY), equipado com câmera digital MicroFire (Optronics, Goleta, CA). As imagens foram processadas com o Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA).

O indicador de dados de histograma mostra a contagem de sinal para P08-022N (azul) e P08-027N (magenta). As altas contagens de B2M foram excluídos para a exibição de dados. P08-022N não mostra sinais para os marcadores de câncer. Em contraste, P08-027N mostra contagens para estes marcadores.

Resultados

Limite de Detecção

RNA a partir de uma série de diluições de linhas de câncer de próstata C4-2 e PC3 foi preparado, e hibridado com uma biblioteca sonda de seis genes selecionados: KLK3, CD90 /Thy1, AGR2, HPN, PCA3, UPK3A. As contagens em bruto foram normalizados, e os dados foram analisados ​​por ferramentas de software estatístico nanoString. As contagens de fundo foram encontrados para ser 15 e o limite de sensibilidade foi ~20-30 células com base em um gene abundantemente expresso como KLK3 em C4-2 (Fig. 1). As contagens estavam de acordo com o número de células: 22.100 KLK3 contagens para 10.000 células; 2.400 contagens para 1.000; 290 contagens para 100. Numa base por célula, C4-2 mostrou uma assinatura de 2,21 KLK3, 0,06 HPN, 0,01 UPK3A, THY1 0, 0 AGR2, 0 PCA3, enquanto PC3 mostraram uma assinatura de 0 KLK3, 0 HPN, 0 UPK3A , 0 THY1, 0,005 AGR2, 0 PCA3. A assinatura para C4-2 também pode ser expressa em razões para o menor número de contagem: 220 KLK3, 6 HPN, 1 UPK3A. A expressão correspondente ao obtido por análise de DNA microarray.

As contagens de sinal para P08-024pre (Gleason 3 + 3), P08-029pre (Gleason 3 + 3, T2c), P08-025pre (Gleason 3+ 4), e P08-046pre (Gleason 3 + 4, T2c) são comparados com aqueles de P08-022N. Observe não apenas os marcadores de câncer, mas também os sinais de marcadores luminais próstata produzidos (células cancerosas também produzem estes marcadores). B. Duas seções seriadas de amostras de tumor 08-052A foram coradas para CCL3 e expressão AGR2. Ampliação é 100x.

Gene Expression perfil foi preservada com RNA amplificação

Para avaliar a amplificação de RNA, PC3 e C4-2B RNA foram amplificados e os produtos resultantes hibridado com a nCounter 20- gene codeset: ACPP, AGR2, AMACR, ANPEP, AZGP1, B2M, CD90v, BRE, CCL3, CD24, CD9, CRISP3, DPP4, ERG, HPN, IL24, KLK2, MME, PCA3, UPK3A. FIG. 2A mostra os dados de contagem de ARN obtidos em formato Excel. As contagens de sinal (a partir de ARN de entrada ~2,000 ng) entre o material não amplificado e amplificado foram comparativamente equivalente para estes marcadores (Fig. 2B). A abundância relativa também foi mantida. Uma tendência notável não foi visto por qualquer transcrição. Por exemplo, 2.000 ng C4-2B RNA produziu 151,027 contagens para B2M, 200 ng produziu 13,335 contagens, e 1.700 ng amplificado RNA produziu 120,849 contagens; para AMACR, as mesmas quantidades de RNA produzido 114,542 contagens, 12.095 contagens, e 69,311 contagens respectivamente. O resultado mais significativo foi que genes não-expressos (contagens 25-30) não foram detectados, por exemplo, o CD90v gene de células do estroma: 40 contagens, 2 contagens, e 36 contagens, e IL24:23 contagens, 3 crimes , 26 contagens, respectivamente, para os três quantidades de RNA.

A exibição de dados mostra a contagem alta de sinais obtidos, especialmente a de CD24. B. CD24 imunohistoquímica mostra células cancerosas fortemente coradas em amostras tumorais 01-009E e 02-034A. Ampliação é 40x.

A concordância entre nCounter e DNA Microarray Profiling

PC3

vs

. PC3 sem diferença esperado e C4-2B

vs

. C4-2 com algumas diferenças foram propositadamente escolhidos para comparação. Para PC3, uma concordância forte (Pearson

R

= 0,78, a Fig. 3) nos níveis de expressão do gene entre as contagens e valores de sinal de painel foi encontrada. Uma correlação mais baixa (

R

= 0,68) entre C4-2B e C4-2 poderia ser atribuída aos poucos genes diferencialmente expressos entre os dois, por exemplo, C4-2B foi positivo para AGR2 e não C4-2. No geral, a expressão dobrar diferença dos 20 genes em PC3

vs

. C4-2B /C4-2 mostrou uma correlação de

r

= 0,77. Assim, nCounter poderia produzir um perfil preciso dos genes expressos e sua abundância em determinados tipos de células.

Urina RNA Assinatura do Non-cancer

O primeiro grupo de amostras de urina anuladas foram coletadas de voluntários de laboratório . Os dados experimentais (não mostrados) demonstraram que 1) a preparação da amostra era adequada na medida em que não havia nenhuma degradação significativa de ARN, tal como indicado pelos sinais de controlo em cravado-nanoString nas amostras; 2) maior volume de urina não produzirá necessariamente mais células; 3) Os sinais foram geralmente baixas sem amplificação de ARN; 4) sangue na urina produzida leituras espúrias. Além disso, a colocação de células de cancro da próstata PC3 e C4-2 na urina durante 6 h produziu nenhuma diminuição significativa na contagem de sinal (dados não mostrados).

usando a amplificação de RNA, uma segunda coorte de espécimes [obtido sem digital rectal exame (DRE)] foram testados: P08-022N, P08-027N de homens sem diagnóstico prévio de câncer, que visitou a consciência do cancro da próstata da UW; P08-023, P08-024, P08-025, P08-029, P08-046 de pacientes pré-op (operatória) cancerosas. Usando um formato de histograma para a exibição de dados, todas as contagens de sinal para os genes do cancro da próstata foram selecionados pelo fundo para P08-022N: AGR2 = 0,08 [(8 crimes, em relação ao B2M = 100 (10.000 contagens)], AMACR = 0,46, CD90v = 0,02, CRISP3 = 0,25, ERG = 0,1, HPN = 0,04, PCA3 = 0,09 (Fig. 4, as entradas de dados em azul). Houve também pouca representação da próstata células (secreção) na urina como inferido a partir ACPP = 0,2, AZGP1 = 0,14, KLK2 = 0,06.

Esta exibição de dados composto ilustra a diferença entre a pontuação de Gleason (contagens de B2M estão incluídos).

a N caso suspeito

P08-027N (54 anos), em contraste, exibido uma assinatura cancer-like:. AGR2 = 0,61 (61 pontos), AMACR = 2,33, CRISP = 11,21, ERG = 0,76, HPN = 0,34, PCA3 = 0,53 (Fig 4, entradas de dados em magenta), em comparação com a assinatura não-câncer do P08-022N. com 6/6 marcadores conhecidos de câncer de próstata marcando acima do fundo, uma boa probabilidade de que o doador estava abrigando um tumor não diagnosticado. Além disso, o câncer de up-regulamentados CD24 era a 7,98. Houve também maior contagem para os genes da próstata: ACPP = 1,4, AZGP1 = 0,91, KLK2 = 1,25

Assinaturas para casos

Lower Gleason

Os sinais de contagem obtida com P08-024pre (Gleason 3. +3; PSA = 9,3), P08-029pre (Gleason 3 + 3; T2c; PSA = 3,6; volume do tumor = 0,6 cc), P08-025pre (Gleason 3 + 4; T2c; PSA = 7; volume do tumor = 5 cc ), e P08-046pre (Gleason 3 + 4; T2c; PSA = 26; volume tumoral = 5 cc), em comparação com os de cancro P08-022N não são mostrados na Fig. 5A. P08-024pre mostrou AGR2 = 0,67, AMACR = 1,73, CRISP3 = 1,11, ERG = 0,91, HPN = 0,38, PCA3 = 0,59 e P08-046pre mostrou AGR2 = 0,52, AMACR = 1,21, CRISP3 = 2,03, ERG = 0,66, HPN = 0,21, PCA3 = 0,81. Estas contagens de genes para os seis marcadores de câncer foram 3 vezes acima do fundo conta em P08-022N não-câncer. IL24 (0,80 e 0,43, respectivamente) foi encontrado sobre-regulada no cancro [4]. O aumento em CCL3 (3,69 e 3,08, respectivamente) pode indicar a presença de células tumorais G4 como CCL3 era um dos genes regulados positivamente no G4

vs. células tumorais G3 [4]. FIG. 5B mostra Gleason 4 células tumorais coloração para CCL3 (e AGR2) em 08-052A espécime de tecido. Estes sinais gene também pode ser contribuído por leucócitos. P08-029pre, que veio de um volume do tumor pequeno de 0,6 cc, mostrou aumento marginal (2 a 3 vezes acima do fundo) para esses genes, exceto para AMACR: AGR2 = 0,16, AMACR = 0,32, CRISP3 = 0,78, ERG = 0,28 , HPN = 0,12, PCA3 = 0,19. Por outro lado, P08-025pre apresentaram baixas contagens para esses genes, exceto para CRISP3:. AGR2 = 0,06, AMACR = 0,16, CRISP3 = 2,27, ERG = 0,04, HPN = 0,03, PCA3 = 0,07

Assinatura um caso de alta Gleason

As contagens de sinal para P08-023pre (Gleason 4 + 5; PSA = 5) foram marcadamente mais pronunciado ( 70 vezes acima do fundo) em comparação com N: AGR2 = 10,26, AMACR = 32.61, CRISP = 38.35, ERG = 17.15, HPN = 5,74, PCA3 = 10,8 (Fig. 6A). Em particular, foi obtida uma contagem de CD24 muito alta (111,95). Um grande número de tumores da próstata, mostram um aumento de coloração CD24 [20], e coradas fortemente padrão de Gleason 5 células pode ser visto na Fig. 6B para amostras tumorais bancados 01-009E e 02-034A. Além disso, CD90v = 4,19 para células estromais associadas a cancro foi detectado. Afigura-se que, neste caso, mais células cancerosas e outros tipos de células foram libertadas na urina. Isto pode ser atribuída à perda de integridade histoarchitectural em doenças avançados (que pode também levar a níveis de PSA no soro mais elevadas). A exibição de dados composto na Fig. 7 mostra a diferença de sinal entre esse tipo de câncer de alto grau e os outros.

Discussão

Usando a tecnologia nanoString, temos desenvolvido um teste de urina multi-marcador que pode, potencialmente, ser aplicado para o rastreio, detecção e estratificação dos pacientes de câncer de próstata. As assinaturas de ARN obtidos a partir de nosso primeiro grupo aleatoriamente selecionado de amostras clínicas de urina foram promissores na medida em que poderia detectar câncer em quatro dos cinco espécimes pré-op com base nos seis marcadores de câncer de próstata conhecidos, incluindo PCA3, o marcador à base de urina atual. Mais importante ainda, P08-023pre a partir de um paciente com doença de alta qualidade mostraram contagens elevadas de ARN para muitos marcadores. No que diz respeito ao caso P08-027N suspeito, outros ensaios, não poderia ser feito como o paradeiro de este de uma só vez dador é desconhecido.

O teste de urina de PCA3 mostra que as células de cancro da próstata pode ser encontrado na urina. Ao contrário do teste de PCA3, o nosso teste de urina não exigem uma DRE atenta, embora DRE poderia aumentar os sinais através de meios mecânicos de induzir mais liberação de células da glândula [7]. Assim, o teste nCounter poderia ser desenvolvido em uma ferramenta de rastreio do cancro da não-invasivo. Para este fim, o teste de um grande grupo de homens extraídas da população em geral que não têm diagnóstico de câncer é de importância crítica como a expressão de linha de base dos marcadores de câncer de próstata selecionados na urina é desconhecida.

Muitos dos os marcadores de cancro da próstata também são expressos por tipos de células não prostáticas, por exemplo, AMACR em células tubulares do rim [27], CRISP3 no epitélio secretor do tracto genital masculino [28], mRNA ERG e proteína em células endoteliais (embora ERG é específico para cancro da próstata) [29], em HPN epidídimo e vesícula seminal (a proteína humana Atlas, https://www.proteinatlas.org), AGR2 nas células tubulares do rim e urotélio (a proteína humana Atlas e dados não publicados) . PCA3 sendo uma transcrição não-codificante, sua expressão não tem sido extensivamente pesquisada por imuno-histoquímica como os outros. Embora as assinaturas genéticas de todas as formas de câncer urogenital /doenças são em grande parte desconhecida, os seis genes de câncer de próstata conhecidos de AGR2, AMACR, CRISP3, ERG, HPN, e PCA3 estão em ou abaixo de fundo, por exemplo, no cancro da bexiga [30] . É provável que cada tipo de malignidade urogenital /doença iria dar origem a uma assinatura único gene. O presente codeset nCounter é projetado especificamente para o câncer de próstata com base na informação disponível até à data. Pós-operatório de urina (com correspondência pré-op) é informativo para ver se todos os marcadores de câncer (mais queridos específico da próstata) desapareceria após a cirurgia. Para os pacientes tratados por radiação focada, os marcadores de câncer, mas não ACPP, AZGP1, KLK3 seria perdida se o tumor é cauterizado com sucesso. Perguntas adicionais incluem: o que é a variação do dia-a-dia, se houver, na assinatura; faz a assinatura ter uma associação com a idade, como PSA soro; qual é o número do normal

vs

. células tumorais que são derramadas em urina.

O conjunto de sondas nCounter pode ser expandido para incluir vários genes mais comuns (B2M) ao lado para fins de comparação de contagem de genes e outros marcadores para a detecção de tipos de células específicos, tais como PTPRC /CD45 para as células brancas do sangue, PECAM1 /CD31 para células endoteliais, NCAM1 /CD56, B3GAT1 /CD57, NGFR /CD271 de elementos neurais, UMOD (uromodulin) para células renais (e UPK3A para células da bexiga). design de sonda não é perfeito, e às vezes novas sondas pode ser necessária se os primeiros fraco desempenho, por exemplo, DPP4 /CD26 na atual conjunto de códigos. Ambas as células luminais e câncer são fortemente histoquímica para CD26, mas as contagens de sinal para DPP4 foram geralmente baixas. Para a especificidade do câncer de próstata, os homens com biópsias negativas, hiperplasia benigna da próstata, prostatite, assim como os homens com bexiga e câncer de rim são testados. A especificidade é aumentada por o formato multiplex de nCounter. Os marcadores seleccionados são aqueles com a expressão aumentada no cancro da próstata, tais como PCA3 e AGR2. Muitos estudos têm mostrado recentemente que a pontuação urina PCA3 poderia fornecer uma ferramenta adicional para os médicos para gerir os seus pacientes [31]. Bu

et al

. detectados na urina RNA AGR2 por qRT-PCR envolvendo 31 casos (biópsia positiva) e 29 controles (biópsia negativa) para mostrar que a transcrição urina AGR2 superou PSA [32]. O nCounter codeset não só contém PCA3 e AGR2 mas também conjuntos de sondas para outros marcadores informativos. Teoricamente, a biblioteca sonda poderia conter todos os genes (incluindo ESTs) identificados através de análise de expressão gênica como up-regulada em células de câncer de próstata.

O teste nCounter é ideal para monitoramento de pacientes na vigilância activa. Estes são os homens com diagnóstico de câncer, mas as características da patologia de seu tumor sugeriria um câncer não-letal [33], [34]. Uma assinatura de ARN urina inicial para cada paciente é obtido no momento do arrolamento. Cada paciente pode então ser monitorado periodicamente pelo teste nCounter para determinar se as mudanças na assinatura RNA correspondem a progressão da doença medida pelo tempo PSA duplicação, Gleason classificação, DRE, ou evidência de disseminação do câncer.

Como um rastreio ferramenta, todos os homens poderiam obter uma assinatura aos 40 anos e ser seguido anual ou semestralmente para alterações neste perfil RNA urina linha de base. Um multiplex ELISA para medir as proteínas secretadas cancro da próstata (por exemplo, AGR2 e outros) pode, eventualmente, ser desenvolvido para complementar o teste de ARN. Assim, a correlação entre a contagem de AGR2 ARN e quantidades de proteínas de AGR2 as mesmas amostras tem de ser efectuada. A urina sobrenadante é concentrado por filtração em rotação para a medição de proteína AGR2 pelo sanduíche recentemente desenvolvido AGR2 ELISA [26]. Assim, alternativamente, todos os homens poderiam ser rastreada por AGR2 ELISA. Um sinal AGR2, então, solicitar testes nCounter para marcar a expressão de outros marcadores de câncer para confirmação.

Por fim, o teste nCounter é versátil e pode incorporar os marcadores de outros tumores urológicos, como bexiga [30] e rim. Além disso, é possível incluir marcadores para qualquer doença dos órgãos do tracto urinário para torná-lo um teste clínico multi-uso. A recolha e tratamento de urina é de fácil execução e o custo é barato (estimado em US $ 100 por teste). Mais importante ainda, a saída de dados digitais a partir deste teste pode ser facilmente arquivado e rastreado, e é facilmente compreensível para médicos e pacientes.

Reconhecimentos

Agradecemos Deanna Gonzalez e Jennilee Kho de consentimento do paciente e coleta de urina, e Jennifer Noteboom para recuperação de informações patologia.