Abstract

A prevalência de tumores testiculares de células germinativas (TGCT), uma malignidade tecido sólido comum em homens jovens, tem sido anualmente a aumentar a um ritmo alarmante de 3%. Uma vez que a maioria dos cancros testiculares são derivadas de células germinais na fase de transformação de células germinais primordiais (PGC) em gon�itos, o aumento foi atribuído a maternais /fetais exposições aos factores ambientais. Foram examinados os efeitos de um estrogénio (dietilestilbestrol, DES), um antiandrogénio (flutamida), ou radiação sobre a incidência de tumores de células germinativas testiculares em geneticamente predispostos 129.MOLF-L1 (L1) ratinhos congénicos por expondo-os a esses agentes nos dias 10.5 e 11.5 da gravidez. Nem flutamida nem DES produziu aumentos notáveis ​​na incidência de câncer testicular em 4 semanas de idade. Em contraste, duas doses de radiação de 0,8 Gy aumentada a incidência de TGCT de 45% a 100% na prole. A percentagem de ratinhos com tumores bilaterais, os pesos dos testículos com TGCT, e a percentagem de tumores que eram claramente teratomas foram maiores nos ratos irradiados do que em controlos, indicando que a irradiação induziu tumores mais agressivos e /ou mais focos de locais de iniciação em cada testículo. Esta dose de radiação não interromper a espermatogénese, que era qualitativamente normal em testículos livres de tumor apesar de terem sido reduzidos em tamanho. Esta é a primeira prova de indução de cancro testicular por um agente ambiental e sugere que o feto masculino de mulheres exposta à radiação a cerca de 5-6 semanas de gravidez pode ter um risco aumentado de desenvolver cancro testicular. Além disso, ele fornece uma nova ferramenta para estudar os eventos moleculares e celulares da patogênese do câncer testicular

Citation:. Shetty G, Comish PB, Weng CCY, Matin A, Meistrich ML (2012) Exposição de Radiação Fetal Induz câncer testicular em camundongos geneticamente suscetíveis. PLoS ONE 7 (2): e32064. doi: 10.1371 /journal.pone.0032064

editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de outubro de 2011; Aceito: 19 de janeiro de 2012; Publicação: 13 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Shetty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Florence M. Thomas Professorship em Cancer Research (para Marvin L Meistrich) e Cancer Support Center Grant CA 16672 do National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tumores de células germinativas testiculares (TGCT) são o tumor maligno mais comum em homens brancos com idade entre 15 e 40 anos. TGCTs humanos são principalmente classificados histologicamente em seminomas, que lembram as células primordiais germinativas (PGCs), e não-seminomas, que são ou indiferenciado (carcinoma embrionário) ou diferenciadas mostrando embrionárias (teratoma) ou extra-embrionário (saco vitelino) padronização [1 ]. Teratomas são caracterizados pela diferenciação de uma diversificada gama de tipos de células e tecidos. A idade média de aparecimento de vários tipos de tumores difere com seminomas resultante em cerca de 35 anos, a maioria dos não-seminomas em 25 anos, ea maioria dos teratomas e gema de tumores do saco em cerca de 1,5 anos. Considerando que os tumores que aparecem em adultos são precedidos por carcinoma in situ (CIS), que contêm células que se assemelham muito gonócitos, aqueles que aparecem em crianças não são precedidos por CIS [2]. Apesar destas diferenças evidência suporta uma patogênese comum subjacente destes tumores, tais como aberrações cromossômicas semelhantes, regiões cromossômicas amplificados e expressão de genes de pluripotência [3]. Todos estes tumores são derivados de células com características de células germinais primordiais (PGC) ou gon�itos, embora em diferentes fases de desenvolvimento avaliada pela forma do apagamento de impressão entre parentes original ou o estabelecimento posterior de impressão paterno.

Houve um aumento anual de 3% na incidência de TGCTs em jovens homens brancos em todo o mundo nos últimos 50 anos [4], mas as razões são indescritíveis. Elucidação da causa deste aumento é importante para uma possível prevenção ou reversão deste aumento.

Uma vez que as células de cancro do testículo são derivadas de células germinativas primordiais (PGCs) ou gon�itos [2], o aumento foi atribuído a materna e exposições fetais a fatores ambientais, com maior atenção dada aos desreguladores endócrinos, tais como estrógenos e anti-androgénios [5], [6], [7]. A radiação ionizante, um conhecido agente cancerígeno [8], que aumenta a incidência de cancros da infância e outros adultos em indivíduos expostos durante o desenvolvimento fetal [9], [10] estudo pouco, tem recebido. Um estudo de caso-controle mostrou que exposição à radiação ionizante durante a gravidez aumenta o risco de câncer de testículo em prole masculina [11].

O único modelo murino para TGCT são os teratomas espontâneas que foram originalmente observados em 129 /ratos Sv [12]. Eles aparecem mais semelhante para as TGCTs infantis em humanos porque as células germinativas desenvolvem-se rapidamente em tumores após o nascimento. No entanto, como todos os tipos TGCT humanos, os teratomas mouse também originam dos PGCs ou gonócitos. Além disso, os defeitos nas mesmas genes, Kit-ligando (KITL) e Dmrt1, aumentar dramaticamente a incidência de teratoma em ratos [13], [14] e está associada com ou predispõem os seres humanos para os TGCTs adultos [15], [16 ]. Estes exemplos sugerem que este modelo teratoma mouse pode ser relevante para as formas adultas de câncer de testículo humano, bem como, embora existam reservas sobre tal extrapolação [1].

Nos ratos 129 /Sv, cerca de 3- 10% desenvolvem TGCTs espontâneas. ratinhos congénicos sobre um fundo 129 foram desenvolvidos; aqueles que contêm todos cromossoma 19 derivada da estirpe molf tem uma incidência de 80% de TGCTs [17] e aquelas porções de transportando cromossoma 19 mostram diferentes níveis de incidência de tumores [18], [19]. No presente estudo, utilizou a estirpe congénica 129.MOLF-L1 (L1), com uma incidência relatada de 30% de TGCTs, para maximizar o poder do estudo. Utilizamos este modelo de rato para testar o efeito do estrogênio, anti-andrógeno e exposição à radiação ionizante em TGCT incidência. As exposições foram feitas em E10.5 e 11,5, que é apenas após as células germinativas primordiais (PGCs) colonizar a gônada fetal, e estão passando por grandes mudanças epigenéticas que suprimem o seu potencial para reverter para um estado pluripotente e comprometer-los para o desenvolvimento de células germinativas [20 ].

resultados

Foram examinados os efeitos de tratamentos com um estrogénio (dietilestilbestrol, DES), um anti-andrógeno (flutamida), ou irradiação sobre a incidência de TGCT em um modelo animal. Nós exposta fêmeas grávidas L1 para os agentes nos dias 10.5 e 11.5 da gravidez.

Não houve efeito da flutamida, DES ou irradiação sobre a capacidade reprodutiva das barragens (Tabela 1). Isto foi confirmado pelas percentagens semelhantes de ratos produzindo descendência depois do acasalamento bem-sucedido e os tamanhos da maca comparáveis ​​nas barragens tratados e de controlo respectivos.

Testes foram colhidas a partir da descendência masculina e muitos deles continham tumores visíveis (Figura 1A e B). O exame histológico confirmou que a maioria destes eram teratomas com tecidos de várias origens dérmicos, mas alguns continham apenas as células neuroepiteliais (Figura 1C e D). Flutamida não aumentou significativamente a incidência de TGCTs no total (30% de testículos tinham tumores versus 21% no controlo). No entanto, fez aumentar ligeiramente a incidência de TGCTs que foram confirmados até ser teratomas pela presença de múltiplos tipos de células de origem dérmica (24% de testículos versus 14% no controle,

P

= 0,04) (Tabela 2 ).

morfologia testicular mostrando bilateral (A) e B) TGCTs unilaterais (de ratos irradiados. Note-se que o testículo sem TGCT após

in utero

exposição à radiação (B) é menor do que o testículo normal não tratada de um ratinho de 4 semanas de idade (inserir em B). secções testículo mostrando tecidos teratoma contendo aparentemente a partir de várias origens dérmicos identificados pela morfologia (C), e TGCT contendo apenas células neuroepiteliais (NE) (D). CA: cartilagem; BM: medula óssea; MS: músculo, EEP: epitélio endodérmico. ST: túbulos seminíferos; BV: vaso sanguíneo. Secções de testículos de 4 semanas de idade irradiado (E) e os ratos contol (F) sem TGCT mostrando espermatogênese qualitativamente normais. Bar: 0,5 cm de A B, e 50 mm no C-F.

A dose de DES dada foi eficaz em agir sobre o embrião como ele causou criptorquidia em 16% dos testículos. No entanto, não havia nenhuma indicação de que cancro induzido (apenas 3 de 24 testículos analisados ​​continha TGCTs). Da mesma forma, em um estudo envolvendo o tratamento de grávidas 129 ratos, uma dose de etinilestradiol que aumentou criptorquidismo na descendência não induziram uma mudança significativa na incidência de teratomas [21].

Em contraste, a irradiação dos machos durante o desenvolvimento fetal, com duas doses cada de 0,8 Gy, levou a TGCTs em 80% dos testículos (em comparação com 28% no controlo) e em 100% da descendência masculina (Tabela 2). Os números de ratinhos com tumores unilaterais ou bilaterais em todos os grupos foram distribuídos binomial, confirmando um relatório anterior que a ocorrência de um tumor em cada testículo foi um evento independente [18]. Os pesos dos testículos com TGCTs e a percentagem de tumores que foram confirmados teratomas foram maiores nos ratos irradiados do que em controlos, indicando que a irradiação induziu tumores mais agressivos e /ou mais focos de locais de iniciação em cada testículo

.

as duas doses de radiação de 0,8 Gy não interromper a espermatogénese, que era qualitativamente normal em testículos que não continham teratoma (Figura 1E e F). No entanto, estes testículos livres de tumor de ratinhos irradiados apresentaram pesos reduzidos em comparação com os dos controlos (Tabela 2), sugerindo que a irradiação ter causado alguma perda ou a inibição da proliferação de PGCs e /ou de células somáticas.

Discussão

no presente estudo, inequivocamente demonstrado que a exposição à radiação fetal durante E10.5-E11.5 induz cânceres de células germinativas testiculares, a maioria dos quais mostram as múltiplas origens dérmicos típicos de teratomas, em um modelo geneticamente suscetíveis mouse. Esta é a primeira demonstração de indução de cancro testicular por um agente ambiental quando exposto durante período embrionário. Melhor caracterização do modelo para determinar o tempo ideal de exposição ou intervalos, a dose-resposta e os efeitos sobre estirpes menos susceptíveis de mouse é necessário para iniciar estudos sobre os mecanismos e estimativa do risco.

A constatação de que a radiação aumentou dramaticamente a incidência de cancro testicular em murganhos oferece uma nova ferramenta para investigar o mecanismo pelo qual as PGC reverter para células embrionárias pluripotentes. Quando PGCs do mouse chegar na gônada em E10.5, eles são potencialmente pluripotentes. No entanto, durante o dia 15,5, eles são gonócitos e suprimiram a expressão de genes de pluripotência (

Oct4, Nanog

,

Sox2

), interrupção do ciclo celular submetido, estão expressando genes de células germinativas (

Nanos3, Dazl, Dnd1, Mvh

) [22], [23], e estão comprometidos com a auto-renovação das células germinativas e via de diferenciação [12]. Entre os dias E10.5 11,5 eles sofrem alterações epigenética que incluem tanto desmetilação de ADN global que envolve quebras de cadeia simples (SSB) e activação da via de reparação de base-excisão com a localização da cromatina das proteínas envolvidas, bem como cromatina remodelação envolve a perda e substituição de histonas e alterações em suas modificações [24]. A radiação ionizante induz-se um maior número de BAAs e produz bases danificadas. Esta lesão induzida por radiação pode perturbar vias envolvendo BAAs endógenos e reparação de excisão de base-regulam esta transformação epigenética sinalização e permitir que as células conservam pluripotência como células estaminais embrionárias semelhantes que formam posteriormente os TGCTs

.

alterações genéticas em Anteriormente células germinativas, incluindo o

Ter

mutação no gene

Dnd1

[25], a perda de

Dmrt1

[14], ou a perda de

Pten

[26] produziu uma alta incidência de TGCTs (particularmente teratomas) em ratinhos. A análise das alterações na expressão destes genes ou produtos de genes em PGCs e gon�itos de embriões de ratinhos irradiados poderá elucidar o mecanismo pelo qual a radiação actua para induzir os tumores.

Embora a extrapolação dos teratomas em ratos para o tumores testiculares esporádicos em jovens adultos machos humanos ainda é discutível, os resultados apresentados no

in utero

irradiação de camundongos sugerem que o feto masculino de mulheres expostas à radiação em cerca de 5-6 semanas de gravidez pode estar em um aumento risco de desenvolver cancro testicular. Os estudos de coorte não são susceptíveis de ser capaz de testar se existe uma associação entre essa exposição e câncer de testículo desde doses de raios-X em procedimentos de diagnóstico têm vindo a diminuir [9], o número de mulheres grávidas em populações expostas à radiação são pequenos [10] , é provável que exista uma janela de desenvolvimento limitado de sensibilidade, a incidência de cancro do testículo humano na é baixa, e várias décadas decorrer entre a exposição e o aparecimento de tumores. No entanto, existe um relato de uma associação entre a exposição à radiação ionizante materna durante a gravidez e câncer de testículo em sua prole [11]. O conhecimento adquirido sobre os mecanismos de ionizante câncer testicular induzida por radiação em camundongos podem ser usados ​​para identificar outros fatores ambientais ou de estilo de vida que podem causar danos semelhantes às células germinais fetais e ser responsável por a corrente aumenta em incidência de câncer testicular nos homens.

Materiais e Métodos

Ratos e reprodução

a descreveu recentemente inato, estirpe congênica rato, 129.MOLF-L1 [19], referido como foi utilizado L1. Estes foram provenientes de cruzamentos entre a linhagem 129 (129S1 /SvImJ) e ratinhos consanguíneos Molf /Ei do

Mus m. molossinus subespécie

mouse. Para criar camundongos L1 129 ratos consomic com ratos Molf-CHR19 foram retrocruzado a 129, a seleção de uma região de 7,6 Mb do cromossoma Molf 19, e depois fez homozigotos para a região Molf derivado pelo cruzamento da descendência. foram relatados cerca de 30% dos machos L1 para desenvolver tumores testiculares espontâneas e os genes que contribuem para esta molf elevada incidência de tumores não são ainda conhecidos [19].

temporizadas acasalamentos foram realizadas com ratinhos pares de L1. fêmeas grávidas no dia 10.5 e 11.5 da gravidez foram tratados com duas doses diárias de o agente químico ou físico, tal como descrito abaixo. Em alguns casos, foram utilizadas fêmeas para uma segunda ou terceira rodada de tratamentos durante a gravidez consecutivos com um período de espera de algumas semanas entre as gestações. Em tais casos de múltiplos tratamentos, as fêmeas grávidas receberam o mesmo agente ou que receberam tratamento de controle em cada gravidez.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do MD Anderson Cancer Center institucional com números de protocolo aprovados 110712631 e 110712632. Todas as instalações para alojar os animais são registrados pelo USDA e credenciada pela Associação americana para o Acreditação do Laboratório animal Care.

Tratamentos

Flutamida.

Flutamida (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), dissolvido em óleo de sésamo /etanol absoluto (01:01), foi administrado por via subcutânea em 2 doses de 40 mg /kg. Esta dose foi mostrado para bloquear a acção dos androgénios, em ratos do sexo masculino [27] e é mais elevada do que a dose clínica humana diária oral de ~ 10 mg /kg.

dietilestilbestrol (DES).

DES (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), dissolvido em óleo de milho, foi administrado por via subcutânea em duas doses de 5 mg /kg. ratinhas grávidas de controlo receberam apenas o veículo. Baseado em um relatório anterior [28], foram realizados experimentos iniciais com duas doses de 20 mg /kg, mas reduziu a dose após muitas das fêmeas grávidas não conseguiu entregar prole.

Radiation.

camundongos L1 fêmeas grávidas foram irradiadas com radiação Co

60-gama (Eldorado 8 unidade de radiação, Atomic Energy of Canada Ltd., Ottawa, Canadá). Um máximo de 3 ratinhos não anestesiados de cada vez foram colocadas numa caixa de metacrilato ventilado (4,1 cm × 11,7 cm x 8,2 cm) sobre uma base de um mínimo de 13 cm de madeira prensada, a uma distância de 80 cm da fonte de radiação. Com um tamanho de campo de 20 × 20 cm, uma dose de 0,8 Gy de radiação total corporal foi administrado a 11/10 AM em dias 10,5 e 11,5 de gravidez a uma taxa de dose de cerca de 70 cGy /min. As barragens de controle L1 da mesma colônia de reprodução não recebeu qualquer um destes tratamentos ou manipulações e os descendentes do sexo masculino a partir destes ratos foram analisados ​​simultaneamente com os de os tratados.

Análise

O

in utero

exposta e controlar descendência masculina no braço flutamida foram sacrificados com a idade de 4-5 semanas; os machos de controlo e expostas a radiação e em braços DES foram sacrificados com a idade de 4 semanas. Desta vez foi escolhida por tumores em camundongos L1 são visualmente observados nestas idades [19]. Os testículos foram examinados quanto à presença de tumores por meio de observação visual e, em seguida, fixados em solução de Bouin para exame histológico. Como alguns pequenos tumores não eram evidentes por exame visual todos os tumores foram identificados por análise de hematoxilina e secções de 5 mícrons manchado-eosina. Os tumores com tecidos de vários tipos dérmicos foram reconhecidos como teratomas. Sempre que, a seção de testículo inicial continha apenas as células gliais cancerosas, os blocos foram re-seccionado para identificar ou descartar a presença de outros tipos de tecidos cancerosos em outros locais.

Análise Estatística

Os dados são apresentados como média ± SEM. A significância das diferenças entre os pesos dos testículos de ratos da mesma idade foi avaliada por um de Student

t

-test. A significância das diferenças na frequência de TGCTs entre os ratos tratados e de controlo foi determinada utilizando o teste do qui-quadrado.

Reconhecimentos

Agradecemos Walter Pagel (MD Anderson Cancer Center) para obter assistência editorial .