Abstract

O nosso objectivo foi avaliar a associação entre a expressão eo polimorfismo de vias TLR4 /NF-kB e câncer de cólon. TLR4 (

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,

rs10759932

,

rs10759931

e

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) foram genotipados em amostras de sangue de doentes com câncer colorretal e controles saudáveis. TLR4 e citocinas expressão inflamatória foram avaliadas por PCR em tempo real em 40 correspondentes tecidos normais e cólon e do nível de proteína por imuno-histoquímica. O elevado nível de expressão de TLR4 em tecidos de cancro do cólon é principalmente devido a infecções por bactérias no cólon humano e conduz à indução de uma secreção de citoquinas inflamatórias agudas mediadas por NF-kB. Além disso, relatamos aqui uma clara evidência de uma associação entre TLR4

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polimorfismo (OR = 0,086, IC: 0,04-,18, P = 0,00001). Este polimorfismo afeta a população inteira sem ser específico para um ou outro género ou para qualquer faixa etária. Em contraste, o

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está associado com câncer de cólon em mulheres com idade superior a 50 anos e está intimamente ligada com a diminuição dos níveis de hormônios sexuais femininos durante o período de pós-menopausa (OR = 0,188, IC: ,074-,48 , P = 0,00084).

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e

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parece ter qualquer associação com câncer de cólon. Nossos dados sugerem que TLR4 SNPs poderia servir como biomarcadores para a tomada de decisão no tratamento do câncer de cólon

Citation:. Semlali A, Reddy Parine N, Arafah M, Mansour L, Azzi A, Al Shahrani O, et al. (2016) Expressão e Polimorfismo do Receptor Toll-Like 4 e Efeito sobre a NF-kB mediada por inflamação em pacientes com cancro do cólon. PLoS ONE 11 (1): e0146333. doi: 10.1371 /journal.pone.0146333

editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 29 Abril, 2015; Aceito: 20 de novembro de 2015; Publicação: 15 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Semlali et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo número Grant RGP-VPP-260, https://dsrs.ksu.edu.sa/en. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : TLR4, Toll-like receptor 4; CRC, câncer colorretal; SNPs, polimorfismos de um único nucleotídeo; LRRs, repetições ricas em leucina; DAMP, Pathogen-associado padrão molecular; Damps, moléculas padrão molecular associado a danos; TNF, factores de necrose tumoral; TIR, receptor Toll-interleukin1; NF-kB, fator nuclear kappa-light-chain-potenciador de células B ativadas; MAPA, Mycobacterium avium subsp. Para tuberculose; QPCR, Quantitative PCR; ICs, intervalos de confiança

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é uma doença complexa e um dos tipos mais comuns de câncer. Os fatores de risco para o cancro do cólon parecem ser determinada pela interação entre genética e uma variedade de exposições ambientais. Várias linhas de evidência suportam o ponto de vista que a deficiência do sistema imunitário poderia contribuir para o risco de desenvolvimento de muitos cancros, e a activação do sistema imunitário é vigorosamente prosseguido para a terapia do cancro. Neste sentido, a associação da imunidade inata com câncer de cólon está emergindo. Além disso, os pacientes com imunodeficiência foram mostrados como tendo um risco aumentado do cancro [1], e estudos recentes têm demonstrado que a sinalização deficiente de receptores da imunidade inata pode contribuir para a patogénese do cancro [2-5]. A imunidade inata é principalmente activada e regulada por receptores semelhantes a Toll (TLRs) [6] encontradas nas membranas das células do sistema imunológico, tais como neutrófilos, células dendríticas e macrófagos, bem como sobre as células da superfície da pele e genito-urinário e gastrointestinal [7] . a ativação do receptor Toll-like é responsável pela morte de células microbianas durante a infecção, deixando as células hospedeiras intactas [8-10]. Semelhante a outros TLR, TLR4 é composta por três domínios: compreendendo um domínio extra-celular resíduos 24-631 e contendo repetições ricas em leucina (LRRs), uma região trans-membrana com uma única hélice transmembranar entre os resíduos 632-652, e um domínio de sinalização citoplasmática de terminal-C [11, 12]. TLRs constituem um grupo particularmente importante de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) [13] e está localizado na superfície das células ou dentro de endossomas. Estes são predominantemente expressas em tecidos envolvidos na função imune e têm um papel importante na defesa do hospedeiro contra organismos patogénicos. Até à data, 10 TLRs funcionais foram descritas em seres humanos; TLR 11-13 são encontrados em várias espécies de roedores (ratinhos e ratos) [14] .TLRs desempenhar um papel crucial na activação do sistema imunitário através da regulação da produção de péptidos antivirais e citocinas inflamatórias [15-19] através de motivos estruturais altamente conservadas conhecido como padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) .TLRs têm sido implicados na imunidade inata [5, 12, 20, 21], e alterações de respostas TLR pode resultar em infecções virais e bacterianas graves ou um maior risco de cancro [4, 5, 20]; Eles também têm sido implicadas na resposta inflamatória de células do epitélio intestinal [22].

A sinalização domínios de TLRs são conhecidos como Toll IL-1 Receptor (TIR), domínios vez que partilham homologia com o domínio de sinalização de IL membros da família -1R [23], que induzem a NF-kB e IRF3 translocação e de trans-activação [24] e a activação de diferentes genes de citoquinas inflamatórias [25, 26], através de uma via dependente de MyD88-comum a todos os TLR, excepto TLR3 [ ,,,0],27, 28]. Outro mecanismo de sinalização dos TLR conhecida como a via independente de MyD88 está associada com a estimulação de IFN-β e a maturação de células dendríticas através do TRIF adaptador /tICAM-1 [29] ou através ELÉCTRICO /tICAM-2, o qual é restrita à RST4 via [30].

o gene TLR4 está localizado no cromossoma 9 e codifica uma proteína que funciona na resposta imunitária por factor de activação nuclear kappa-luz de cadeia-potenciador de células B activadas (NF-kB) [ ,,,0],18]. O comprometimento da TLR sinalização

in vivo

torna-se evidente através da presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), que têm sido associados com o receptor hipo-responsividade e suscetibilidade a infecções bacterianas, fúngicas e virais [31]. Um estudo anterior em destaque o envolvimento de activação de TLR e polimorfismos TLR em muitas doenças, tais como cancro da próstata [32]. Portanto, uma diminuição na função de TLR pode estar associada a um aumento do risco de cancro. Foi recentemente demonstrado que um polimorfismo na sequência do promotor de TLR2 e TLR4 um alelo variante estão envolvidos em

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) -associated gástrica cancro [33, 34] .Além disso, um polimorfismo no gene cluster TLR10-TLR1-TLR6 está associada com um risco aumentado de cancro da próstata [35], e a expressão in vivo funcional TLR4 é conhecido por ser responsável pela trombocitopenia induzida por LPS [36]. TLR-2 polimorfismos estão também envolvidas na resposta areduced após o desafio com micobactérias, whereasTLR4 polimorfismos conhecidos estão a ser associado com uma resposta reduzida ao lipopolissacárido e o desenvolvimento do cancro gástrico [37, 38]. Um SNP TLR4 (

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) também está associada com o cancro do cólon [39] .Recentemente, um RST4 humano (Asp299Gly) SNP tem sido sugerido para ser mais especificamente associada com LPS hipo-capacidade de resposta e um risco aumentado de desenvolver câncer de próstata entre a população indígena do Norte [40]. Além disso, TLRs demonstraram desempenhar um papel na progressão de pólipos de tumores, e redução da expressão de TLR4 tem sido associado com o aumento do potencial de metástases de cancro colo-rectal (CRC) [41, 42]. Uma meta-análise sintética baseada em dados de 22 estudos também confirmaram a associação de TLR4 SNP Asp299Gly com o aumento do risco de câncer gastrointestinal, mas com diminuição do risco de câncer de próstata [43]. No entanto, um relatório conflitantes de um estudo multi-racial realizado na Malásia mostraram nenhuma correlação entre um polimorfismo TLR4 (Asp299Gly) eo risco de CRC [44]. Assim, é claro que mais estudos são necessários para validar esses achados. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de TLR4 no CRC e examinar a implicação potencial de quatro SNPs de TLR4 humano (

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,

rs310759931

,

rs10759932and rs4986790

) com o risco de câncer de cólon na população Arábia Saudita.

resultados

Análise dos parâmetros de dados clínicos

Um total de 115 casos de câncer de cólon e 102 controles saudáveis ​​foram incluídos no o estudo. As características clínicas dos pacientes, incluindo idade, nacionalidade, história familiar, tabagismo, e estágio do câncer de cólon, foram coletados e comparados com os dos pacientes do grupo controle (Tabela 1). A idade população do estudo variou entre 45 e 88 anos, com uma média de idade de 56,04 ± 14,37 para os casos de câncer de cólon e 52,84 ± 15,88 para os controles. Não houve diferença significativa na idade média entre os dois grupos. O rácio entre homens e mulheres não foi significativamente diferente entre os casos e controles (66/49 para os pacientes e 60/42 para controles).

O aumento da expressão do gene TLR4 em tecidos de câncer de cólon em comparação com correspondentes tecidos normais

As amostras de tecido utilizadas para a análise de RNA (n = 40 correspondentes tecidos) foram imediatamente colocadas em solução de ARN-posterior. Após extracção de ARN, inverter um quantitativo em tempo real da transcrição de PCR foi realizada para comparar a expressão diferencial de mRNA de RST4. Como mostrado na Fig 1A, TLR4 foi altamente expressos (p 0,001) em tecidos de cancro de cólon em comparação com tecidos normais de cólon (2,53 ± 0,32) e (1,01 ± 0,01), respectivamente (Fig 1A)

celular total. ARN extraído fresco a partir de correspondentes tecidos normais e de cancro do cólon foi transcrito de forma inversa em ADNc e, em seguida, utilizado para medir a expressão TLR4mRNA (Painel a). Os tecidos foram marcadas usando anticorpos TLR4 específico (Painel B).

Para confirmar os dados expressão de mRNA, determinou-se a expressão da proteína TLR4 por imuno-histoquímica. Tal como mostrado na (figura 1B), imuno-coloração positiva para a RST4 foi geralmente observada em células epiteliais do cólon e também em algumas células do estroma compartimentos. No entanto, a intensidade da coloração foi maior nos tecidos tumorais adenocarcinoma do cólon.

Correlação entre polimorfismos de TLR4 e susceptibilidade para o desenvolvimento do cancro do cólon em pacientes sauditas

A distribuição dos alelos e genótipos ea associação análise são descritos na Tabela 2. Todos os SNPs genotipados foram testados quanto ao equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Amostras de DNA de sangue de 115 pacientes e 102 controles saudáveis ​​foram genotipados para a presença de 4 TLR4 SNPs (

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T /C,

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A /G,

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T /C e

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A /G). Os fenotípicas e genotípicas características dos grupos de pacientes e de controlo estão resumidos na Tabela 3.

Os dados para três TLR4 SNPs,

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,

rs10759932

e

rs4986790

, que estão localizados no promotor, não mostrou qualquer associação com câncer de cólon na população saudita. No entanto, para SNP

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, o que resulta em Asp299Gly, a distribuição de alelos e genótipos foram significativamente diferentes entre os pacientes e controles. O alelo G verificou-se ser significativamente mais altamente frequente entre os pacientes (0,87) em comparação com o grupo de controlo (0,3). A GG homozigoto do mesmo SNP também foi muito frequente no grupo de pacientes em comparação com o grupo controle (0,81

vs

. 0,1) e foi altamente associada ao desenvolvimento de câncer de cólon entre a população saudita. No entanto, a presença do alelo A, no caso de heterozigotos e homozigotos (aa) parece conferir protecção contra o cancro colo-rectal (OR 0,026; 95% CI 0,011-0,058; p ≤0.00001).

Associação entre a freqüências genotípicas de polimorfismos do gene TLR4 e

género

para avaliar a associação entre o risco de câncer de cólon e SNPs individuais com base no sexo do paciente, as distribuições de genótipos de acordo com gênero no grupo de câncer de cólon foram comparados com os dos indivíduos do grupo controle (Tabelas 3 e 4). Curiosamente, no grupo feminino (35 pacientes e 31 controles), o alelo T do rs2770150 SNP apresentada uma frequência que foi significativamente maior nos pacientes do que nos controles (0,78 contra 0,6) (OR 2,38; IC 95% 1,2-4,8 e p = 0,012). Por outro lado, genótipos TC e CC foram quatro vezes menos freqüente nos casos em comparação com os controles (OR 0,14; 95% CI 0,04-0,48 e p = 0,0009). Alelo (C) era significativamente muito frequente entre os controlos (0,40) em comparação com o grupo de pacientes (0,22) (p = 0,0002). No entanto, a distribuição do genótipo CC entre fêmeas afectados e não afectados foi diferente (P = 0,019) (Tabela 3). SNP

rs2770150

CC genótipo não mostraram risco significativo em pacientes do sexo feminino depois de aplicar a correção de Bonferroni. Em contraste, o SNP

rs2770150

não foi associada com câncer colorretal em homens (40 pacientes e 34 controles (Tabela 4).

SNP

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, que mostrou uma alta associação com o risco de câncer de cólon na população em geral, também apresentou uma associação significativa no sexo feminino (46 pacientes e 38 controles) e do sexo masculino (62 pacientes e 48 controles) sub-grupos. no entanto, genótipos GA e AA no grupo feminino foram frequente nas amostras de controlo em comparação com os doentes com cancro do cólon (OR = 0,025 IC 95% 0,007-0,090 e p 0,00001; Tabela 3) a mesma observação foi feita nos pacientes do sexo masculino em comparação com os homens saudáveis:. GA + AA eram 0,2 e 0,87, respectivamente (p 0,00001; Tabela 4) Para SNPs

rs10759932 Comprar e r

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, não houve diferença significativa na distribuição dos genótipos entre fêmeas e machos afetados e não afetados. foi observada (p 0,05). (Tabelas 3 e 4)

Associação entre freqüências genotípicas de polimorfismos do gene TLR4 e idade

Uma análise mais aprofundada da distribuição dos genótipos TLR4 após correlação com a idade revelou que a idade média de início de amostras presentes do cancro do cólon é de 56 anos e em grupos de controle é de 52 anos. Para avaliar a associação entre TLR4 SNPs com uma idade mais jovem no momento do diagnóstico de câncer de cólon, que permitiu a estratificação dos pacientes como ≤50 ou 50 anos de idade. A distribuição dos genótipos para os SNPs individuais, juntamente com a análise estatística é mostrado nas Tabelas 5 e 6. O T alelo de SNP rs2770150 apresentada uma frequência que foi significativamente mais elevado nos pacientes com mais de 50 anos de idade do que nos controlos. Por outro lado, o alelo C foi significativamente menos frequente nos casos em comparação com os controlos (0,24 contra 0,36) (ou 0,57, IC 95% 0,3-0,9 e p = 0,038) (Tabela 6), ao passo que não foi observada nenhuma diferença para este SNP para a subpopulação de pacientes com idade inferior a 50 (Tabela 5). Mas após a aplicação SNP correção rs2770150 genótipo CC de Bonferroni não apresentaram risco significativo em 50 anos patients.rs10759931 de idade, que mostrou uma associação significativa no estudo global, também indicou um risco significativo em ambas as subpopulações de pacientes (p 0,00001) (Tabelas 5 e 6). Não houve diferença significativa na distribuição dos genótipos entre os indivíduos afetados e não afetados para ambas as subpopulações foi observada (p 0,05) para os outros dois SNPs (

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e

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; Tabelas 5 e 6).

inflamatória inata Moléculas de resposta em relação ao desenvolvimento de câncer de cólon

o objetivo do presente estudo foi avaliar as diferenças e as relações entre a expressão de TLR4 e citocinas, especificamente variações na expressão de citoquinas inflamatórias interleucina (IL1β1, IL6, IL-8 e IL-17. a presença de células inflamatórias e de níveis de citocinas principais envolvidos no processo de inflamação do cancro do cólon de expressão foram quantificados usando reversa em tempo real transcriptase (RT) -PCR a partir de 40 tecidos de cancro do cólon e 40 correspondentes tecidos normais. O mRNA de citocinas foi níveis substancialmente mais elevados (10-22 diferenças vezes) em tecidos de cancro do cólon, em comparação com amostras de cólon normais, como mostrado na Figura 2, indicando mais elevadas respostas pró-inflamatórias em amostras de CRC. Isto é devido à sobre-expressão de TLR4 actividade em pacientes com cancro do cólon.

A produção de citocinas foi avaliada por qRT-PCR em tecidos de cancro do cólon e tecidos normais correspondentes (média ± DP, n = 40 doentes, os dados normalizados para

GAPDH

, controle (barras abertas), câncer (barras sólidas), * P 0,00 t-test)

expressão p65 Aumento da NF-kB em tecidos de cancro do cólon

para confirmar a nossa hipótese de que, a altamente nível de RST4 em pacientes com cancro do cólon leva à indução de uma resposta inflamatória mediada por vias múltiplas especificamente a NF-kB e induzir uma secreção aguda de citocinas inflamatórias como tal como IL-6, um estudo comparativo de expressão NF-kB foi realizada por imuno-histoquímica em tecidos do cancro do cólon e tecidos correspondentes normais. A análise imuno-histoquímica revelou que a expressão de NF-kB p65 em tecido de cancro do cólon aumentou significativamente em comparação com o tecido do cólon normal (Figura 3) Nossos resultados sugerem um papel crítico de NF-kB como uma molécula de sinalização no processo inflamatório, o que facilita a expressão e secreção de citocinas pró-inflamatórias, que levam a uma série de respostas inflamatórias através da activação de RST4.

Os tecidos foram imunocoradas utilizando anticorpo específico NF-kB (p65) a 1/100 (n = 10).

Discussão

a associação entre inflamação e carcinogênese foi descrita pela primeira vez há 10 anos [45-47] .Desde então, a inflamação foi relatado para aumentar a proliferação e migração /invasão em vários tipos de células tumorais [47 ], e a ligação entre a inflamação induzida por microorganismo comensal da mucosa foi recentemente suspeito como sendo ligado a CRC. Por outro lado, a nossa hipótese é a de que RST4 desempenha um papel importante no sistema imune inato e que a alteração estrutural da função dessa proteína, que em última análise dificulta vigilância imunitária em mucosa de cólon, pode levar ao desenvolvimento de tumores [48]. Está documentado que a activação TLR4 promove a carcinogénese e resistência a tratamentos químicos no cancro da mama [49, 50], ao passo que o bloqueio de RST4 activação pode retardar o crescimento do cancro da mama e prolongar a sobrevivência [2]. Portanto, examinamos primeiro associação entre a susceptibilidade de desenvolver CRC na população saudita e expressão de TLR4 e polimorfismo TLR4. Os nossos resultados mostram que TLR4 é sobre-expressa em células epiteliais de tumor do cancro do cólon, as quais constituem a primeira linha de defesa contra agentes externos. Além disso, a nossa análise também demonstraram que a expressão de TLR4 é significativamente aumentada em tecidos de tumor de cólon em comparação com correspondentes tecidos normais do cólon. Estes resultados estão de acordo com trabalhos anteriores relatando a sobre-expressão de TLR4in vários cancros, tais como progressão câncer gástrico [51], o cancro da mama [49, 50, 52], câncer de cólon [52], e do ovário [53]. O nível mais elevado de expressão de TLR4 em tecidos de cancro de cólon em comparação com tecidos normais é principalmente devido a infecções por bactérias no cólon humano, explicando a origem potencial de cancro do cólon. Estas descobertas sugerem que a activação da expressão de TLR4 no cólon tecidos cancerosos pode promover o crescimento tumoral e resistência à apoptose, uma conclusão que é apoiada por estudos anteriores que mostraram que o bloqueio de RST4 sinalização crescimento tumoral atrasos e prolonga a sobrevivência de animais [41 , 54]. RST4 sinalização no cancro é considerado uma espada de dois gumes: se TLR4 é activada em células imunes, que podem aumentar a imunidade anti-tumoral, e portanto, TLR4 poderia ser usado como um marcador para a detecção de uma predisposição para um cancro; no entanto, a inflamação crónica induzida por activação TLR4 é um importante fator de risco para desenvolvimento de câncer [55] .TLR4 poderia ser um jogador importante no desenvolvimento e comprometimento do cancro do cólon inTLR4 sinalização in vivo torna-se evidente através da presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).

Este é o primeiro relatório que examina uma possível associação de vários polimorfismos commonTLR4 com câncer de cólon em sauditas. Dada a maior frequência do

alelo TLR4

G em pacientes com CCR em comparação com controles saudáveis, uma clara evidência é apresentada para uma associação romance entre TLR4

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polimorfismo e suscetibilidade ao desenvolvimento de câncer de cólon na Arábia população árabe. O

TLR4

genótipo GG é o mais difundido no Oriente Médio, especialmente na população da Arábia Saudita. Este polimorfismo afeta a população inteira sem ser específico para um ou outro género ou qualquer faixa etária. O genótipo AA é geralmente representado em outras populações e protege contra o câncer de cólon, assim, o genótipo GG pode servir como um marcador genético para o diagnóstico de câncer de cólon na população étnica. Em contraste, o

TLR4

polimorfismo

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está associado com câncer de cólon em mulheres com idade superior a 50 anos e está intimamente ligada com a diminuição dos níveis de hormônios sexuais femininos durante o período pós-menopausa. Estudos anteriores já descrito o papel do estrogénio e progesterona na protecção contra o cancro do cólon em mulheres [56-59]. Neste sentido, nós investigamos o polimorfismo em mulheres pré e pós-menopausa para ajudar a esclarecer este fenómeno.

O mais comum polimorfismo missense, D299G, que ocorre no exão 4 do gene TLR4 humano (A896G), situa-se dentro do domínio extracelular do receptor. As estruturas de raios-X de ambas as de tipo selvagem e mutada (D299G) receptores com os LPS e os domínios MD-2 foram determinadas [60], que mostra claramente que este polimorfismo não afecta a dimerização, mas resulta numa alteração conformacional local significativa em o local D299G [61]. Esta alteração conformacional pode prejudicar a ligação do ligando e diminuir a resposta de sinalização do receptor para o LPS, e sinalização TLR4 auditivos foi demonstrado que interfere com o recrutamento de MyD88 e TRIF [62], o que levaria a uma resposta imunitária deprimida para qualquer agressão bacteriana comensal em células da mucosa. Este polimorfismo juntamente com TLR4rs2770150 não mostrou associação com câncer de cólon neste grupo étnico, embora esses dois SNPs mostrou uma forte ligação com o câncer de próstata [32] e câncer gástrico [63] em outros estudos e em outras populações.

RST4 Activação por ligandos leva à produção de citoquinas que promovem um papel importante na patogénese da mesma cancro, especialmente na iniciação e manutenção da inflamação. O papel das citocinas tal como a IL-6 desempenha um papel importante na com uma vasta gama de actividades biológicas em hematopoies imunes é a regulação e oncogénese. A maioria destas citoquinas também foi detectado em vários tumores epiteliais [64], está envolvida na proliferação e diferenciação de várias células de tumores malignos [65]. Superexpressão de IL-6 foi encontrado no câncer de próstata [66, 67], carcinoma da mama [68] e carcinoma de células escamosas oral [69].

Aqui nós mostramos uma maior expressão de TLR-4 em tecidos de câncer de cólon e seu papel nas vias inflamatórias particularmente via NF-kB via, um hub molecular fundamentais que liga inflamação e câncer. A inibição da activação de NF-kB, bloqueando o sinal de MyD88 irá reduzir a libertação de citocinas pró-inflamatórias, atenuar a resposta inflamatória e conseguir um efeito terapêutico.

Em resumo, nós fornecemos ligações entre a expressão do gene de RST4 e polimorfismos de TLR4, que têm sido propostos como importante para o processo cancerígeno de câncer de cólon na população Arábia Saudita. Nossos dados sugerem que a variação genética em TLR4 pode influenciar o desenvolvimento de cancro do cólon. Replicação destes resultados é justificada dada a plausibilidade biológica da associação e da interação com dieta e estilo de vida fatores que podem modificar estes efeitos genéticos. Além disso, acreditamos que nosso estudo fornece uma ligação mecanicista importante que poderia ser o ponto de partida para novos estudos e SNPs importante neste genes poderia servir como biomarcadores para a tomada de decisão no tratamento do câncer de cólon.

Materiais e Métodos

populações de estudo e coleta de amostras

Um total de 115 casos de câncer de cólon e 102 controles saudáveis ​​foram incluídos neste estudo, que foi aprovado pelo conselho de revisão institucional local. As amostras foram recrutados a partir de King Khalid University Hospital em Riad, Arábia Saudita. Todos os dados questionário e amostras (sangue de tecidos e) foram coletadas no recrutamento inicial de ambos os casos e controles. Os participantes foram convidados a preencher um questionário auto-aplicável em relação às suas características sócio-demográficas (por exemplo, idade, história familiar de câncer), estilo de vida (por exemplo, o hábito de fumar e consumo de álcool), e história médica pessoal. Os casos e controles foram frequência pareados por idade e sexo. As características clínicas dos pacientes, incluindo a idade para a seleção da população saudita (foram excluídos indivíduos cidadão não-sauditas), história familiar, tabagismo, estágio do câncer de cólon, medicamentos e presença de outras doenças foram coletadas e comparadas. A idade população do estudo variou entre 45 e 88 anos, com uma média de idade de 57,04 ± 14,37 para os casos de câncer de cólon e 56,51 ± 15,70 para os controles (Tabela 1). As amostras de tecido foram utilizadas para extracção de ARN. As amostras de sangue foram armazenadas em tubos de EDTA a -80 ° C e utilizados para a extracção do ADN genómico.

reagentes gerais

ADN /iniciadores e SNPs foram obtidos a partir de Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON , Canadá). Os anticorpos anti-TLR4 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA) .RNA posteriormente para estabilização de RNA foi obtido a partir de Ambion /Life Technologies (Burlington, ON, Canadá). Kits de ARN foram da Qiagen (Hilden, Alemanha). Os ADNc de alta capacidade de inverter kit de transcrição foi de Applied Biosystems (Warrington, EUA). SYBR Green foi obtido a partir de Bio-Rad (Mississauga, ON, Canadá).

ADN extracção

O ADN genómico foi extraído a partir de sangue total usando o kit de QIAmp (QIAmp Blood DNA Mini Kit, Qiagen, Valência, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 200 a 300 ul de sangue em tubos de EDTA armazenada a -80 ° C foi equilibrada à temperatura ambiente, misturada com a protease e tampão de lise, e foram incubadas a 56 ° C durante 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 100% de etanol, e a mistura foi passada através da coluna usando centrifugação. A membrana foi lavada em coluna, e o ADN foi eluído with100 ul de tampão de eluição (AE). A concentração do DNA extraído foi determinado utilizando um nano-Drop8000spectrophotometer (Thermo Scientific) .A pureza do ADN foi avaliada por um padrão de A260 /A280 e razões A260 /A230.

isolamento de ARN total

total RNA de tecido foi isolado utilizando o ADN /ARN Mini kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), como descrito por Alanazi et al [70]. Resumidamente, os tecidos foram lisadas em tampão de 350 μllysis com 3,5 ul β-mercaptoetanol. O lisato foi, subsequentemente, filtrou-se e homogeneizou-se com 70% de etanol, e o ADN foi carregada na coluna e digerido com ADNase à temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, a membrana foi lavada em coluna, e o ARN foi eluído com 40 ul de ARNase-H livre

2O e armazenado em tubos de colheita livre de nuclease a -80 ° C. A concentração, pureza e qualidade do RNA isolado foram todos determinados utilizando o sistema analisador de Bio Agilent 2100 e um kit de análise Agilent RNA pequeno de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha).

síntese de cDNA

Como descrito por Semlali et al [71, 72], de 1 ug de RNA cada amostra foi de transcrição reversa em cDNA usando uma alta capacidade de cDNA kit de transcrição reversa (Applied Biosystems, Warrington, EUA) .As condições para a preparação dos modelos de ADNc para análise de PCR foram de 10 min a 25 ° C, 2 h a 37 ° C e 5 min a 85 ° C. O ADNc sintetizado foi armazenado a -20 ° C ou 4 ° C para as reacções de PCR subsequentes.

Quantitative real-time PCR

expressão de ARNm de RST4 foi detectada por RT-qPCR como previamente descrito [71 , 72]. A expressão do gene GAPDH de manutenção da casa foi usado como um controle endógeno para a normalização da quantidade de ARN de amostra. As reacções foram realizadas utilizando um PCR Supermix verde SYBR de Applied Biosystems. As sequências de TLR4, citocinas e os iniciadores de GAPDH são mostrados na Tabela S1.

-PCR em tempo real foi realizado utilizando a7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Os iniciadores foram adicionados à mistura da reacção a uma concentração final de 250 nM. Tal como anteriormente descrito [72], 5μlof cada amostra de ADNc foram adicionados a uma mistura de PCR contendo 20 ul de 12,5 ul de SYBR Green Supermix, 0,5 ul de iniciadores específicos e de 7 uL de RNase /água isenta de ADNase. A reacção de PCR consistiram em com 50 ° C durante 2 minutos e 95 ° C durante 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 62 ° Cfor30 minutos e 30 segundos a 72 ° C. Todos os ensaios de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado, e a especificidade de cada par de iniciadores foi verificada pela presença de um único pico de temperatura de fusão. GAPDH produziram níveis de expressão uniformes variando de menos de 0,5 TCs entre condições de amostra e, por conseguinte, foi usado como um gene de referência para este estudo. Os produtos amplificados foram separados num gel de agarose para confirmar que não havia produtos espúrios amplificados. Os resultados foram analisados ​​usando o

-ΔΔCt (Livak) Método expressão 2 relativo.

imuno-histoquímica (IHQ) análise

blocos

Parafina embutido de câncer de cólon e amostras de tecido do cólon normais foram cortadas em secções de 3 mm de espessura. Estes foram montados em lâminas revestidas com soro fisiológico e incubada durante 15 a 20 minutos num forno de ar quente a 60 ° C. As secções de tecido foram desparaf inadas com EZ Prep (Ventana, Arizona, EUA) a 75 ° C, o calor de pré-tratadas em Cell Condicionamento 1 (CC1; Ventana, Arizona, EUA) utilizando um protocolo de “células condicionado padrão” para a recuperação de antigénio em 100 ° C, e, em seguida, incubou-se com uma gota de solução de inibidor, durante quatro minutos a 37 ° C. As lâminas foram então lavadas e foram incubadas durante 32 minutos a 37 ° Cwith anti RST4 e anti NF-kB (diluído 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) anticorpo primário e seguido por uma incubação com o secundário Ultraview anticorpo HRP universal multímero . As proteínas de TLR4 imunolocalizada foram visualizados utilizando uma reacção de DAB-cobre melhorada.