Sumário

adrenomedulina (AM) é um peptídeo ácido 52-amino inicialmente isolado a partir de feocromocitoma humano. AM se expressa em uma variedade de tecidos e linhas de células malignas do cancro e mostrou ser um factor mitogénico capaz de estimular o crescimento de vários tipos de células de cancro. Além disso, AM é um factor de sobrevivência para certas células cancerosas. Alguns dados sugerem que AM pode estar envolvido na metástase do câncer progressão através de angiogênese e migração celular e controle de invasão. O receptor transiente potencial canal TRPV2 é conhecida por promover a migração de células do cancro da próstata e do fenótipo invasivo e está correlacionada com a fase e o grau do cancro da bexiga. Neste trabalho nós mostramos que AM induz próstata e migração de células de câncer urotelial e invasão através TRPV2 translocação para a membrana plasmática e ao consequente aumento descansando nível de cálcio

Citation:. Oulidi A, Bokhobza A, Gkika D, Vanden Abeele F, Lehen’kyi V, Ouafik L, et ai. (2013) TRPV2 Medeia adrenomedulina Estimulação da próstata e câncer urotelial adesão celular, migração e invasão. PLoS ONE 8 (5): e64885. doi: 10.1371 /journal.pone.0064885

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2013; Aceito: 19 de abril de 2013; Publicado em: 31 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Oulidi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale (INSERM), Ligue Nationale Contre Cancer le, Região Nord Pas de Calais e Université Catholique de Lille. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adrenomedulina (AM) é um péptido de 52 aminoácidos originalmente isolado a partir de um feocromocitoma humano [1] que tem propriedades reguladoras multifactoriais que variam de induzir vasodilatação para modular o crescimento celular [2]. As funções de AM são mediadas através de receptores específicos compreendendo receptor de calcitonina do tipo receptor (CLR) e uma proteína de modificar a actividade do receptor (SUBIDA); Quando co-expressa com Ramp2 ou RAMP3, CLR funciona como um receptor de AM específica [3]. AM e os seus receptores são altamente expressos em várias linhas celulares de cancro e nos cancros do pâncreas, pulmão, rim, mama, ovário e próstata. Um número de estudos têm implicado AM (segregada endogenamente ou exogenamente administrado) no crescimento do tumor, progressão e metástase através dos efeitos na angiogénese, proliferação celular, apoptose e migração [4] – [6]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a esses efeitos de AM no crescimento de células cancerosas e metástases permanecem contraditórias e pouco compreendida.

migração celular desempenha um papel central na invasão e metástase do cancro. Muitos dos componentes de máquinas migração celular são reguladas pelo cálcio intracelular (Ca

2+) concentração [7]. Uma parte essencial do sinal intracelular Ca

2 + é gerado pelo influxo transmembrana de Ca extracelular

2 + ocorre principalmente através de canais catiônicos com distintivo Ca

2 + seletividade. Em células não-excitáveis, Ca

2+ entrada é fornecida por canais iónicos que são activados por vários estímulos químicos e físicos. Alguns destes Ca

2 + canais de entrada são membros da “potencial de receptor transiente” (TRP) da família de canais catiônicos [8]. canais TRP foram relatados para ser envolvidos na carcinogénese [9] – [11], e, entre elas canal TRPV2, tem sido mostrado para ser especificamente implicado na progressão de cancros da próstata e da bexiga para o fenótipo mais agressivo. De fato, estudos recentes de nosso laboratório mostraram mostram que TRPV2 é expresso nas células cancerosas da próstata mais agressivos e estimula a migração e fenótipo invasivo destas células [12], [13]. Curiosamente, a expressão TRPV2 na bexiga também é mostrado para correlacionar com o grau e estágio do câncer [14], mas nada se sabe sobre o seu papel potencial no cancro da bexiga migração celular /invasão.

No presente trabalho, investigamos o envolvimento de TRPV2 no efeito de AM no processo de passos múltiplos de invasão em duas linhas celulares altamente invasivos: a células CaP (cancro da próstata), as células de UC (urotelial carcinoma) T24 /83 PC-3 e. Os nossos dados indicam que AM pode aumentar a adesão, migração e invasão por meio de quinase de adesão focal (FAK) e integrina β1 activação, e a estimulação da translocação TRPV2 para a membrana plasmática. Assim, nossos resultados fornecem novos insights sobre o papel do AM e TRPV2 na próstata e bexiga malignidades.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

O APC linha de células PC- humana 3 foi obtido a partir de ATCC e mantidas em cultura em meio RPMI 1640 (Life Technologies) suplementado com 10% de FCS e 5 mM de L-glutamina (Sigma). A linha celular de cancro urotelial T24 /83 foi obtido a partir de ECACC e mantidas em cultura em Glutamax® 5A de McCoy (Life Technologies) suplementado com 10% de FCS.

Transcrição Reversa-PCR

ARNm total foi isolado a partir de células como descrito anteriormente [12]. As condições de amplificação de ADN incluído um passo de desnaturação inicial de 7 minutos a 95 ° C; 35 ciclos de 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 60 ° C, e 30 seg a 72 ° C; e finalmente 7 minutos a 72 ° C. sequências e tamanhos de fragmentos de primers foi Ramp2: directo 5′-CTCAGCCTCTTCCCACCAC-3 ‘, reverso 5′-TTCCAGCAAAATTGGACAGC-3′, 84 pb; para RAMP3 5’-ATCTCGGTGCAGTTGGTGA-3 ‘e 5′-AAGGTGGACGTCTGGAAGTG-3′, 77 pb; para CLR 5’-CATGGACAAATTATACCCAGTGT-3 ‘e 5′-TCCAATTATGGTCAGGTAAAACAA3′, 86 pb; para a actina 5’-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3 ‘e 5′-GTTGAAGGTCTCAAACATGATC-3’, 209 pb.

pequeno ARN interferente Transfecção

células PC-3 e T24 /83 foram transfectadas com 50 nM pequeno ARN interferente (siRNA) contra TRPV2 (siTRPV2 sequência: 5′-UAAGAGUCAACCUCAACUAdT-3 ‘, sintetizado por Eurogentec). HiPerFect usando o reagente de transfecção (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante

Ensaio de Adesão celular

As células foram colhidas e semeadas a 3 * 10

4 e 1,5 * 10

4 células /poço para PC3 e T24 /83, respectivamente, em meio basal complementado ou não com AM (200 milhas náuticas) de fibronectina (10 ug /ml) pré-revestidas placas de 96 poços. Depois de 45min de incubação a 37 ° C, as células aderentes foram fixadas 15 minutos em banho de metanol e corados com Hoechst (5 mg /ml em PBS), fotos foram tiradas num microscópio Leica DMIRE2 (× 5) e as células contadas utilizando o NIH image software de análise (ImageJ).

migração e invasão celular Assay

A migração celular e invasão foi determinada por transpoço ensaio. Resumidamente, as células foram semeadas em cima da cultura de células Transwell insere com 8 um de tamanho de poro (Falcon) a uma densidade de 60.000 por poço para PC-3 e 30.000 para T24 /83 (formato de 24 poços) em meio de cultura isento de soro. Após 1 h, a molécula de interesse foi adicionado em ambos os lados do filtro Transwell. Para o ensaio de invasão, o compartimento superior foi revestido com 50 ug de Matrigel (BD Biosciences) para formar uma barreira de matriz. O compartimento inferior foi preenchida com o meio contendo 10% de FCS como quimioatractor. Depois de 8 h para o ensaio de migração e 24 h para a invasão, as células não migratórias foram removidos a partir do filtro de topo por raspagem, enquanto que as células que migraram através dos poros do filtro para a face inferior das inserções foram fixadas em 4% de paraformaldeído em PBS e corados com Hoechst (5 mg /ml em PBS) e contados utilizando um microscópio Leica DMIRB (× 200).

Ca

2 + Medidas usando Fura-2 AM

Antes medições de fluorescência, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em folhas de vidro. O meio foi substituído a cada 48 h. As células foram usadas 3 dias depois da tripsinização. O meio de cultura foi substituído por uma solução de HBSS contendo 142 mmol /L de NaCl, 5,6 mmol /L de KCl, 1 mmol /L de MgCl2, 2 mmol /L de CaCl2, 0,34 mmol /L de Na2HPO4, 0,44 mmol /L de KH2PO4; 10 mmol /L HEPES, e 5,6 mmol /L de glucose. A osmolaridade e o pH desta solução foi ajustado para 310 mOsm /L e 7,4, respectivamente. Corante de carga foi conseguida através da transferência das células para uma solução padrão de HBSS contendo 1 mmol /l de Fura-2 acetoximetil éster (Calbiochem) carregado (45 min) durante 40 min a 37 ° C. Subsequentemente, as células foram lavadas três vezes com a mesma solução sem corante. A lamela foi em seguida transferida para uma câmara de perfusão em um microscópio Olympus equipado IX70 para fluorescência. A fluorescência foi alternativamente animado a 340 e 380 nm com um monocromador e foi capturada após filtração através de um filtro passa longo (510 nm) por uma câmara CCD MicroMax 5 MHz (Princeton Instruments, Evry, France). Aquisição e análise foi realizada com o software Metafluor 7.7.4.0 (Universal Imagiologia Corp., West Chester, PA). A concentração de cálcio intracelular foi derivada a partir da razão das intensidades de fluorescência para cada um dos comprimentos de onda de excitação (F340 /F380) e a partir da equação de Grynkiewicz. As células foram continuamente perfundidas com solução de HBSS através de um sistema de perfusão de toda a câmara e os produtos químicos foram adicionados através do sistema de perfusão. A taxa de fluxo de toda a câmara de sistema de perfusão foi ajustada para 1 ml /min e o volume da câmara foi de 500 ul. Todas as gravações foram feitas a 37 ° C.

Biotinila�o e Western-blot

As experiências foram realizadas como descrito anteriormente [15]. Os anticorpos utilizados foram policlonal de coelho anti-VRL-1 (para TRPV2, 1/200, Santa Cruz), anti-FAK (1/500, Abcam), anti-FAK Y397 fósforo (1/1000, Abcam), beta anti-integrina 1 fosfo + T788 T789 (1/1000, Abcam), e beta anti-integrina 1 (1/200, Santa Cruz), e monoclonal de ratinho anti-beta-actina (1/2000, Sigma-Aldrich).

Análise de dados

Os resultados foram expressos como média ± sE. As parcelas foram produzidos usando Excel. Cada experiência foi repetida pelo menos 3 vezes. n indica o número de células por experiência. N indica o número de experiências realizadas. O teste de Turkey-Kramer foi usado para comparação estatística entre as médias e diferenças, e P . 0,05 foi considerado significativo

Resultados

adrenomedulina Aumenta PC-3 e T24 /83 celular adesão, migração e invasão

o primeiro verificada por RT-PCR da expressão de receptores de AM na próstata PC3 e linhas celulares de cancro urotelial e T24 /83. Como mostrado na Figura 1A, PC-3 expressa os dois receptores de AM, CLR /Ramp2 e CLR /RAMP3, enquanto T24 /83 expressa apenas CLR /RAMP3.

(A) RT-PCR experimento mostra Ramp2, RAMP3 e expressão CLR no PC-3 e células T24 /83. (B) PC-3 (painel da esquerda) e de células T24 /83 (painel da direita) a adesão foi examinada por sementeira 3 * 10

4 e 1,5 * 10

4 respectivamente células por poço em placas de 96 poços pré- revestidas com fibronectina e incubados durante 45 min com ou sem AM (200 nM) (n = 3, * P 0,05 em comparação com células de controlo). β1 fosforilação de integrina foi estudada por western-blotting em proteínas totais extraídas a partir de PC-3 e T24 /83 células semeadas em placas revestidas com fibronectina e tratadas com ou sem AM. (C) PC-3 e a migração de células T24 /83 foi estudada pelo ensaio Transwell após 8 h de tratamento (N = 3, * P 0,05 em comparação com células de controlo). FAK fosforilação foi estudada por western-blotting em proteínas totais extraídas a partir de PC-3 e T24 /83 células tratadas com ou sem AM. (D) Para o ensaio de invasão, Transwell membrana foi pré-revestido com 50 ug de Matrigel, e PC-3 e T24 /83 células foram deixadas a invadir durante 24 h (n = 3, * P 0,05 em comparação com células de controlo).

em seguida, investigou-se a adesão celular a uma componente importante da membrana basal, a fibronectina. A adição de 200 nM de AM aumentou tanto células T24 /83 PC-3 e por 26% e 34%, respectivamente (Fig. 1B). Um dos principais actores moleculares que modificam a adesão célula-substrato é a superfamília de receptores de integrina, que consistem em heterodímeros de subunidades de a- e p- reconhecendo diferentes proteínas da matriz extracelular (ECM). Curiosamente, β1-integrina é a subunidade mais abundante expressa em células APC e é capaz de formar heterodímeros de ligação à fibronectina [16], enquanto que o aumento da expressão da integrina β1-se correlaciona com cancro da bexiga mais invasivo e metastático [17]. A activação de β1-integrina leva a sua fosforilação, que podem ser examinados por transferência Western. Portanto, testou-se se poderia activar AM β1-integrina, estudando a sua fosforilação no Thr-788-789 com um anticorpo específico de fosfo. Observou-se que o tratamento AM aumentou significativamente o nível do β1-integrina fosforilada sem afectar a expressão da forma de proteína total (Fig 1B, painel inferior).

Modificação de adesão pode promover a migração e invasão:. Dois importante fenótipos associada a malignidade. Assim, examinou-se o efeito do tratamento em AM estes fenótipos através de ensaios Transwell. A adição de 200 nM de AM aumentou a migração de PC-3 em 45% e as células T24 /83 em 40% (Fig. 1C). Diversos estudos mostraram que, após acoplamento com componentes da ECM, as integrinas agrupado que conduz à activação da quinase de adesão focal (FAK), através da auto-fosforilação na Tyr397. A activação da FAK controla a forma da célula e motilidade [18]. Foram estudadas, assim, a actividade da FAK por-western blotting com um anticorpo específico contra fosfo-FAK Tyr397. Como mostrado na Fig. 1C (painel inferior), a FAK fosforilada foi significativamente aumentada pelo tratamento AM total de FAK enquanto o total de expressão de FAK manteve-se inalterada.

Além disso, estudou-se o efeito de AM na capacidade de invasão de células os dois linhas de Transwell de ensaio para o qual o filtro Transwell foi revestida com Matrigel. AM tratamento aumentou a capacidade de invasão de células através da membrana revestida por Matrigel 54% em células PC-3 e por 61% em células T24 /83 (Fig. 1D).

TRPV2 medeia adrenomedulina e promoção da migração invasão no PC-3 e T24 /83 Cells

Uma vez que, já anteriormente demonstrado que TRPV2 estava envolvida na migração de células CaP e invasão [12], [13] e uma vez que este canal também foi implicado na carcinogênese da bexiga [ ,,,0],14], testámos se TRPV2 está implicada no aumento da migração celular e invasão por AM. Em primeiro lugar temos verificado expressão TRPV2 nas duas linhas de células e a sua downrerulation por siRNA. análise de Western-blot com anticorpos específicos de TRPV2 mostrou que a proteína TRPV2 é expresso em PC3 e células T24 /83 e que a expressão da proteína pode ser eficazmente inibida por tratamento de células com ARNsi-TRPV2 (50 nM, 48 h, a Fig. 2A). O silenciamento de ARNsi com TRPV2-TRPV2 não só diminuiu a adesão de PC-3 e as células T24 /83 em 35% e 29% respectivamente, mas também aboliu os efeitos estimulantes sobre a adesão por tratamento AM (200 nM). AM além das células tratadas com ARNsi de controlo era capaz de aumentar a sua adesão à fibronectina de 29% para PC-3 e de 25% para 83 células /T24 (Fig. 2B).

(A) Ocidental-blotting análise do nível de proteína TRPV2 no PC-3 e T24 /83 células tratadas com siCTL ou siTRPV2 (50 nm, 48 h). Efeito de silenciamento TRPV2 (siTRPV2, 50 nM, 48 h) (B) em PC-3 e a adesão de células T24 /83 para fibroncectin incubados ou não com AM (200 nM, 45 min) (n = 3, * P 0,05 comparado com células de controlo;

# P 0,05 em comparação com células de controlo tratadas com AM); (C) em PC-3 e a migração de células T24 /83 examinada por Transwell ensaio após 8 h de incubação com ou sem AM (N = 3 *, P 0,05 em comparação com células de controlo;

# P 0,05 em comparação com células de controlo tratou-se com AM); (D) em PC-3 e a invasão de células T24 /83 a Matrigel (PM 200 nM, 24 h) (N = 3. *, P 0,05 em comparação com células de controlo;

# P 0,05 em comparação com células de controlo tratadas com AM).

a seguir, investigou o efeito da batida para baixo de TRPV2 sobre a migração celular por transpoço ensaio. Regulação negativa da expressão TRPV2 diminuída não só a migração de células PC-3, mas também T24 /83, de 55% e 60%, respectivamente. Como foi mostrado para a adesão, o tratamento AM em células tratadas com siRNA-TRPV2 não era mais capaz de promover a migração (Fig. 2C).

Finalmente, examinamos a invasão de células PC-3 e T24 /83 através da membrana de Matrigel-revestido e, como observado para a adesão e migração, siARN-TRPV2 induziu uma diminuição de ambas PC-3 e T24 /83 invasão, por 52% e 67%. A adição de AM não poderia aumentar a invasão de 83 células PC-3 e T24 /tratados por siTRPV2 (Fig. 2D).

AM Induz translocação TRPV2 na membrana plasmática através de uma via PI3K

Tendo em vista o envolvimento TRPV2 em vigor AM sobre a migração celular, o próximo examinado por imagem de cálcio se AM poderia ativar TRPV2. aplicação aguda da AM para PC-3 e T24 /83 não causou elevação de Ca intracelular

2 + concentração ([Ca

2 +]

i) em uma escala de tempo curta (ou seja, dentro de minutos ), como seria de esperar de Ca reforçada TRPV2 mediada

2 + entrada (dados não mostrados). No entanto, prolongado de 45 min tratamento longo das duas linhas de células com AM induziu um aumento do basal [Ca

2+] I Nível (PC-3: a partir do valor de 100 nM a 140 nM, na presença de AM de controlo; T24 /83:139 nM a 200 nM; Fig. 3A). O silenciamento de TRPV2 por siRNA (50 nM, 48 h) reduziu a basal [Ca

2 +]

i (PC-3: a 70 nM; T24 /83: a 86 nM), sugerindo que steady-state mediada por TRPV2 Ca

2 + fluxo contribui para o descanso Ca citosólico

2 + concentração. Além disso, TRPV2 silenciamento também preveniu o aumento da basal [Ca

2 +]

I, em resposta ao tratamento PM (Fig. 3A), consistente com a noção de que a incubação prolongada de PC-3 e as células T24 /83 faz com que a ativação indireta de TRPV2 por AM através de via de sinalização que requer algum tempo para produzir os seus efeitos.

(a) O efeito do AM (200 nM, 45 min) e silenciamento TRPV2 (siTRPV2, 50 nM, 48 h ) em cálcio citosólico basal de PC-3 e T24-83 células foi estudada por imagem de cálcio. (N = 120 células, n = 4, *, P 0,05 em comparação com células de controlo;

# P 0,05 em comparação com células de controlo tratadas com AM). (B) presença TRPV2 na membrana plasmática foi examinada por biotinilação em células T24 /83 controlar ou seja tratada com AM (200 nM, 45 minutos) ou AM e inibidor de PI3K LY294.002 (10