Abstract
O surgimento de câncer de próstata castração-resistente (CRPC) contribui para a elevada mortalidade de pacientes diagnosticados com câncer de próstata (APC), que em parte pode ser atribuída à existência e ao surgimento de câncer células estaminais (CSCs). Estudos recentes têm mostrado que a expressão desregulada de microARNs (miARNs) contribui para a iniciação e progressão de CaP. Entre vários miARNs conhecidos, deixou-7 família parece desempenhar um papel chave na recidiva e progressão de CaP regulando CSCs; No entanto, o mecanismo pelo qual a família deixou-7 contribui para CaP agressividade não é clara. Enhancer de Zeste homólogo 2 (EZH2), um alvo putativo da família deixou-7, foi demonstrada para controlar a função das células estaminais. Neste estudo, verificou-se perda da família let-7 com os correspondentes sobre-expressão de EZH2 em amostras de tecido CaP humanos, especialmente nos tumores do grau de Gleason mais elevadas. A sobre-expressão de let-7 por transfecção de let-7 precursores diminuição da expressão EZH2 e reprimido clonogénico capacidade e a capacidade de formação de esfera de células APC, que foi consistente com a inibição da actividade da luciferase EZH2 3’UTR. Nós também descobrimos que o tratamento de células APC com a BR-DIM (DIM formulado: 3,3? Diindolylmethane pela Bio Response, Boulder, CO, abreviado como BR-DIM)-regulada deixá-7 e sub-regulada expressão EZH2, consistente com a inibição da auto-renovação e capacidade clonogénico. Além disso, a intervenção BR-DIM na nossa fase II de ensaios clínicos em curso em pacientes antes da prostatectomia radical mostrou regulação positiva de let-7 consistente com a infra-regulação da expressão de EZH2 em amostras de tecido CaP após a intervenção BR-DIM. Estes resultados sugerem que a perda de deixá-7 mediada por um aumento da expressão de EZH2 contribui para CaP agressividade, o que pode ser atenuado por tratamento BR-DIM, e, assim, BR-DIM é susceptível de ter impacto clínico
citação.: Kong D, Heath E, Chen W, Cher ML, Powell I, Heilbrun L, et al. (2012) Perda de let-7-regula EZH2 em Câncer de Próstata Consistente com a aquisição da Cancer Stem assinaturas celulares que são atenuados pela BR-DIM. PLoS ONE 7 (3): e33729. doi: 10.1371 /journal.pone.0033729
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 15 de novembro de 2011; Aceito: 16 de fevereiro de 2012; Publicação: 19 de março de 2012
Direitos de autor: © 2012 Kong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA108535-06 e 5R01CA083695-08) atribuído à FHS. (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de morte por câncer em homens nos Estados Unidos matando mais de 32.050 homens em 2010 [1]. Nos últimos dez anos, tem havido melhorias significativas nas opções de tratamento cirúrgico para pacientes com diagnóstico de CaP localizado. A cirurgia da próstata também tem beneficiado de avanços técnicos e tecnológicos, tais como nervo prostatectomia e prostatectomia robótica. A terapia adjuvante, definido como tratamento adicional para reduzir ou eliminar a doença local e distante, é oferecido aos pacientes [2], especialmente aqueles que estão em alto risco de recorrência (como muitas vezes definida pelos critérios de D’Amico de PSA 20 ng /mL, Gleason 8-10, e estágio T2c a T4) [3].
a terapia de radiação e terapia sistêmica especialmente andrógeno terapia de privação (ADT) são considerados como opções terapêuticas adjuvantes razoáveis. Os doentes na categoria de alto risco tem uma taxa de recorrência de maior do que 50% dentro de sua vida, o que é inaceitável. No entanto, uma das preocupações em oferecer terapia adjuvante para todos os pacientes no grupo de alto risco é que, embora mais de 50% dos pacientes se repitam, há 38-50% dos pacientes que não [4]. Para reduzir a carga de excesso de tratamento neste grupo de doentes, ferramentas adicionais são necessários para identificar os pacientes de alto risco verdadeiramente. ferramentas atuais que estão sendo estudados incluem nomograms preditivos [5] e estudos avaliando perfil de expressão gênica, que identificaram alguns marcadores de agressividade do tumor [6], [7] embora tais resultados não foram traduzidos no manejo do paciente.
Uma vez que a recorrência de tumores e metástases contribuir para a elevada taxa de mortalidade, estudos têm sugerido que a agressividade do CaP poderia ser firmemente ligada com a aquisição de cancro de células estaminais (CSC) ou de células estaminais-like (CSLCs) características cancerosas. Novas evidências sugerem que a expressão desregulada de muitos microRNAs (miRNAs), incluindo a família let-7 contribui para a progressão e recorrência do câncer [8]. MicroRNAs são uma classe de ARN de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos não codificantes em tamanho. Eles regulam expressão dos genes de pós-transcricionalmente através da ligação a um local na região 3’untranslated (UTR 3 ‘) do ARNm alvo. Eles têm sido demonstrados para regular o ciclo celular, e o desenvolvimento e progressão do cancro [9]. Deixe-7 foi descoberto em primeiro lugar e bem estudado em Caenorhabditis elegans. let-7 A família humana consiste em deixar-7a, deixe-7b, deixe-7c, deixe-7d, deixe-7e, deixe-7F, deixe-7g, deixe-7i e miR-98. A família deixou-7 é normalmente visto como um supressor do tumor consistente com a sub-regulação de oncogenes tais como Ras [10], o grupo de alta mobilidade A2 (HMGA2) [11] e c-myc [12], através da ligação a da 3’UTR esses mRNAs alvo. Além disso, diminuiu let-7 expressão foi encontradas em muitos cancros, incluindo CaP [13], e que tem sido associada com o mau prognóstico do paciente no cancro do pulmão [14], cabeça e carcinoma de células escamosas pescoço [15], e cancro do ovário [16 ].
Curiosamente, permitem-7 membros da família têm sido demonstrados para regular a capacidade de auto-renovação das células de câncer de mama [17] e células CaP regulando fatores associados a células estaminais, como Oct4, Sox2 e Nanog expressão [18]. Estudos recentes têm também documentado que deixe-7 pode regular a expressão de Lin28 e Lin28B, que por sua vez bloquear a acumulação de madura let-7 [19]. Esta regulação por feedback desempenha um papel crítico na regulação “stemness” por meio do controle de auto-renovação [20] – [23], que é a característica celular de CSCs ou CSLCs associados com a agressividade do tumor e a recorrência. Estes resultados sugerem que a família let-7 poderia desempenhar um papel essencial na progressão do CaP por manter e regular as características moleculares de CSCs ou CSLCs em APC; no entanto, como deixá-7 família contribui para CaP agressividade é desconhecida.
Enhancer de Zeste homólogo 2 (EZH2) é um dos alvos da família deixá-7 de miRNAs, e que a expressão de EZH2 é fortemente associado com características moleculares de ambas as células-tronco normais e CSCs ou CSLCs. EZH2 é uma N-metiltransferase histona-lisina, uma subunidade do complexo repressor Polycomb 2 (PRC2). O grupo Polycomb de proteínas são conhecidas por estarem envolvidas na regulação da repressão do gene através de modificações da cromatina, o que é essencial para a manutenção das células estaminais embrionárias e adultas [24], [25]. PRC2 contém subunidades EZH2, Suz12, EED, e RBAP e este complexo é conhecida por funcionar nas células estaminais embrionárias e adultos para reprimir genes de desenvolvimento que são preferencialmente activados durante a diferenciação [26]. Além disso, outros estudos mostraram que os genes-alvo são co-PRC2 ocupada pelos reguladores de células estaminais tal como Oct4, Sox2, Nanog e [27]. Estudos recentes também sugerem que as proteínas do grupo Polycomb não são apenas essenciais para o desenvolvimento embrionário, mas também desempenha um papel crítico na iniciação e progressão tumoral [25]. Sobre-expressão de EZH2 tem sido fortemente relacionada com a progressão do cancro em parte porque PRC2 inibe a expressão da caderina-E, que promove epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) em células de câncer [28], um fenômeno que é uma reminiscência de CSCs ou CSLCs. Suz12 foi encontrado para mediar a inibição por E-caderina snail1 [29]. Mais importante, EZH2 regula diretamente a metilação do DNA, servindo como uma plataforma de recrutamento de DNA metiltransferase [30]. Em nosso estudo anterior, verificou-se que os níveis de EZH2 e mRNA Suz12 foram aumentadas no PC3 células PDGF-D (células EMT-fenotípica) em comparação com células PC3 Neo [18]. Estes resultados sugerem claramente que PRC2 pode contribuir para EMT características de células PC3 PDGF-D, que são consistentes com as assinaturas de CSCs ou CSLCs que estão associados com a progressão e recorrência do câncer.
estudos pré-clínicos anteriores de nosso laboratório têm mostrado que indole-3-carbinol (I3C) encontrados em vegetais crucíferos e sua
in vivo
metabólito 3,3-diindolylmethane (DIM) especialmente o formulado DIM (BR-DIM ou B-DIM) que foram utilizados para o nosso estudo clínico fase I [31], são agentes potentes na inibição do crescimento de células APC, que foi mediada por alterações na sinalização celular múltipla [32]. Os nossos resultados mais recentes mostraram que a BR-DIM causada regulação positiva de miR-200b e 200c-miR que são tipicamente perdido em células CaP [33]. No presente estudo, verificou-se perda de expressão de let-7 família consistente com a sobre-expressão EZH2 em CaP células e em tecidos CaP humanos, especialmente em tumores com maior grau de Gleason. Os resultados da análise de correlação mostrou que let-7 de expressão foi inversamente associado com expressão EZH2 em pacientes com tumores de grau de Gleason mais elevadas. Aqui nós também fornecemos evidências para o papel da BR-DIM (DIM formulado: 3,3? Diindolylmethane, abreviado como quer BR-DIM ou B-DIM) na regulação da let-7 e EZH2 em células CaP conforme documentado pela nossa achados pré-clínicos, bem como resultados de nossa fase II de ensaios clínicos em curso em pacientes CaP recebeu BR-DIM antes da prostatectomia radical.
Materiais e Métodos
linhas de células e condições de cultura
LNCaP, C4-2B, e CWR22RV1 foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 10 mmol /L de Hepes, 50 unidades /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina. linhas de células estáveis que sobre-expressam PDGF-D e vector pcDNA3 vazios foram gerados por transfecção de células PC3 com pcDNA3-FCDP-D: His ou correspondente vector vazio pcDNA3 Neo como anteriormente descrito e referido como PC3 neo, ou PC3 PDGF-D células [34], respectivamente, em todo o manuscrito. O PC3 Neo, PC3 PDGF-D, PC3, células DU145 foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 2 mmol /L de glutamina, 10 mmol /L de Hepes (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 50 unidades /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina. células RWPE-1 PZ-HPV-7 e foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). Estas células foram cultivadas em meio de soro livre de queratinócitos (K-SFM) fornecido pela Invitrogen (GIBCO) e fornecido com 0,05 mg /ml de extracto de pituitária de bovino (BPE) e 5 ng /ml de factor de crescimento humano recombinante epidérmico (EGF). Todas as células foram mantidas numa atmosfera de 5% de CO
2-atmosfera humidificada a 37 ° C, e caracterizado genotipicamente para apoiar a autenticidade destas células, o que era consistente com a sua origem.
Reagentes e anticorpos
Anticorpo contra EZH2 foi adquirido a BD Biosciences (Bedford, MA). Anticorpo para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi adquirido a partir de afinidade BioReagents (dourados, CO). IgG de cabra (H + L) conjugado anti-rato -HRP foram obtidos a partir de Bio-Rad (Reinach, BL). BR-DIM, um DIM formulado com biodisponibilidade mais elevada, foi amavelmente fornecido pelo Dr. Michael Zeligs (abreviado como BR-DIM ou B-DIM; Bio resposta, Boulder, CO) e foi dissolvido em DMSO para fazer soluções de 50 mmol L Stock /e armazenadas a -20 ° C em várias alíquotas de
in vitro
estudo.
declaração Ética
tecidos dos pacientes foram coletadas após receberem a aprovação da Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Este protocolo clínico é classificado como isento # 4 categorias no âmbito da política NIH porque tais estudos são estudos retrospectivos utilizando amostra de arquivo. O IRB dispensou a necessidade de consentimento para o uso das amostras de arquivo, o que era consistente com as diretrizes do NIH, e as amostras foram analisadas de forma anónima. amostras de tecido CaP de nosso contínuo ensaio clínico de intervenção antes da prostatectomia radical, também foram obtidos após receber a aprovação da Wayne State University Institutional Review Board (IRB) e consentimentos informados foram obtidos de todos os sujeitos do estudo BR-DIM (B-DIM). Como este estudo é um ensaio clínico convencional, o processo IRB exigida por escrito consentimento de pacientes antes de provisionar para o ensaio clínico, que é rotineiramente coordenado através do escritório de ensaios clínicos (CTO). A aprovação através implica IRB cumpram consentir e competência, sem o qual os pacientes não podem ser incluídos no estudo, e, portanto, nosso estudo cumprido todas as diretrizes de conformidade requeridos do CTO eo IRB. O número de protocolo de ensaio clínico local é 2007-128, que pode ser encontrado no trials.gov clínico NIH. (https://clinicaltrials.gov/show/NCT00888654). No momento da aquisição de amostras para a investigação atual, o protocolo do estudo acumulados 20 pacientes; No entanto, o estudo tem agora acumulado um total de 33 pacientes. Prevê-se que vamos fechar este estudo com 37 pacientes no início de 2012.
Pacientes e tecido da próstata coleta da amostra
Depois de obter a aprovação de revisão institucional, retrospectivas de pré-tratamento de arquivo tecidos APC e combinados tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir Biospecimen Núcleo do Karmanos Cancer Institute (KCI) coletadas de pacientes submetidos à prostatectomia radical 2004-2010 na KCI. Nós também obteve amostras de tecido CaP da nossa em curso ensaios clínicos de intervenção BR-DIM (B-DIM) antes da prostatectomia radical dos pacientes CaP recém-diagnosticados entre 2009-2011 a KCI e Henry Ford Health System (HFHS), Detroit, Michigan . Fixadas em formalina (FFPE) tecidos embebidos em parafina foram cortados para análise miRNA e mRNA. características clínicas dos pacientes foram obtidas a partir do banco de dados do hospital, incluindo raça, como mostrado na Tabela 1. As características patológicas foram determinados a partir de avaliação microscópica de lâminas de tumor por patologistas, tanto a KCI e em HFHS. escore de Gleason (grau) foi obtida em cada caso, a partir da base de dados clínicos.
ensaio clonogênica
C4-2B, PC3 PDGF-D, e as células PC3 PDGF-D transfectadas com o deixar-7 família de 24 h foram recolhidos após tripsinização, e re-suspensos em meio completo. As suspensões de células únicas regulares foram plaqueadas em 10 cm de diâmetro em placas de Petri a densidade de colónias de 2.000 células por prato. Após 2-3 semanas de incubação com a mudança de meio fresco a cada 3-4 dias, as colónias foram coradas com violeta cristal durante um adicional de 10 min, e lavou-se com 1 x PBS. As colônias foram fotografados.
macio agar ensaio
células C4-2B foram colhidas e suspensas em meio de cultura. ensaio de agar mole foi realizado como descrito anteriormente pelo nosso laboratório [18]. As células foram tratadas com 10 ou 25? M BR-DIM com a mudança de meio fresco com a BR-DIM a cada 3 dias. Depois de três semanas de crescimento, as colónias foram coradas por incubação com 0,5 mg /ml de MTT durante 4 horas, e, em seguida, foram fotografadas (40 vezes). Os números de colónias foram contadas sob um microscópio de contraste de fase. Os dados foram apresentados como números de colônia (controle%).
auto-renovação ensaio de capacidade
suspensões de células individuais de C4-2B e células PC3 PDGF-D foram semeadas em ultra-baixas de poços aderentes de 6 bem placas (Corning, Lowell, MA) a 2000 células /poço em DMEM /F12 (Invitrogen), contendo 1 × B27 e N2 (Invitrogen). status de uma única célula foi confirmado sob o microscópio. Meio fresco com 10 ou 25? M foi adicionado a cada 3-4 dias. Depois de uma semana, o número de prostaspheres foram contadas sob um microscópio e os dados foram apresentados como números de esfera por 1000 células semeadas. Prostaspheres foram fotografados (40 vezes) sob um microscópio de contraste de fase.
Western blot análise
Total de lisados de células foram obtidas por lise das células em tampão RIPA. A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [35].
miARN e transfecção
As células foram transfectadas com 40 nmol /L de deixá-7 precursores ou miARN precursores controlo negativo # 1 (Ambion, Austin , TX) usando o reagente de transfecção DharmaFECT3 (Dharmacon, Lafayette, CO). Depois de um dia da transfecção, as células foram trypsonized, e re-suspensos em meio completo. As suspensões de células individuais foram confirmados sob um microscópio para ensaio clonogénico. Além disso, após 3 dias de transfecção, foram preparados os lisados celulares por análise de Western blot.
luciferase actividade ensaio
células PC3 PDGF-D com níveis mais baixos de deixá-7 foram semeadas numa densidade de 6 x 10
3 células /cavidade em uma placa de 96 poços e incubou-se durante 24 h. As células foram co-transfectadas com o plasmídeo de luciferase EZH2 3’UTR (Origene, Rockville, MD) ou de Renilla luciferase plasmídeo e controlar miARN, let-7a, deixou-7b, deixou-7c, 7d e deixou-precursores utilizando o reagente de transfecção dupla DharmaFECT (Dharmacon, Lafayette, CO). Após 48 h de incubação, a actividade de luciferase foi ensaiada utilizando Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega). A actividade da luciferase de Renilla foi utilizado como um controlo para a eficiência da transfecção.
em tempo real de RT-PCR
para determinar os níveis de ARNm, o ARN total a partir de células foi isolado utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen ) e o DNA foi removida usando um kit NDase livre de ARNase (Qiagen). Um micrograma de RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando uma alta capacidade (Applied Biosystems, Fostor, CA) RNA-to-cDNA kit de acordo com as instruções do fabricante. O PCR foi realizado como anteriormente descrito [18]. A quantidade relativa de ARNm foi normalizado para a expressão de GAPDH. Para testar os níveis de miARN, o ARN total a partir de células foi isolado utilizando o Kit de miRNeasy Mini (Qiagen) e o DNA foi removida usando um kit NDase livre de ARNase (Qiagen). 20 ng de ARN foram transcritas inversa em ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc Universal (Exiqon, Woburn, MA) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizado utilizando os iniciadores específicos de miARN (Exiqon) para quantificar a expressão de miARN usando SYBR® verdes de RT-PCR Reagentes (Applied Biosystems). A quantidade relativa de miARN foi normalizado para a expressão de RNU48. Para determinar os níveis de ARNm ou de miARN no cancro da próstata tecidos do paciente, o ARN total foi isolado a partir de tecidos FFPE utilizando o kit miRNeasy FFPE (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. ensaio de RT-PCR para a expressão de ARNm de miARN e foi avaliado como acima. A quantidade relativa de ARNm foi normalizado para a expressão de beta-actina e da quantidade relativa de miARN foi normalizado para a expressão de RNU1A.
Microarray para o perfil de miARN em tecidos de cancro da próstata de pacientes
miARN microarray assim como análise de dados foram realizadas seguindo os procedimentos tal como anteriormente descrito por Kong et al [18].
Todos os dados são compatíveis Miame e que os dados em bruto foi depositada num banco de dados compatível Miame. número de acesso GEO é GSE34310.
Métodos estatísticos
Experimentos apresentados nas figuras para estudos de linha de células são representativos de três ou mais independentes repetições. Os dados são apresentados como média e desvio padrão (SD) nos gráficos de barras. Os dados de miRNA e mRNA de amostra de tecido do paciente foi log transformado antes da análise. As comparações das variáveis contínuas entre dois grupos independentes foram feitas usando o teste de Wilcoxon. Para grupos relacionados emparelhados (isto é, tecidos normais e tumorais G6 emparelhados), o Wilcoxon assinado foi usada rank. correlações de Spearman foram utilizados para descrever a força de relação linear entre duas variáveis. teste de significância estatística da correlação foi baseada em uma aproximação
t
distribuição. Todos os testes estatísticos foram bicaudais com nível de significância de 0,05, a menos que especificado em contrário. Para reduzir a falsa positividade, em outras palavras, controlar o erro de tipo I family-sábio, neste estudo exploratório fase inicial preliminar, foram utilizados os valores de p ajustado a partir do índice de falso step-up de dois estágios de descoberta (FDR) Método controlar [36] . A taxa de erro nominal para estimar o número de verdadeiras hipóteses de nulidade no procedimento FDR em duas etapas foi de 0,05.
Resultados
Expressão da família deixá-7 foi perdido no câncer de próstata ( PCA) amostras de tecido
para determinar os níveis de a família deixe-7 em amostras de tecido APC, foram coletadas pré-tratamento tecidos APC e amostras emparelhadas adjacentes normais de tecido (utilizados como controle para comparação com os tecidos tumorais). Os resultados de expressão de miARN por perfil de expressão mircroarray mostraram que todos os membros da família let-7 (miR-98 era indetectável) decresceu nos tecidos de CaP em comparação com amostras de tecidos normais adjacentes (Fig. 1A). Além disso, verificou-se que a expressão de let-7a, deixe-7b, deixe-7c e deixe-7d foram precisão mensurável em comparação com outros membros da família, porque as suas expressões eram muito baixos (Fig. 1A). Portanto, nós determinamos e confirmou as expressões de let-7a, deixe-7b, deixe-7c, e deixe-7d em todos os casos, incluindo 129 amostras de tecido APC e das 94 amostras de tecidos normais adjacentes. Descobrimos que a expressão da família let-7 em tecidos histologicamente normais da próstata a partir do grau de Gleason 7 ou superior do tumor foi reduzida em comparação com o tecido normal histologicamente de Gleason de grau 6 tumores (dados não mostrados), sugerindo que os tecidos histologicamente normais da próstata glândula de pacientes com tumores de grau superior não são normais. Assim, tomamos normal a partir da próstata de todos os pacientes diagnosticados com grau 6 tumores para análise e usou isso como “controlo de tecido normal”. Observou-se que as expressões da família let-7 em 6 tumores de grau não são estatisticamente diferentes em relação ao controle normal. No entanto, encontramos uma diminuição significativa expressão de deixá-7a, deixe-7b, let7c e deixe-7d no APC com o grau de Gleason 7 ou superior tumores em relação ao controle de tecido normal (Fig. 1B). Estes resultados sugerem que a perda da família deixá-7 pode estar associada com PCA agressividade especialmente porque os tumores de grau inferior não eram diferentes do controlo de tecido normal, enquanto que os tumores de grau superior eram diferentes.
(A) Microarray profiling foi feito para avaliar a expressão de miRNA usando RNA total extraído de três amostras de tecido APC e tecidos da próstata normais adjacentes combinados. Os resultados mostraram que let-7a, deixou-7b, deixou-7c e deixou-7D foi altamente expressa em tecidos da próstata e a sua expressão foi perdido em espécimes de tecidos de CaP humanos (* P 0,05, ** p 0,01). (B) Os resultados de tempo real, RT-PCR confirmaram que os níveis de let-7b, deixe-7c e deixe-7d foram significativamente regulada em tumores com maior grau de Gleason. (7a: deixe-7a; N: normal; TG6: tecidos tumorais de pacientes com Gleason grau 6. n = 39 para normal, n = 44 para TG6, n = 52 para TG7, n = 33 para TG8, 9). (C) Uma significante sobre-regulação da expressão de EZH2 foi observada em amostras de tecido APC com Gleason de grau 7 (n = 46) e superior (n = 33), mas não em CaP espécimes com Gleason de grau 6 (n = 39) . (D) os níveis de EZH2 foram inversamente correlacionados com let-7b e deixe-7C expressões em amostras tumorais com grau de Gleason 7.
A expressão de EZH2 foi aumentada em amostras de tecido APC e foi inversamente correlacionada com a expressão do let-7 família
uma vez que a expressão da família deixá-7 foi perdido em tecidos PCA pacientes com maior grau de Gleason, ele levanta uma questão de como a família deixe-7 poderia regular CaP agressividade. Temos procurado alvos da família let-7 usando o software TargetScan e descobrimos que EZH2 poderia ser regulada pela família let-7 porque há um local de ligação específico no 3’UTR do mRNA EZH2. Assim, avaliamos a expressão de mRNA EZH2 em tecidos APC. Nossos resultados mostraram que a expressão EZH2 foi aumentada em amostras de tecido APC com o Gleason grau 7 e mais elevado em comparação com o controlo normal de tecidos (Fig. 1C). A expressão de let-7b e deixe-7c foi inversamente correlacionada com a expressão EZH2 com r = -0,36 (IC 95%: -0,61 a -0,06), p = 0,0414 e r = -0,43 (IC 95%: -0,65 a – 0,15), p = 0,0132, respectivamente (Fig. 1D). Estes resultados sugerem que a perda de deixá-7 poderia ser responsável pelo aumento da expressão de EZH2.
let-7 expressão reprimida EZH2 e o crescimento clonogénico inibida de células CaP
Foi examinada a expressão de EZH2 em linhas de células APC e linhas celulares imortalizadas epiteliais de próstata, e descobriram que EZH2 foi expressa em células de cancro da próstata em níveis relativamente mais elevados em comparação com linhas de células epiteliais da próstata imortalizadas: PZ-HPV-7 e células RWPE-1 (Figura 2A, painel superior. ). Para determinar a consequência biológica da expressão família let-7 na regulação da expressão de EZH2, nós transfectadas células PC3 e PC3 PDGD-D com let-7 precursores, e os resultados mostraram que let-7 membros da família poderia significativamente inibir a expressão de EZH2 nestas duas linhas celulares (Fig. 2A, o meio e o painel inferior). Estes resultados sugerem que a família deixou-7 regula a expressão de EZH2. A fim de obter uma visão mais mecanicista, testámos se deixe-7 pode reprimir directamente a expressão de EZH2 por ligação a 3’UTR do ARNm de EZH2. Nós co-transfectadas EZH2 3’UTR plasmídeo de luciferase e deixou-7 precursores, e descobriram que let-7a, deixou-7b, deixou-7c, e deixou-7b poderia inibir fortemente a actividade de luciferase em comparação com EZH2 3’UTR transfecção de células com miARN controlo (Fig. 2B). O let-7 sites na 3’UTR do ARNm EZH2 de ligação são apresentados na Figura 2C. Em seguida, testamos a consequência biológica de células transfectadas com pré deixá-7 família e avaliou o crescimento clonogênica como uma medida indireta
in vitro
de agressividade do tumor. Verificou-se que a sobre-expressão de let-7 família inibiu significativamente o crescimento clonogénico de células PC3 PDGF-D, que mostrou inicialmente menor expressão de let-7 (Fig. 2D). No entanto, actualmente não há nenhum método que pudesse ser clinicamente úteis para a regulação positiva de miARNs perdidos. Para esse fim, testámos a nossa hipótese testando se BR-DIM podem ser úteis para a regulação positiva de miARN.
(A) Expressão de EZH2 foi encontrada para ser mais elevada em linhas celulares de CaP em comparação com a de células epiteliais da próstata imortalizadas linhas: PZ-HPV-7 e RWPE-1 (painel superior) e a transfecção de deixá-7 precursores inibiram a expressão da EZH2 em PC3 e células PC3 PDGF-D 3 dias após a transfecção (média e o painel inferior). (B) deixar-7 membros da família reprimido actividade de luciferase EZH2 3’UTR em células PC3 PDGF-D (níveis mais baixos de deixá-7 família nestas células) co-transfectadas com let-7 e EZH2 3’UTR plasmídeo de luciferase. (C) let-7 sites na 3’UTR do mRNA EZH2 de ligação foram mostrados. (D) A transfecção de let-7 precursores reduziu significativamente a capacidade de crescimento clonogênica de células PC3 PDGF-D (Con: controle, 7a: pré-let-7a, ** p 0,01)
BR. tratamento -DIM levou à regulação positiva da família let-7 e, consequentemente, regulada a expressão de EZH2 em células CaP
no presente estudo, verificou-se que o tratamento BR-DIM aumentou a expressão de let-7 família em várias linhas de células LNCaP CaP incluindo, C4-2B e células PC3 (Fig. 3A e a Fig. S1A-C). Além disso, o tratamento BR-DIM também levou à diminuição da expressão de ARNm de EZH2 (Fig. 3B) e proteína em diferentes linhas de células APC e em diferentes pontos de tempo (Fig. 3C, 3D e a Fig. S1D). Além disso, mais interessante, os dados de nossos contínuos de fase II de ensaios clínicos mostraram que o tratamento BR-DIM de pacientes CaP antes da prostatectomia radical levou a uma maior expressão de deixá-7a, deixe-7b, deixe-7c e let- 7d em espécimes de tumor após a intervenção BR-dim (Fig. 4A-C), e estes resultados são consistentes com a diminuição da expressão de EZH2 (Fig. 4D). Por conseguinte, os nossos resultados sugerem que a BR-DIM poderia ser um importante agente de re-expressam os miARNs perdidos especialmente a família deixou-7, o que iria reduzir o nível de expressão de EZH2 e de compromisso CSCs ou CSLCs função.
( a) o ARN total foi isolado a partir de células LNCaP, C4-2B e células PC3 tratadas com 25? M BR-DIM durante 24 h e os resultados de tempo real de RT-PCR que mostram que a expressão de let-7 foi aumentada após o tratamento BR-DIM comparado ao controlo não tratado (C: controlo de DMSO). (B) Os níveis de mRNA EZH2 foram reprimidos por tratamento BR-DIM em um fraco dependente da dose. (C e D) Os lisados celulares foram preparados a partir de células tratadas com BR-DIM durante 48 h e Western blot que mostra os níveis de proteína de EZH2, que foi regulada negativamente por tratamento BR-dim (PD PC3: células PDGF-D PC3, *, p 0,05; ** p . 0,01)
RNA foi obtido a partir de amostras de ensaios clínicos de intervenção BR-DIM, onde BR-DIM foi dado aos pacientes para 2-4 semanas antes da cirurgia . RNA também foi obtido a partir embebidos em parafina espécimes (FFPE) de tecidos fixados em formol de pacientes APC com o tumor combinado Gleason grau, estágio do tumor ea idade do paciente como grupo controle. A expressão de ARNm e miARNs foi avaliada em tempo real utilizando RT-PCR. níveis de miARN e ARNm relativos foram normalizados para RNU1A1 e beta-actina, respectivamente. (A) a intervenção BR-DIM levou à tendência de aumento nos níveis de expressão let-7-A. (B e C) let-7b, deixe-7c e deixe-7d foram significativamente up-regulamentada pela intervenção BR-DIM. (D) a expressão EZH2 foi regulada pela intervenção BR-DIM.
BR-DIM tratamento inibiu a auto-renovação e capacidade clonogênica de células CaP
Para testar se a BR-DIM poderia regular a capacidade de auto-renovação e capacidade de células clonogénicas, APC, foram realizados ensaios de formação de esferas e constatou que o tratamento de células PC3 C4-2B e PDGF-D com 10 ou 25? M BR-DIM marcadamente reduzido o número e o tamanho de prostaspheres em comparação com o controlo não tratado (controlo de DMSO) (Fig. 5A). Além disso, o tratamento BR-DIM também inibiu a capacidade de crescimento clonogénico de linhas celulares de CaP células PC3 C4-2B e PDGF-D (Fig. 5B). Os resultados de ensaio de agar mole mostrou ainda que o tratamento de células C4-2B com 10 ou 25? M BR-DIM reduziu o tamanho da colónia e número (Fig. 5C e 5D), o que sugere que a BR-DIM poderia eliminar as células tumorais especialmente as células com CSCs ou CSLCs características por se-regulação deixar-7 família e, consequentemente, pela regulação negativa da expressão de EZH2.
(a), as suspensões de células individuais de células PC3 C4-2B e PDGF-D foram plaqueadas em ultra- poços de baixo aderentes da placa de 6 poços a 2000 células /poço em DMEM /F12 suplementado com B27 e N2 e com 10, 25 ^ M BR-DIM e incubadas durante 6 dias. Prostasphere números foram reduzidos por tratamento BR-dim (painel superior).