Abstract
Fundo
Extratos brutos de
Selaginella
tamariscina
, uma erva medicinal oriental, têm sido evidenciados no tratamento de várias doenças humanas. Este estudo investigou os mecanismos pelos quais
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tamariscina
inibe a capacidade de invasão do carcinoma de células escamosas oral humana células (CEB) HSC-3.
Metodologia /Principais Conclusões
Aqui, nós demonstramos que
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tamariscina
atenuada migração de células HSC-3 e invasão de uma forma dependente da dose. As actividades anti-metastáticos de
Selaginella
tamariscina
ocorreu pelo menos parcialmente por causa da infra-regulação de metaloproteinases de matriz (MMP) -2 e MMP-9 actividade gelatinase e a regulação da a expressão da proteína. A expressão e função tanto de MMP-2 e MMP-9 foram regulados pelo
Selaginella
tamariscina
a um nível de transcrição, como mostrado pelas quantitativo em tempo real, PCR e ensaios de repórter. imunoprecipitação da cromatina (ChIP) dados indicaram ainda que a ligação da proteína (CREB) resposta cAMP de ligação ao elemento e proteína activadora-1 (AP-1) para o promotor de MMP-2 diminuída ao nível mais elevado de dosagem de
Selaginella
tamariscina
. A actividade de ligação de ADN de proteína especificidade 1 (SP-1) para o promotor de MMP-9 também foi suprimida na mesma concentração.
Selaginella
tamariscina
não afectou a MAP quinase via de sinalização, mas inibiu os efeitos da gelatinase por redução da activação de serina-treonina-quinase Akt.
conclusões
Estes resultados demonstram que
Selaginella
tamariscina
pode ser um agente terapêutico adjuvante potente na prevenção de câncer bucal
Citation:. Yang JS, Lin CW, Hsin CH, Hsieh MJ, Chang YC (2013)
Selaginella
tamariscina
Atenua Metástase via Akt Pathways em células de cancro oral. PLoS ONE 8 (6): e68035. doi: 10.1371 /journal.pone.0068035
editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan
Recebido: 12 Abril 2013; Aceito: 23 de maio de 2013; Publicação: 14 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa de investigação do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC100-2632-B-040-001-MY3). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
cabeça e pescoço o carcinoma de células escamosas para cerca de 3% de todos os cânceres nos Estados Unidos, e carcinoma de células escamosas oral (CCEO) é a forma mais comum de câncer de cabeça e pescoço [1]. A alta taxa de metástase para linfonodos cervicais faz com que a taxa de sobrevivência pobres de câncer oral [2]. As células cancerosas normalmente distribuídos através da secreção de várias moléculas que degradam a matriz extracelular (ECM), invadir os vasos sanguíneos, e a migração para órgãos distantes [3]. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são um grupo importante de enzimas que regulam a composição da ECM durante o desenvolvimento normal e respostas patológicas [4]. Embora várias MMPs contribuir para a metástase de células de cancro, as gelatinases MMP-2 e MMP-9 foram mais intensamente estudado [5]. MMP-2, também conhecida como gelatinase A, é uma proteína de 72 kDa expressa na maioria dos tecidos e células [6]. Em contraste, a MMP-9 (gelatinase B), uma proteína de 92 kDa, condicionalmente é observada nos leucócitos [7]. Cima MMP-2 e MMP-9 de expressão têm sido observados em casos invasivas e metastáticas de cancro oral humana [8-10]. Daí, os esforços se concentraram foram feitos para desenvolver inibidores de MMPs (MMPIs) para travar a propagação das células cancerosas [11].
Selaginella
tamariscina
é uma erva usada tradicionalmente na medicina oriental que apresenta várias capacidades terapêuticas. Em primeiro lugar, porque
Selaginialla tamariscina
foi mostrado para reduzir o açúcar no sangue e os níveis de peróxidos de lípidos no soro, que apresenta potenciais utilizações no tratamento da diabetes [12,13]. Em segundo lugar, bioflavonóides isolado do
Selaginella
tamariscina
efeitos antibacterianos e antifúngicos demonstradas [14-16]. Em terceiro lugar, extratos brutos de
Selaginella
tamariscina
ter inibido a proliferação celular mesangial humana, e diminuíram a interleucina-1 beta e fator de necrose tumoral produção do fator-alfa [17]. Em quarto lugar,
Selaginella
tamariscina
poderia ser um potencial agente quimiopreventivo contra várias linhas de células humanas de câncer, como câncer gástrico [18], o cancro do pulmão [19], o cancro da mama [20], e câncer cervical [21]. O objetivo deste estudo foi elucidar os efeitos do
Selaginella
tamariscina
em células HSC-3 CEs humanos. Nossos resultados mostraram que
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interrompido a migração de células do câncer bucal através do down-regulação da MMP-2 e MMP-9 expressão e por diminuir a atividade de ligação do ADN ao promotor elementos. Além disso, os efeitos anti-metastáticos foram associados com a inativação de serina-treonina quinase Akt.
Materiais e Métodos
Extrato de
Selaginella
tamariscina
Selaginella
tamariscina
foi comprado em lojas de ervas e plantas inteiras secas (100 g) foram extraídos duas vezes com 500 ml de etanol a 50% em água destilada. Os extractos combinados foram filtrados e concentrados a 70 ° C utilizando um evaporador rotativo a baixa pressão. O extracto em bruto concentrado foi congelado a -80 ° C durante 2-3 dias e, em seguida, foi em um liofilizador e armazenado a -20 ° C, liofilizado. O rendimento de extracção foi de 2,8% (w /w) e o perfil de química Selaginella tamariscina extrair (STE) foi analisada utilizando cromatogramas líquidos de alta pressão (HPLC) -Massa espectrómetro [19]. Resumidamente,
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foram analisados por espectrômetro de HPLC em massa usando um HPLC (Hitachi L-6200 com um detector de díodos L-4500) com uma massa PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF espectrômetro. Amostras (10 ul) foram injectados numa Merck LiChrospher 100 RP-18 de coluna (4 x 250 mm). A coluna foi equilibrada em 0,05% de ácido acético /água (solução A) e a eluição dos componentes foi conseguido aumentando a concentração da solução de B (acetonitrilo a 100%) de 0 a 100% em 30 min com um caudal de 1 ml /min. A absorvância foi monitorizada a 254 nm. As massas moleculares dos picos foram determinadas a partir de espectros de massa de ionização por electropulverização de iões utilizando perfil multiplamente carregada [19]. O extracto foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma Co., EUA) e foi preparada em diferentes concentrações para as experiências subsequentes.
Cultura de células e
Selaginella
tamariscina
extracto (STE) tratamento
HSC-3, uma linha de células da língua humana carcinoma epidermóide obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA), foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Life Technologies, Grand Island, NY , EUA), 10% de soro fetal de bovino (Hyclone Laboratories, Logan, UT, EUA), glutamina 2 mM, 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Todas as culturas de células foram mantidas a 37
° C em uma atmosfera humidificada de 5% de CO
2. Para o tratamento STE, quantidades apropriadas de uma solução de estoque de STE foram adicionados a meio de cultura para atingir as concentrações indicadas e, em seguida, incubadas com as células por períodos de tempo indicados, considerando que a solução dimetilsulfóxido sem STE foi usado como branco de reagente.
Determinação da viabilidade das células (MTT),
para o experimento de viabilidade celular, uma microcultura de tetrazólio (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) ensaio colorimétrico foi realizado para determinar a citotoxicidade do STE. células HSC-3 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10
4 células /cavidade e tratados com STE, a uma concentração entre 0-100 ng /ml a 37
oC durante 24 h. Após o período de exposição, o meio foi removido, e as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois incubados com 20 ul de MTT (5 mg /mL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) durante 4 h. O número de células viáveis por placa é directamente proporcional à produção de formazano, o qual pode ser medida espectrofotometricamente a 563 nm a seguir solubilizao com isopropanol.
in vitro fecho da ferida
HSC-3 células (1 × 10
5 células /poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços, durante 24 h, feridos por raspagem com uma ponta de pipeta, em seguida, incubadas com meio DMEM contendo FBS a 0,5% e tratadas com ou sem STE (0, 25, 50 , 75 e 100 ug /mL) durante 0, 12 e 24 h. As células foram fotografadas usando um microscópio de contraste de fase (x 100). Os ensaios de
migração celular e invasão
A migração celular e invasão foram ensaiadas de acordo com os métodos descritos por Yang et ai. [19]. Depois de um tratamento com STE (0, 25, 50, 70 e 100 ug /mL) durante 24 h, as células sobreviventes foram colhidas e semeadas a Boyden câmara (Neuro Probe, Cabin John, MD, EUA) em 10
4 células /poço em meio isento de soro e depois incubadas durante 24 horas a 37
oC. Para o ensaio de invasão, 10 mL de Matrigel (25 mg /50 ml; BD Biosciences, MA, EUA) foi aplicada a 8 filtros de membrana de policarbonato de tamanho de poro e a câmara de fundo continha meio padrão. Os filtros foram então secos ao ar durante 5 h numa câmara de fluxo laminar. As células invadidas foram fixadas com metanol 100% e coradas com Giemsa 5%. Os números de células foram contadas sob um microscópio de luz. O ensaio de migração foi realizada como descrito no ensaio de invasão sem o revestimento de Matrigel.
Determinação da MMP-2 e MMP-9 por zimografia de gelatina
As actividades de MMP-2 em condicional médio foram medidos por ensaios de zimografia de protease. Resumidamente, meios recolhidos de um volume adequado (ajustado pelo número de células vitais) foram preparadas com tampão de amostra de SDS, sem ebulição ou de redução e submetido a 0,1% de gelatina e 8% de electroforese SDS-PAGE. Após a electroforese, os géis foram lavados com 2,5% de Triton X-100 e então incubadas em tampão de reacção (Tris-HCl a 40, pH 8,0; CaCl 10 mM
2 e 0,01% de NaN3) durante 12 h a 37
oC . Então gel foi corado com azul brilhante de Coomassie R-250.
Preparação de lisados de células totais
Para a preparação total de lisados de células, as células foram lavadas duas vezes com PBS e raspadas com 0,2 ml de tampão RIPA frio contendo inibidores da protease cocktail, e depois centrifugadas a 4
oC durante 10 min. Os lisados celulares foram submetidos a uma centrifugação de 10.000 rpm durante 10 min a 4
° C e o sedimento insolúvel foi rejeitado. A concentração de proteína de lisados de células totais foi determinada pelo ensaio de Bradford.
Western blot análise
Os 20 ^ g de amostras de lisados de células totais ou fracções nucleares foram separadas por SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 10% e transferidos para uma membrana de nitrocelulose usando o sistema de electroforese Mini-Tetra-Protean como descrito anteriormente [22]. A membrana foi subsequentemente incubada com 5% de leite não gordo em solução salina tamponada com Tris (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, pH 7,6) durante 1 h para bloquear a ligação não específica e em seguida durante a noite com anticorpos policlonais contra a MMP-2, MMP -9, TIMP-1, TIMP-2, três MAPK (ERK 1/2, 1/2 JNK e p38), ou Akt com os anticorpos específicos para as formas fosforiladas de não fosforilados ou o correspondente 1/2 ERK, JNK 1/2 , p38 e Akt. As manchas foram então incubadas com um anti-coelho de peroxidase de rábano de cabra ou IgG anti-ratinho durante 1 h. Em seguida, o sinal foi detectado utilizando quimioluminescência aumentada (ECL) estojo comercial (Amersham Biosciences) e densidade fotográfico relativa foi quantificada por varrimento dos negativos fotográficos num sistema de documentação de gel e análise (AlphaImager 2000, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, EUA ).
preparação de RNA e quantitativa TaqMan-PCR em tempo real
o ARN total foi isolado a partir de células de cancro oral utilizando Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY) de acordo com as instruções do fabricante. A análise de PCR quantitativa em tempo real foi realizado utilizando um Taqman-passo de PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng de cDNA total foram adicionados por cada 25 uL de reacção com MMP-2, MMP-9 ou iniciadores GAPDH e sondas Taqman. Os iniciadores GAPDH MMP-2, MMP-9 e e sondas foram concebidos utilizando o software comercial (ABI PRISM Sequence Detection System; Applied Biosystems). Os ensaios de PCR quantitativa em tempo real foram efectuadas em triplicado em um sistema de detecção de sequência StepOnePlus. O limiar foi fixado acima do fundo do controlo não-molde e no interior da fase linear da amplificação do gene alvo para calcular o número do ciclo em que foi detectado o transcrito.
A transfecção e MMP-2, MMP-9 promotor-driven Os ensaios de luciferase
3-HSC células foram semeadas a uma concentração de 5 x 10
4 culas por po em placas de cultura celular de 6 poços. Após 24 h de incubação, pGL3-basic (vector), MMP-2 ou MMP-9 plasmídeo promotor foram co-transfectadas com um vector de expressão β-galactosidase (pCH110) nas células utilizando Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Após 12 horas da transfecção, as células foram tratadas com o veículo ou STE (0 ou 100 ug /ml) durante 24 h. Os lisados celulares foram colhidas e a actividade de luciferase foi determinada utilizando um kit de ensaio de luciferase. O valor da actividade de luciferase foi normalizada para a eficiência de transfecção e expressão monitorizada por β-galactosidase.
análise de imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
análise de imunoprecipitação da cromatina foi realizada como descrito anteriormente [23,24] . ADN imunoprecipitado com anti-CREB, anti-SP1 ou anti c-fos foi purificado e extraído utilizando fenol-clorofórmio. ADN imunoprecipitado foi analisado por PCR ou PCR quantitativa, utilizando iniciadores específicos, tal como descrito anteriormente [23].
A análise estatística
Para todas as medições, utilizou-se análise de variância seguida de comparação posteriori Scheffe para avaliar as diferenças entre o controlo e as células tratadas com várias concentrações de STE. A diferença em p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo e as experiências foram repetidas três vezes.
Resultados
Efeitos da
Selaginella
tamariscina
no HSC-3 viabilidade celular e motilidade
3-HSC a viabilidade das células na presença de várias concentrações (0-100 ug /mL) de
Selaginella
tamariscina
durante 24 horas é mostrada na Figura 1A . Mesmo a concentração mais elevada, de 100 ug /mL, não têm um efeito citotóxico sobre as células HSC-3. Usamos 0-100 ug /ml de
Selaginella
tamariscina
para conduzir os seguintes experimentos. A Figura 1B mostra os resultados de usar um ensaio de ferida-zero para calcular a capacidade de migração de HSC-3 células tratadas com várias concentrações de
Selaginella
tamariscina
. Os resultados demonstram que
Selaginella
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significativamente reduzida motilidade celular tanto tempo e dose-dependente (P 0,001). (Figura 1B e 1C)
(A) células HSC-3 foram tratados com STE (0, 25, 50, 75 e 100 ug /mL) durante 24 h antes de ser submetido a um ensaio de MTT para a viabilidade celular. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. (B) As células HSC-3 foram feridos e, em seguida, tratados com o veículo (DMSO) ou STE (0, 25, 50, 75 e 100 ug /mL) durante 0h, 12h e 24 h em 10% de meio contendo FBS. Em 0, 12 e 24 h, foram tomadas de contraste de fase fotos das feridas em três locais diferentes.
Efeitos da
Selaginella
tamariscina
sobre migração e invasão de células HSC-3
para examinar os efeitos do
Selaginella
tamariscina
sobre a migração e invasão celular, foi utilizado um ensaio de câmara de Boyden para detectar a motilidade celular. mostra a Figura 2A que
Selaginella
tamariscina
migração inibiu significativamente de uma forma dependente da concentração por 24 horas. Da mesma forma, a Figura 2B indica que a capacidade de invasão de células HSC-3 também foi reduzida após incubação com diferentes concentrações (0-100 ug /mL) de
Selaginella
tamariscina
durante 24 horas.
(A) A migração celular e (B) a invasão de células foram medidos utilizando uma câmara de Boyden de 16 h e 24 h, com filtros de policarbonato, respectivamente. As capacidades de migração e invasão de células HSC-3 foram quantificadas por contagem do número de células que invadiram ao lado de baixo do policarbonato poroso como descrito no
secção Materiais e Métodos
. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05 em comparação com o grupo de veículo.
Efeitos da
Selaginella
tamariscina
sobre a atividade e expressão da enzima MMP-2 e MMP-9 proteína
a capacidade de
Selaginella
tamariscina
para suprimir as habilidades migratórias e invasivos de células HSC-3, diminuindo MMP-2 e MMP-9 expressão foi avaliada utilizando zimografia. A Figura 3A mostra que a actividade enzimática da MMP-2 e MMP-9 foi suprimido pela
Selaginella
tamariscina
de um modo dependente da concentração. A concentração mais elevada de
Selaginella
tamariscina
, 100 ug /mL, inibiu a actividade de MMP-2 e MMP-9 em 57% e 51%, respectivamente (Figura 3B).
Selaginella
tamariscina
também substancialmente reduzida expressão da proteína MMP-2 e MMP-9, quando detectado utilizando western blot (Figura 3C). Assim, sugerimos que a capacidade anti-metastático de
Selaginella
tamariscina
pelo menos parcialmente inibida MMP-2 e MMP-9 expressão. Investigação dos efeitos de STE sobre a expressão da proteína do inibidor de MMPs endógena, TIMP-1 e TIMP-2, mostrou que STE induzida TIMP-1 e TIMP-2 sobre-regulação de uma forma dependente da concentração (Figura 3C e 3D)
(a e B) células HSC-3 foram tratados com STE (0-100 ug /mL) durante 24 h e, em seguida, submetida a zimografia de gelatina para analisar a actividade da MMP-2 e MMP-9, respectivamente. (C), as células SH-3 foram tratados com STE (0-100 ug /mL) durante 24 h e, em seguida, submetida a Western blotting para analisar os níveis de proteína de MMP-2, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2. (D) Os resultados quantitativos de MMP-2, MMP-9, os níveis de TIMP-1 e TIMP-2 de proteínas que foram ajustadas com nível de proteína β-actina. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05 em comparação com o grupo de veículo.
Efeitos da
Selaginella
tamariscina
na MMP-2 e MMP-9 expressão do mRNA e da actividade de ligação de DNA
Os efeitos do
Selaginella
tamariscina
na MMP-2 e MMP-9 expressão de mRNA foram também examinados. Observou-se um baixo nível de MMP-2 e MMP-9 de expressão de ARNm na dose mais elevada de
Selaginella
tamariscina
(100 ug /ml) durante 6 horas (Figura 4A e 4B). Para investigar mais como
Selaginella
tamariscina
regula a atividade transcricional de MMP-2 e MMP-9, foi realizado um ensaio de repórter luciferase em que ambos
Selaginella
as células de controlo tamariscina
e foram transfectadas com uma construção de promotor de MMP-2 e MMP-9. A Figura 4C mostra que a actividade do promotor de MMP-2 foi reduzida em
Selaginella
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de uma forma dependente da dose. Do mesmo modo, cerca de 50% de inibição da MMP-9, a actividade promotora era evidente a 100 ug /ml de
Selaginella
tamariscina
(Figura 4D). Estas observações sugerem que
Selaginella
tamariscina
regula a atividade MMP-2 e MMP-9 ao nível da transcrição.
HSC-3 células foram tratadas com STE ( 0, 25, 50, 75 e 100 ug /mL) durante 24 h e depois sujeito a quanti-PCR em tempo real para analisar a expressão de ARNm de MMP-2 (a), ou MMP-9 (B). (C) a MMP-2 ou (D) Ensaio de repórter de MMP-9 promotor para analisar a actividade do promotor de MMPs. A actividade de luciferase, determinada em triplicado, foi normalizada para a actividade de p-galactosidase. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05 quando comparado com o grupo de veículo.
Estudos anteriores demonstraram que os promotores MMPs é regulada por vários factores de transcrição, tais como AP-1, NFkB, CREB e SP-1 [23,25,26]. Foi realizada uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio para avaliar o envolvimento de fatores de transcrição nos efeitos inibidores de
Selaginella
tamariscina
na MMP-2 e MMP-9 atividade (Figura 5A e 5B) . ensaio ChIP e quantitativa PCR em tempo real mostrou que
Selaginella
tamariscina
substancialmente suprimida a ligação do CREB e SP-1 ao promotor MMP-2 (Figura 5A). Figura 5B indica que
Selaginella
tamariscina
consideravelmente inibido AP-1, mas não o NF-kB de ADN de ligação ao promotor de MMP-9. Estes resultados indicam que
Selaginella
tamariscina
inibiu a expressão de MMP-2 e MMP-9, regulando a atividade de ligação de fatores de transcrição no cis-elemento de promotores de MMP.
células HSC-3 foram tratados com STE 100 ug /ml durante 24 h e, em seguida, a fracção nuclear foi preparado tal como descrito em “
Materiais e Métodos
“. ChIP análise da associação de vários factores de transcrição, com a MMP-2 (A) ou MMP-9 (B) a região do promotor em células HSC-3. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05 em comparação com o grupo de veículo.
Efeitos da
Selaginella
tamariscina
em MAPK e Akt percursos
Para investigar mais os mecanismos subjacentes do montante vias de MMP-2 e MMP-9 sinalização, usamos western blot para avaliar os efeitos do
Selaginella
tamariscina
nas vias MAPK e Akt. A Figura 6A-6C mostram que a via da MAPK, que inclui ERK, JNK, p38 e proteína-quinases, não foi significativamente inibida. No entanto,
Selaginella
tamariscina
reduzida fosforilação da Akt de um modo dependente da dose (Figura 6D). Assim, sugerimos que é necessária a ativação da via de sinalização Akt para
Selaginella
tamariscina
para suprimir MMP-2 e MMP-9.
HSC- 3 as células foram cultivadas em diferentes concentrações de STE (0, 25, 50, 75 e 100 ug /mL) durante 24 horas, e, em seguida os lisados celulares foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por manchas de western com (a) anti-ERK1 /2, (B) anti-JNK, (C) anti-p38 e (D) de anticorpos anti-Akt (total e fosforilada) como descrito em Materiais e Métodos. actividades determinadas destas proteínas foram subsequentemente quantificados por densitometria análises com o de controlo como sendo 100% como mostrado abaixo apenas os dados de gel. Os valores representavam as médias ± DP de pelo menos 3 experiências independentes. * P 0,05 em comparação com o grupo de veículo
Discussão
Várias plantas medicinais têm sido estudados para aplicações anti-cancerígenos, tais como
Dioscorea
nipponica
Makino [23. ] e
Terminalia
catappa [26]. Durante a última década,
Selaginella
tamariscina
tornou-se um tratamento tradicional para várias doenças [14,15,18,19]. Neste estudo, sugerimos que
Selaginella
tamariscina
apresenta efeitos benéficos sobre o tratamento com células câncer bucal por (1) inibindo-3 HSC migração de células de câncer oral e invasão, (2) redução MMP actividade expressão e enzima 2 e MMP-9 do gene, (3) inibição da fosforilação de AKT, (4) diminuir a translocação nuclear de CREB e SP-1 a um promotor de MMP-2, e (5) diminuir a translocação nuclear de AP-1 aos um promotor de MMP-9. Numerosos flavonóides são encontrados nos extratos brutos de
Selaginella
tamariscina
que apresentam diversos efeitos farmacológicos. Amentoflavona marcadamente preso ciclos celulares e induziu apoptose de mama humano e células cancerosas cervicais [21,27,28]. Além disso, sumaflavone exercida efeitos anti-inflamatórios, bloqueando a expressão de iNOS por meio de inibição de AP-1 [29]. Além disso, Mirzoeva et ai mostraram que a apigenina apresenta potencial antiangiogénico em células de carcinoma da próstata pela inibição Smad2 /3 Src e /FAK /Akt vias [30]. Os estudos anteriores sugeriram que os flavonóides desempenham um papel fundamental nos efeitos anti-metastáticos de
Selaginella
tamariscina
, mas os mecanismos subjacentes a este processo requer mais explicações.
metástases, que é responsável por aproximadamente 90% das mortes por cancro, é o processo pelo qual as células cancerosas se propagam a partir do local do tumor original para órgãos distantes [31]. A degradação dos componentes da matriz extracelular e da membrana basal é um passo crítico na metástase. Existem vários tipos de proteases que controlam a degradação de ECM e de remodelação. MMP-2 e MMP-9 são os mais extensivamente estudados da família MMP devido à sua elevada associação com a migração e invasão do cancro [5]. Vários estudos anteriores indicaram que os produtos naturais inibem a metástase de cancros através da inibição de MMP-2 e MMP-9 de expressão [23,26]. Os nossos resultados indicam que o
Selaginella
tamariscina
inibiu a actividade da enzima MMP-2 e MMP-9, bem como a expressão da proteína. Uma diminuição na capacidade de migração e invasão resultantes da supressão de MMP-2 e actividade de MMP-9 foi sugerido. Os resultados são semelhantes ao nosso estudo anterior, em que os efeitos anti-metastáticos de
Selaginella
tamariscina
no pulmão células cancerosas ocorreu através da expressão gelatinase reduzida [19]. Vários relatórios indicam que a expressão do gene MMP foi especificamente regulada por quinases ativadas por mitógeno proteína (MAPKs), uma família de serina /treonina incluindo ERK, JNK e p38 [31-33]. No entanto, nossos resultados indicam que não há efeitos observáveis sobre a via de sinalização MAPK resultou da regulação da produção de MMP por
Selaginella
tamariscina
. Além disso, o envolvimento da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /sinal de AKT via de transdução de MMP expressão gênica e migração celular foi estudada adequadamente. Wang et ai revelaram que isoliquiritigenina inibiu a expressão e a actividade gelatinolítica da MMP-2 e MMP-9, regulando a AKT a montante vias em células de cancro da mama MDA-MB-231 [34] sinalização. Outro estudo concluiu que a berberina, um alcalóide isoquinolina, a metástase de células do cancro da mama inibida através da modulação da Akt [35]. Nossos dados também sugerem que a via de sinalização PI3K /AKT está envolvido como um gatilho a montante da MMP-2 e MMP-9 regulamentação.
A expressão de MMPs pode ser regulado em vários níveis, incluindo a transcrição, pós-transcrição , os níveis de tradução, proenzima-ativação e repressão, por inibidores específicos [36]. Sugere-se que
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regulada MMP-2 e MMP-9, ao nível da transcrição, porque a actividade do promotor e a expressão de ARNm foram inibidas. promotores de MMP tem vários elementos cis que pode ser transactivado por vários factores de transcrição, como o NF-kB, AP-1, CREB e SP-1. Estudos anteriores indicaram que o AKT /SP-1 via regulada a actividade do promotor de MMP-2 e afectou a capacidade de migração de células cancerosas [24,37]. Satpathy et al mostraram que o tecido de transglutaminase modulam a activação da CREB 2 e MMP-2 a transcrição de cancro do ovário [38]. A sequência promotora a montante do gene de MMP-9 contém sítios AP-1 e NF-kB. Galato de epigalocatequina (EGCG) exerce o seu efeito anti-invasivo pela supressão da activação de AP-1 em células de cancro gástrico humano [39]. Além disso, a NF-kB regula a expressão de MMP-9 em vários cancros [33,40,41]. Apesar de MMP-9 expressão de mRNA foi regulamentada pelo
Selaginella
tamariscina
, não observamos um efeito notável sobre as atividades NF-kB DNA-vinculativas. Nosso estudo demonstra que a MMP-2 foi regulada por CREB e SP-1 actividades de ligação a DNA quando afectados por
Selaginella
tamariscina
e AP-1 local foram necessários para a inibição da MMP -9 expressão.
Os resultados deste estudo mostram que
Selaginella
tamariscina
reduzida migração câncer bucal e da invasão por inibir MMP-2 e MMP-9 expressão do gene, e actividade da enzima. Estes efeitos anti-tumorais em CEB estão associados com a supressão da AKT e a repressão da actividade de ligação de ADN em MMP-2 e MMP-9 promotores. CCEO invasão e metástase são um grande obstáculo para o tratamento do câncer. Portanto, a inibição de metástase pela
Selaginella
tamariscina
poderia fornecer benefícios preventivos e terapêuticos vitais para o tratamento de câncer oral.